Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Метилирование ДНК 12
1.1.1. Количество и распределение динуклеотидов CpG в геноме 14
1.1.2. Профили метилирования 16
1.1.3. Ферменты метилирования 18
1.1.4. Метилирование генома как динамический процесс 19
1.1.5. Влияние метилирования ДНК на структуру хроматина 21
1.1.6. Методы анализа метилирования ДНК 26
1.2. Молекулярно-генетические механизмы канцерогенеза 31
1.2.1. Гены, вовлечённые в канцерогенез 33
1.2.2. Гены-супрессоры опухолевого роста 34
1.2.3. Гены, регулирующие клеточный цикл 38
1.2.4. Метилирование генов, вовлеченных в канцерогенез 42
1.2.5. Метилирование ДНК, как характеристика опухолевого процесса 51
Глава 2. Материалы и методы 57
2.1. Клинический материал , 57
2.2. Заборкровии операционного материала 58
2.3. Выделение геномной ДНК 58
2.4. Рестрикционный анализ , 59
2.5. Метил-чувствительная ПЦР (МЧ-ПЦР) 59
2.6. Обработка ДНК бисульфитом натрия 62
2.7. Метил-специфическая ПЦР (МС-ПЦР) 63
2.8. Электрофорез в ПААГ 64
2.9. Ультратонкое окрашивание нитратом серебра. 64
2.10. Определение нуклеотидной последовательности 64
2.11. Программное обеспечение 65
2.12 Статистическая обработка данных 65
Глава 3. Результаты и их обсуждение 66
3.1. Метилирование исследуемых генов в нормальных тканях 66
3.2. Сравнение метилирования исследуемых генов в различных типах опухолей 69
3.3. Аномальное деметилирование гена IGF2 при разных типах опухолей 76
3.4. Характеристика гипотетического «метилотипа» при НМРЛ, РМЖ, ретинобластоме и ОЛ 80
3.5. Исследование аномального метилирования локуса INK4a/ARF на примере CpG-островков, расположенных в промоторных областях генов р16 и pl4/ARF. 86
3.6. Исследование ассоциации метилирования промоторных областей изучаемых генов-супрессоров опухолевого роста с клиническими параметрами опухолей (НМРЛ, ретинобластомы и ОЛ) 95
3.6.1. Ассоциации метилирования с клинико-патологическими характеристиками образцов НМРЛ 96
3.6.2. Ассоциации метилирования с клинико-патологическими характеристиками образцов ОЛ 99
3.6.3. Ассоциации метилирования с клинико-патологическими характеристиками образцов ретинобластомы 101
3.6.4. Ассоциации метилирования с клинико-патологическими характеристиками образцов Рмж 102
Заключение 104
Выводы 106
Список литературы 107
- Влияние метилирования ДНК на структуру хроматина
- Метилирование ДНК, как характеристика опухолевого процесса
- Определение нуклеотидной последовательности
- Ассоциации метилирования с клинико-патологическими характеристиками образцов ОЛ
Введение к работе
Идентификация генетических факторов, ассоциированных с канцерогенезом, является одной из наиболее острых проблем современной молекулярной онкологии. На разных этапах канцерогенеза происходят различные варианты инактивации генов, участвующих в регуляции клеточного цикла. Инактивация генов-су прес соров может происходить в результате структурных повреждений, которые представлены делениями или точковыми мутациями, а также в результате функциональных аномалий, которые связывают с гиперметилированием регуляторных областей гена (Costello et al, 2001). Процесс злокачественной трансформации клетки является многоступенчатым, в нем участвует большое количество генов, поэтому исследование молекулярной патологии генов, регулирующих рост и дифференцировку клеток, представляет особый интерес, как для науки, так и для практики. С теоретической стороны, такие исследования способствуют изучению фундаментальных механизмов патогенеза опухолей, пониманию законов функционирования генома опухолевой клетки, а с практической стороны - позволяют осуществлять поиск новых молекулярных маркеров для ранней диагностики, прогноза и мониторинга заболевания.
В норме метилирование ДНК играет важную роль в таких биологических процессах
как, регуляция экспрессии тканеспецифических генов, клеточная дифференцировка,
геномный импритинг, инактивация X хромосомы, регуляция структуры хроматина,
репликация ДНК, латентный период у вирусов, старение. При злокачественной
трансформации наблюдается нарушение в равновесии
метилирования/деметилирования, что выражается в глобальном деметилировании
генома опухолевой клетки и локальном гиперметилировании CpG-островков,
локализованных в промоторных областях генов-супрессоров. В результате
деметилирования генома происходит активация онкогенов и ростовых факторов, что приводит к их гиперэкспрессии, в то время как гены с супрессорными функциями в результате гиперметилирования CpG-островков, расположенных в промоторных районах, подвергаются инактивации. Подобная инактивация генов может происходить на разных стадиях развития опухоли (Costello et al, 2001).
В последнее время, большая роль в возникновении злокачественных
новообразований отводится нарушению эпигенетической регуляции активности генов.
Доказано, что потеря экспрессии генов-супрессоров опухолевого роста в результате
аномального гиперметшшрования CpG-островков, расположенных в промоторных
областях, является одним из самых ранних событий, происходящих в злокачественной
клетке, что позволяет использовать аномальное метилирование этих генов, в качестве
раннего маркера злокачественного процесса (Belinsky et al, 2000).
Гиперметилирование генов, непосредственно участвующих в регуляции клеточного цикла, таких как RBI, pI6/CDKN2a, p!5/CDKN2b, pl4/ARF наблюдается при различных типах опухолей (Esteller et al., 2001)., Но существуют гены, чья инактивация характерна для конкретного типа опухоли, что делает возможным связывать их с возникновением, развитием и характером прогрессии определенной опухоли (CDHJ, ER, CALCA).
Исследования в области молекулярной онкологии, направленные на выявление генов, эпигенетические изменения которых могут сопровождать опухолевую трансформацию клеток или являются её причиной, имеют своей конечной целью решение проблемы ранней диагностики и прогнозирования течения онкологического заболевания.
Целью настоящей работы является характеристика аномального метилирования CpG-островков ряда генов, вовлеченных в регуляцию клеточного цикла и канцерогенез в образцах опухолей, имеющих различное тканевое происхождение.
Задачи исследования.
Разработать эффективные методики определения метилирования промоторных районов исследуемых генов-супрессоров опухолевого роста на основе метилчувствительной и метилспецифической ПЦР, провести их сравнительный анализ.
Охарактеризовать метилирование промоторных районов генов RBI, pI6/CDKN2a, pl5/CDKN2b, pH/ARF, CDH1, ER, CALCA, RB1CC1, MGMT, HICl и N33 при немелкоклеточном раке легкого (НМРЛ), раке молочной железы (РМЖ), ретинобластоме и острых лейкозах (ОЛ).
Определить характер метилирования CG-динуклеотидов CpG-островков, расположенных в промоторных и регуляторных областях генов pN/ARF и p!6/CDKN2a, покуса р J 6/ARF.
Выявить возможные ассоциации между метилированием CpG-островков конкретных генов, интенсивностью метилирования всей панели из 10 исследуемых генов (RBI, pl6/CDKN2a, р 15/CDKN2b, р 14/ARF, CDH1.ER, CALCA. MGMT, HIC1, N33) и клинико-морфологическими характеристиками изучаемых опухолевых образцов.
Охарактеризовать частоту потери импринтинга в результате деметилирования промотори ой области гена IGF2 в исследуемых типах опухолей.
Научная новизна.
В результате проведенного исследования изучено аномальное метилирование генов, вовлеченных в регуляцию клеточного цикла и канцерогенез: RBI, pl6/CDKN2a, p!5/CDKN2b. pH/ARF, CDH1, ER, CALCA, RB1CC1. MGMT, HIC1, N33 и IGF2 при РМЖ, НМРЛ, ретинобластоме и ОЛ. Показано, что в разных типах опухолей характер метилирования исследуемых генов различен. В образцах ОЛ выявлена наименьшая интенсивность метилирования панели исследуемых генов по сравнению с другими изучаемыми типами опухолей (Р<0.05). Показано, что при НМРЛ, РМЖ и ретинобластоме уровень метилирования генов pl4t CDH1 и НІС І достоверно выше, чем при ОЛ (Р<0.05). Гены CALCA и р16 достоверно чаще метилированы при НМРЛ и РМЖ, чем при ОЛ (Р=0.006). В образцах НМРЛ частота метилирования гена N33 статистически достоверно выше, чем в остальных типах опухолей (Р=0,01). Гены, характеризующиеся повышенной частотой метилирования в опухоли определенного типа, дополнили гипотетический «метилотип» для НМРЛ, РМЖ, ретинобластомы и ОЛ, составленный на основе данных литературы. Показано, что в лимфоцитах периферической крови здоровых доноров аномальное метилирование изучаемых генов практически отсутствует.
Исследован характер метилирования генов p!6/CDKN2a и pN/ARF в локусе 9р21. Впервые показано, что CpG-островки, расположенные в промоторных и регуляторных
областях этих генов, имеют различный характер метилирования. Используя МЧ-ПЦР, МС-ПЦР и МС-секвенирование, определена большая чувствительность метода МЧ-ПЦР, по сравнению с МС-ПЦР.
Изучены возможные ассоциации между интенсивностью метилирования используемой панели генов и клинико- морфологическими параметрами опухоли при НМРЛ, ретинобластоме и ОЛ. Не обнаружено ассоциации метилирования исследуемых генов с такими клиническими параметрами заболевания, как возраст, пол, количество бластных клеток в периферической крови больных и осложнениями заболевания (рецидив, смерть) при ОЛ. Не было выявлено достоверных различий метилирования исследуемых генов в группах больных с односторонней и двухсторонней формами РБ. Не определено достоверных различий метилирования исследуемых генов в морфологически различных типах НМРЛ. Впервые показано, что гены RB1 и ріб достоверно чаще метилированы в опухолях без выраженного метастатического процесса (Р=О.О036 и РЮ.ОП, соответственно) при НМРЛ. Впервые выявлена ассоциация метилирования геиарЫ с наличием метастатического процесса (Р=0.02) в том же типе опухоли. Установлено, что интенсивность метилирования панели изучаемых генов, которую отражает ИМ, коррелируют с наличием метастатического процесса (Р—0.021) и размерами опухоли при НМРЛ (Р=0.028).
Практическая значимость.
Исследовано 90 образцов острых лейкозов, 54 образцов немелкоклеточного рака легкого, 60 образцов ретинобластомы, 85 образцов рака молочной железы в целях определения метилирования промоторных районов 11 генов.
Разработаны методики мультилокусной метилчувствительной ПЦР для оценки метилирования промоторных областей каждого из исследуемых генов. Проведен сравнительный анализ методов МЧ-ПЦР и МС-ПЦР, и показана большая чувствительносить метода МЧ-ПЦР. Выявлено, что потеря импринтинга гена IGF2 может являться молекулярным маркером опухолевого процесса при НМРЛ, РМЖ, ретинобластоме и ОЛ.
Результаты, полученные в представленной работе, могут быть использованы для
разработки системы молекулярно-генетических маркеров, характеризующих исследуемые типы опухолей.
Апробация работы.
Материалы исследования докладывались на ежегодных конференциях Европейского общества генетиков в 2002-2003 гг., на международных конференциях «Геном человека» в 2001-2002 гг., на конференции ГНТП «Геном человека» в 2001 г., на Всероссийсих научно-практических конференциях по генетике человека и межлабораторных семинарах МГНЦ РАМН. По результатам исследования опубликовано 6 статей и 9 тезисов.
Положения выносимые на защиту.
Гены, вовлеченные в канцерогенез, по-разному метилированы в разных типах опухолей (РМЖ, НМРЛ, ОЛ и ретинобластоме).
GpC-островки, расположенные в промоторной области и районе перового экзона генов pi 6 ир]4 могут иметь различный характер метилирования.
Потеря импринтинга ростового фактора IGF2 в результате деметилирования его промоторной области является молекулярным маркером опухоли при РМЖ, НМРЛ, ОЛ и ретинобластомы.
Метилирование генов, вовлеченных в канцерогенез, может быть ассоциировано с некоторыми клинико-морфологическими параметрами опухоли.
Влияние метилирования ДНК на структуру хроматина
Хроматин существует в двух основных состояниях. Эухроматин деконденсирован, содержит основную массу активно экспрессирующихся генов, реплицируется в начале S- фазы клеточного цикла. Гетерохроматин конденсирован, неактивен, содержит незначительное количество генов, представлен в основном повторяющимися последовательностями, в том числе псевдогенами, и реплицируется в конце S-фазы. Факторами, в значительной степени определяющими структуру и функции хроматина, являются модификации его компонентов - ацетилирование гистонов приводит к деконденсации и активации, а метилирование ДНК ведет, напротив, к конденсации и инактивации (Tasi et al., 1990). Таким образом, характерными чертами активного хроматина являются гиперацетилирование гистонов и отсутствие 5-метилцитозина, а неактивного - гиперметилирование цитозина и деацетилирование гистопов.
Реализация эффектов метилирования происходит через процесс ингибирования транскрипции клеточных генов и может быть объяснена следующими механизмами.
Во-первых, метальные группы могут напрямую препятствовать связыванию транскрипционных факторов (например, таких, как АР-2, E2F, c-Myc/Myn, ATF/CREB-подобные белки, цАМФ-зависимый активатор и NF-kB) с их сайтами узнавания цАМФ-зависимыми элементами. Другой возможный механизм реализуется через связывание специфических репрессоров транскрипции (метилспецифических белков MeCPl и МеСР2) с метилированной ДНК (рис.2).
Идентифицировано несколько белков - репрессоров транскрипции, которые связываются с метилированными CpG-динуклеотидами в ДНК, наиболее известны MeCPl и МеСР2. В клетке МеСР2 присутствует в большем количестве, чем MeCPl, и этот белок (МеСР2) способен связаться с ДНК, содержащей единичный метилированный CpG-динуклеотид (Meehan et al., 1992). МеСР2 содержит два домена — один, связывающийся с метил-CpG, и второй, обеспечивающий его функцию репрессора транскрипции. Пространственная разобщенность доменов объясняет способность МеСР2 оказывать репрессорное воздействие на расстоянии от места связывания. Кроме того, кооперативное взаимодействие между молекулами МеСР2 обеспечивает распространение участка связывания МеСР2 за пределы сайта метилированных CpG в результате присоединения все новых молекул. В итоге возникают стерические препятствия к взаимодействию конденсированного хроматина с аппаратом транскрипции. МеСР2 через ко-репрессор взаимодействует с гистоновыми деацетилазами HDAC1 и HDAC2 (Luo et al., 1998), что приводит к их активации, удалению ацетильных групп из лизиновых остатков коровых белков, входящих в состав нуклеосом. Таким образом, освобождаются положительно заряженные лизиновые остатки, что дает возможность их взаимодействию с ДНК и, в свою очередь, приводит к ограничению нуклеосомной подвижности, способствующей компактизации хроматина (Ngetal., 1999).
Ацетилирование остатков лизина в N-концевых районах гистонов Н2А, Н2В, НЗ и Н4 нейтрализует их положительный заряд и, соответственно, блокирует ассоциацию с витками нуклеосомной ДНК. Это, в свою очередь, декомпактизует структуру как самой нуклеосомы, так и хроматина в целом и, кроме того, освобождает внешнюю поверхность витков ДНК для взаимодействий с регуляторными факторами (Jones et al., 1999).
Степень ацетилирования гистонов определяется активностью двух типов ферментов - гистонацетилтрансфераз (HAT) и деацетилаз (HDAC). Ряд активаторов транскрипции, таких как СВР/рЗОО, участвующий в регуляции клеточного роста, дифференцировки, репарации ДНК и апоптоза, а также некоторые субъединицы базального аппарата транскрипции (TAF250) обладают гистонацетилтрансферазной активностью. Напротив, репрессоры транскрипции, такие, как Mad и ядерные рецепторы, ассоциированы с деацетилазной активностью (Archer et ah, 1999).
Ингибирующий эффект метилирования опосредован через деацетилирование гистонов и обусловленную им компактизацию хроматина {Ng et al., 1999). Так, трихостатин А, специфический ингибитор HDAC, способен обращать действие метилирования применительно к блокированным рибосомным генам, при этом не влияя на степень их метилирования. Непосредственный механизм деацетилирования гистонов заключается в том, что МеСР2, связанный с метилированными основаниями, привлекает корепрессорный комплекс mSin3A/HDAC, который и осуществляет деацетилирование гистонов. В результате гистоны приобретают положительный заряд и, соответственно, способность прочно взаимодействовать с витками нуклеосомной ДНК. Нуклеосомы компактизуются и теряют способность взаимодействовать с факторами транскрипции (рис.2). Комплексы транскрипционных факторов с белками, имеющими гистонацетилазную активность способны снимать репрессирующее действие метилирования (Spenser et al., 1997).
Недавние исследования показали непосредственную роль продукта гена RB1 в деацетилировании белков (Archer et al., 1995; Bremh et al., 1999), соответственно конденсации и инактивации хроматина. Во время G] фазы клеточного цикла RB1 может напрямую взаимодействовать с деацетилазами гистонов HDAC1 и HDAC2. При этом образуется тройной комплекс, состоящий из RB1, фактора транскрипции (например, E2F) и активной деацетилазы (рис.З).
Метилирование ДНК, как характеристика опухолевого процесса
Распределение 5 -метилцитозина в геномной ДНК, полученной из разных тканей, похоже на пеструю картину, и существует несколько подходов анализа этого распределения, В то время как общее содержание метилированной ДНК может играть существенную роль в канцерогенезе, определение характера и изменений метилирования всей геномной ДНК представляется довольно проблематичным, и не может служить в качестве молекулярного маркера. Напротив, анализ метилирования отдельных CpG-динуклеотидов, расположенных в регулирующих последовательностях генов и, возможно, влияющих на связывание факторов транскрипции с ДНК, может быть использован как маркер изменения экспрессии гена. Используя метод МС-ПЦР или МЧ-ПЦР, можно определить состояние метилирование одного или нескольких CpG-динуклеотидов определенного гена.
До недавнего времени большинство авторов исследовали метилирование одного гена в определеном типе опухоли. В то же время, большинство опухолей не является моногенными, и, следовательно, анализ метилирования одного гена не может дать полной картины патологического процесса. Поэтому определение профиля метилирования, включаещего в себе несколько генов, может быть более полезным для характеристики опухоли и течения заболевания.
Профиль метилирования определенного типа опухоли может быть сконструирован по результатам анализа отдельных CpG-nap и/или картирования 5 -метилцитозинов при помощи МС-секвенирования генов, вовлеченных в канцерогенез.
В настоящий момент ведется активное изучение профиля метилирования различных генов в разных типах опухолей. Так Garcia-Manero исследовал профиль метилирования генов MDR1, THBS2, MYF3, ER, р15, THBS1, CD 10, C-ABL и р16 при остром лимфобластном лейкозе (Garcia-Manero et al., 2002). При остром миелобластном лейкозе определено метилирование генов MDR1, THBS1, CACNA1G, р15, р!6, MINT}, MINT2 и РТС1 (Toyota et a 1,, 2 001). Разные авторы изучали профиль метилирования генов MGMT, ріб, АРС, CDH13, RARft, FH1T, RASSF1A, ТШР-3, DARK, CDH1, ER, CALCA, р\4 и GSTP при раке легкого (S. Zochbauer-Muller et al., 2002; Toyooka et al., 2001; Virmani et al., 2002). Панель генов, состоящая из ріб, 14-3-Зет, ERa,PR, RARJ3, BRCA1, GSTP, CDH1 и TIMP-3 была исследована в образцах рака молочной железы (Yang et al., 2001; Widschwendter et al., 2002). Rathi с сотр. выявил метилирование генов RASSF1A, HIC1, АРС я CDH1 в образцах рака яичника (Rathi et al., 2002). Профиль метилирования генов р!6, TIMP-3, CDH1, DARK, MGMT, hMLHl и CACNA1G определен при аденокарциноме поджелудочной железы (Ueki et al., 2000). В образцах назофарингеальной карциномы изучен профиль метилирования генов RASSF1A, DARK, р!4,р15, ріб, RAR/3, MGMT и GSTP (Kwong et al., 2002). При этом степь метилирования этих генов в различных типах опухолей варьировалась от 0% до 100%.
Изучая профиль метилирования определенных генов на парных образцах, норма-опухоль, можно определить молекулярные маркеры для данного типа опухоли и в дальнейшем использовать их для ранней диагностики и прогноза риска развития заболевания. Например, инактивация гена р!6 так часто регистрируется в опухолях различного происхождения, что возникло представление о нем, как о гене-супрессоре, наиболее часто повреждаемом при канцерогенезе, и его можно использовать как маркер онкологического процесса. Уже показано, что обнаружение этого маркера в мокроте может свидетельствовать о возникновении рака легких задолго до клинических проявлений (Palmissanoet а 1., 2000). Также можно изучать профиль метилирования в образцах опухолей, взятых на разных стадиях заболевания, а также в образцах метастазов. Это позволит определить маркеры, опираясь на которые можно строить предположение о течении и прогнозе заболевания. Например, уровень метилирования гена HIC1 очень высок в различных типах опухолей. Показано, что отсутствие метилирования этого гена служит маркером благоприятного прогноза при РМЖ (Nicoll et al., 2001). В последнее время ведется активный поиск маркеров, позволяющих предсказывать реакцию на химиотерапию. Довольно обширная работа была проведена Esteller и соавт. по изучению метилирования CpG-островка гена MGMT при глиомах и В-клеточных лимфомах на фоне химиотерапии. Было обнаружено, что метилирование этого гена связано с увеличением выживаемости у пациентов с глиомой, которые принимали кармустин (Esteller et al., 2000), и у пациентов с диффузной В-клеточной лимфомой, которые лечились циклофосфамидом (Esteller et al, 2002).
Вариантом профиля метилирования может служить так называемый "метилотип" опухоли, "Метилотип" включает в себя гены с повышенной частотой метилирования при определенном типе опухоли. На сегодняшний день определение метилотипа различных опухолей еще не закончено. Идентификация генов с высокой частотой метилирования в опухолях определенного типа является необходимым шагом в характеристике опухоли.
Toyota ввел понятие метилированный фенотип - СГМР (CpG island methylator phenotype). Эта величина определялась по метилированию семи новых клонированных CpG-островков, которые метилируются исключительно в опухолях. Фенотип CIMP+ (положительный) считался в случае метилирования более трех CpG-островков, CIMP-I (intermediate) - двух островков, если в исследуемом образце было метилировано менее двух CpG-островков, то такой фенотип определяли как СЇЇМР-. Toyota и соавт. определяли СГМР в образцах колоректального рака, в этих же образцах они исследовали метилирование генов р16 и hMLHl и обнаружили связь метилирования этих генов с СГМР. Так метилирование р16 было выявлено в 16 из 23 (70%) СГМР+ опухолей, в 1 из 12 (8%) СГМР-І и в 1 из 21 (5%) СГМР-. Метилирование hMLHl определялось в трех из пяти образцах опухоли, в которых была выявлена микросателитная нестабильность, при этом все три образца были CIMP+ (Toyota et al., 2001). Chan с сотр. опеределяли СГМР в образцах опухоли поджелудочной железы. Но в отличие от Toyota, они исследовали метилирование CpG-островков, находящихся внутри уже известных генов, таких как: рІ4, ріб, СОХ2, MGMT, ER, THBS1, RAR/3, CACNA1G и MEN1, а так же в локусах MINTJ, MINT2, MINT25, MINT27 и MINT31 (Chan et al., 2003). Наличие гиперметилированного фенотипа так же показано для рака предстательной железы, мочевого пузыря (Liang et al., 1998) и молочной железы (Huang et al., 1999). Делаются попытки соотнести CIMP с клинико-патологическими данными. . Lee и сотр., изучая метилирование генов при внутрипеченочной холангиотсарценоме, показали статистически достоверную ассоциацию CIMP с гистологическим типом опухоли (Lee et al., 2002). Toyota и сотр. обнаружили связь CIMP с локализацией колоректального рака (дистальный или проксимальный отделы толстой кишки). Так же было показана ассоциация CIMP с предраковым состоянием: из 15 образцов аденоматозных полипов семь были CIMP-h На основании полученных данных Toyota и сотр. пришли к выводу, что СГМР является ранним событием при развитии колоректального рака (Toyota et al., 1999).
Определение нуклеотидной последовательности
Наибольшая частота метилирования показана для генов HICI (от 11% при ОЛ до 81% при НМРЛ), и для CDHI - 14% при ОЛ и 74 % при НМРЛ. Это согласуется с результатами, полученными другими исследователями. По данным литературы метилирование гена HICI выявляется в 50-100% в различных типах опухолей. Issa и сотр. показали метилирование этого гена в 53% при остром лимфобластном лейкозе (ОЛЛ) и в 50% случаев хронического миелобластного лейкоза (ХМЛ). Кроме того, в образцах ОЛЛ в стадии рецидива и при бластном кризе ХМЛ гиперметилирование гена HICI было выявлено в 100% (Issa et al., 1997). Virmani и сотр. показали метилирование гена HICI в 98% случаев НМРЛ и в 100% МРЛ, а гена CDHI в 28% и 21%, соответственно (Virmani et al., 2002). Droufakou и сотр. выявили метилирование промоторной области гена CDHI в 71% случаев РМЖ (Droufakou et al„ 2001). Так же метилирование CpG-островка гена CDHI выявлено в 50% смешанной выборки РМЖ (Graff et al., 1995; Hiraguri et al., 1998). Такая высокая частота метилирования этих генов делает их реальными кандидатами для использования в качестве раннего маркера злокачественного процесса.
Ген RB1 имеет примерно одинаковую частоту метилирования во всех исследованных нами типах опухолей, и даже в ОСК был выявлен достаточно высокий уровень метилирования - 17%. Хотя ген изучается дольше, чем все другие гены-су прессоры, данные по его аномальному метилированию при канцерогенезе достаточно противоречивы. Virmani и сотр., определяя профиль метилирования для МРЛ и НМРЛ, не выявили случаев метилирования RBI (Virmani et al„ 2002), хотя по результатам других авторов, ген часто инактивируется таким образом при раке легких (Weintraub et al., 1996). Ye и сотр. изучали метилирование и экспрессию этого гена при раке легкого. Метилирование наблюдалось в 28,3% случаев I и II стадии РЛ, причем чаще выявлялось в образцах МРЛ (88,2%), тогда как экспрессия была снижена во всех образцах (Ye et al., 2000). При Т-клеточных лимфомах и ОМЛ метилирование промоторной области гена обнаружено не было, хотя отмечено снижение его экспрессии (Hofmann et al., 2001, Melki et al., 1999). В нашем исследовании наибольшая частота метилирования показана для спорадической ретинобластомы -25%. Полученный результат можно объяснить тем, что ретинобластома является моногенной опухолью и метилирование промоторной области гена RBI в этом случае может являться причиной развития данного заболевания,
Частота метилирования гена ріб в исследованных образцах была различна, от 6% при ОЛ до 43% при НМРЛ; при РМЖ и РБ частота метилирования составляла 24% и 15%, соответственно. Метилирование является основным механизмом инактивации гена/ б, и выявляется в различных типах опухолей. Так, при РМЖ метилирование CpG-островка этого гена выявлено в 15-30% (Esteller et al., 2001; Herman et al., 1995). Метилирование было выявлено в 41% плоскоклеточного РЛ и в 22% аденокарциномы (Kim et al., 2001), а также в 25% случаев НМРЛ (Zochbauer-Muller et al., 2001). В то же время метилирование этого гена, по нашим результатам, не является частым событием при ОЛ, что согласуется с исследованиями других авторов (Iravani et al., 1997; Herman et al., 1997). В работах Esteller и сотр. метилирование гена ріб обнаружено в 1% случаев лейкозов (Esteller et al., 2001). Garsia-Manero и сорт, продемонстрировали, что в образцах ОЛЛ взрослых ген метилирован в 1,3% (Garsia-Manero et al., 2002). Частота метилирования гена р16 значительно возрастает, если исследования проводятся в образцах костного мозга. Toyota и сотр. при исследовании образцов костного мозга больных острого миелобластного лейкоза (ОМЛ), выявили аномальное метилирование гена в 16% случаев, a Melki и сотр. в 30% ОМЛ (Toyota et al., 2001; Melki et al., 1999). Наше исследование проводилось на лимфоцитах периферической крови, поэтому частота метилирования промоторной области гена ріб невысока, всего 6%.
Несмотря на то, что уровень метилирования генов RBJ и р16 по отдельности в каждом типе опухоли относительно высокий, совместное метилирование этих генов выявляется не часто. Так, совместное метилирование р16 и RB1 в образцах НМРЛ показано в восьми случаях (14%), в образцах РБ - три случая (5%). В образцах ОЛ и РМЖ совместное метилирование этих генов выявлено в двух и одном образце, соответственно.
Частота метилирования гена pl4/ARF близка к частоте метилирования гена ріб, максимальное значение в 35% было выявлено в образцах НМРЛ, минимапьное - 2%, обнаружено при ОЛ. Частоты, полученные нами для ОЛ близки к результатам других авторов (5%), и значительно различаются для солидных опухолей (Esteller ct al., 2001). Более высокий уровень метилирования renap!4/ARF при НМРЛ, РМЖ и РБ, вероятно, можно объяснить тем, что в нашей работе проводилось исследование метилирования промотори ой области гена, а не 1 экзона, как в исследованиях других авторов (Zochbauer-Muller et al., 2001; Virmani et al., 2002).
В проведенной работе выявлено незначительное метилирование гена р15 (0-4%), причем для всех исследованных типов опухолей. До недавнего времени считалось, что метилирование гена pi 5 нехарактерно для солидных опухолей, но в последних работах отмечено, что метилирование этого гена при НМРЛ составляет 13%, а при МРЛ - 19% (Virmani et al., 2002).
В то же время, по данным разных авторов показано, что в опухолях системы кроветворения, инактиватия этого гена в результате метилирования, является частым событием. Метилирование rcwa.pl5 было определенно в 64% и 44% В-клеточных и Т-клеточных лимфом, соответственно (Baur et al., 1999), Melki и сотр. изучали метилирование этого гена в ОМЛ разными методами и продемонстрировали его в 50-80% случаев. Garsia-Manero и сотр. выявили метилирование р!5 в образцах костного мозга больных ОЛЛ в стадии ремиссии в 11,3% и в стадии рецидива в 60% (Garsia-Manero et al., 2002). В работах Ivy и сотр. метилирование гена р!5 показано в 58% образцах острого лейкоза, куда вошли ОЛЛ, ОМЛ и острый лейкоз смешанного типа (Ivy et al,, 2000). В работе Aggerholm и сотр. метилирование р15 выявлено в 71% образце ОМЛ (Aggerholm et al., 1999). Такую большую разницу в уровне метилирования этого гена, между результатами нашего исследования и данными других авторов, вероятно, можно объяснить различиями в методологии определения метилирования, разными выборками пациентов, а так же используемым материалом, в котором изучается профиль метилирования. Наше исследование проводилось на ДНК из периферической крови больных с ОЛ, тогда как другие работы велись па образцах костного мозга или в культурах опухолевых тканей.
Ассоциации метилирования с клинико-патологическими характеристиками образцов ОЛ
Мы проанализировали возможные ассоциации метилирования исследуемых генов-супрессоров при ОЛ с такими клиническими параметрами заболевания, как возраст, пол, количество бластных клеток в периферической крови больных и осложнениями заболевания (рецедив, смерть). Нам не удалось выявить какой-либо ассоциации этих параметров с частотой метилирования исследуемых генов. Анализируя ОЛ, мы разделили всех больных по группам: В-ОЛЛ - 61 образец, Т-ОЛЛ - 8 образцов и 13 образцов ОМЛ, и провели анализ ассоциаций частот метилирования исследуемых нами генов и типов ОЛ. Нам не удалось выявить подобных ассоциаций, так как изучаемые гены были одинаково метилированы в различных типа ОЛ. Нами обнаружено, что частота метилирования не связана с количеством бластных клеток в периферической крови больных. Выявлено четыре случая из 69 (5%), в которых количество бластных клеток в кровотоке составляло 78-90%, при этом ни один ген в этих образцах не был метилирован. Напротив, у пяти больных (7%) с количеством бластных клеток в кровотоке 0-3% наблюдалось метилирование хотя бы одного гена.
Как и для НМРЛ, для каждого типа ОЛ мы подсчитали средний ИМ панели исследуемых нами генов в каждой группе пациентов и сравнили его по критерию Мана-Уитни. При сравнении средних ИМ в группах ОМЛ и ОЛЛ показана тенденция к увеличению числа метилированных генов в образцах ОЛЛ, хотя достоверных различий не выявлено. Мы сравнивали средние ИМ для Т-ОЛЛ и В-ОЛЛ и не выявили достоверных различий в уровне метилирования нашей панели генов для этих групп. (табл.14).
Подобные исследования для ОЛ проводились и другими авторами. В работах Garsia-Manero и сотр. было показано, что уровень метилирования ряда генов (ER , р16, р15) в образцах больных ОЛЛ в период ремиссии, значительно ниже, чем в образцах больных ОЛЛ в стадии рецедива (Garsia-Manero et al., 2002). В работе других авторов было показано, что уровень метилирования гена р}5 в подгруппе М1/М2 ОМЛ по FAB классификации, которая отражает различия в гистологии ОМЛ, достоверно выше, чем в подгруппе МЗ/М4, что свидетельствует об инактивации этого гена на ранних стадиях данного заболевания (Aggerholm et al., 1999). Issa и сотр. выявили высокий уровень метилирования гена ШС1 в образцах ОЛЛ в стадии рецидива и при бластном кризе ХМЛ (Issa et al., 1997). На основании своих результатов Issa и сотр. пришли к выводу, что метилирование гена HIC1 происходит во время прогрессии заболевания (Issa et a 1., 1997). Roman и сотр. изучали связь между метилированием гена CALCA при ОЛЛ у взрослых и детей и клинко-патологическими параметрами опухоли, а также исходом заболевания. Было показано, что гиперметилирование этого гена ассоциировано с высоким риском развития рецидива и высокой смертностью (Roman et al., 2001).
Мы проанализировали метилирование исследуемых генов в группах больных с односторонней (43 образца) и двухсторонней (17 образцов) формами РБ. При сравнении частоты метилирования исследуемых генов в этих двух группах РБ при помощи критерия Фишера, нами не было выявлено достоверных различий. Для каждой группы был определен средний ИМ, который составил 0.15 и 0.18, соответственно. При сравнении ИМ по критерию Мана-Уитни достоверных различий в степени метилирования между односторонней формой РБ и двухсторонней не выявлено.
Так как, образцы ретинобластомы достаточно сложно получить, вследствие того, что лечение этой опухоли направлено на сохранение глаза и происходит обычно посредством химиотерапии, работ посвященных изучению профиля метилирования разных генов-супрессоров в этой опухоли очень мало, Существующие работы, в основном, исследуют метилирование какого-то одного гена в опухоли, обычно RB1, как этиологического фактора. Kwong и сотр., при исследовании метилирования и экспрессии гена MGMT при ретинобластоме, обнаружили его метилирование в 35% образцах, причем во всех образцах наблюдалось снижение или отсутствие экспрессии гена. Эти исследователи показали, что метилирование промотора чаще выявляется в образцах с низкой дифференцировкой опухолевых клеток, а также у больных с двухсторонней формой РБ (Kwong et al., 2002).
Мы не располагали информацией о клинико-патологических характеристиках РМЖ, поэтому не смогли проанализировать связь метилирования исследуемых генов с клиническими параметрами опухоли. Однако, другими авторами такие исследования проводились. Nass и сотр. изучали метилирование CpG-островка гена CDHI при РМЖ на различных стадиях заболевания: протоковая карциномы молочной железы in situ (DCIS), инвазивный (ГОС) и метастазирующий РМЖ (MDC). В этой работе было статистически достоверно показано, что уровень метилирования гена CDHI значительно выше в образцах метастазирующего РМЖ. При изучении гена ER при РМЖ эти же авторы обнаружили, что уровень метилирования гена ER. так же как CDHI, статистически достоверно выше в образцах РМЖ с метастазами, чем в опухолях in situ (Nass et al., 2000). Nicoll и сотр. изучая повреждение HIC1 при РМЖ, выявили, что снижение его экспрессии связано с метилирование CpG-островка. При чем, все больные с сохраненной экспрессией этого гена имели безрецедивную выживаемость более восьми лет. То есть, наличие экспрессии HICI связано с благоприятным прогнозом при РМЖ (Nicoll et al., 2001).
