Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Геномный полиморфизм и эволюционная изменчивость природных популяций аденовирусов серотипов 3 и 7 в процессе их эпидемической циркуляции в СССР Головина Галина Игоревна

Геномный полиморфизм и эволюционная изменчивость природных популяций аденовирусов серотипов 3 и 7 в процессе их эпидемической циркуляции в СССР
<
Геномный полиморфизм и эволюционная изменчивость природных популяций аденовирусов серотипов 3 и 7 в процессе их эпидемической циркуляции в СССР Геномный полиморфизм и эволюционная изменчивость природных популяций аденовирусов серотипов 3 и 7 в процессе их эпидемической циркуляции в СССР Геномный полиморфизм и эволюционная изменчивость природных популяций аденовирусов серотипов 3 и 7 в процессе их эпидемической циркуляции в СССР Геномный полиморфизм и эволюционная изменчивость природных популяций аденовирусов серотипов 3 и 7 в процессе их эпидемической циркуляции в СССР Геномный полиморфизм и эволюционная изменчивость природных популяций аденовирусов серотипов 3 и 7 в процессе их эпидемической циркуляции в СССР Геномный полиморфизм и эволюционная изменчивость природных популяций аденовирусов серотипов 3 и 7 в процессе их эпидемической циркуляции в СССР Геномный полиморфизм и эволюционная изменчивость природных популяций аденовирусов серотипов 3 и 7 в процессе их эпидемической циркуляции в СССР Геномный полиморфизм и эволюционная изменчивость природных популяций аденовирусов серотипов 3 и 7 в процессе их эпидемической циркуляции в СССР Геномный полиморфизм и эволюционная изменчивость природных популяций аденовирусов серотипов 3 и 7 в процессе их эпидемической циркуляции в СССР
>

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Головина Галина Игоревна. Геномный полиморфизм и эволюционная изменчивость природных популяций аденовирусов серотипов 3 и 7 в процессе их эпидемической циркуляции в СССР : Дис. ... на соиск. учен. степ. канд. биол. наук : 03.00.06 Л., 1991 218 с. РГБ ОД, 61:05-3/905

Содержание к диссертации

Список сокращении, .принятых в диссертации . 5

ВВЕДЕНИЕ 6

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 14

1. Биология аденовирусов 14

1.1. Физико-химические свойства вирионов 14

1.2. Классификация аденовирусов человека 15

1.3. Особенности репликации и сборки.аденовирусов . 18

1.4. Рекомбинации аденовирусов 20

2. Молекулярная эпидемиология аденовирусных инфекций, 23

2.1. Методы молекулярной эпидемиологии 23

2.2. Ресгрикционный анализ в плане изучения геномной гетерогенности аденовирусов 28

2.3. Молекулярная эпидемиология аденовирусных инфекций,.обусловленных.аденовирусами.серотипа 3 34

2.4. Молекулярная эпидемиология аденовирусных инфекций, обусловленных.аденовирусами о еро типа 7. 42

3. Эволюция геномов аденовирусов 51

Заключение 55

ЭКСЖРШЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

4. Материалы и методы 57

4.1. Штаммы аденовирусов серотипов 3 и 7,.использо-ванные в работе 57

4.2. Инфекционная активность и эффективность ре

продукции вируса в клетках тканевых культур 62

4.3. Антигенная характеристика изолягов аденовирусов . 63

4.4. Активность интерференции аденовирусов с вирусом везикулярного стоматита на тканевых культурах .

4.5. Накопление и очистка аденовирусов... 64

4.6. Выделение вирусной ДНК 68

4.7. Обработка ДНК эндонуклеазами рестрикции . 69

4.8. Электрофорез в агарозном геле 69

4.9. Мечение рестрикционных фрагментов ДНК . 70

4.10. Электрофорез в полиакриламидном геле 73

5. Геномный полиморфизм популяции аденовирусов серотипа 3, выделенных на.территории Советского.Союза.с 1976 по 1988 гг 74

5.1. Анализ генотипов аденовирусов серогипа 3, циркулировавших на территории СССР, с помощью крупно-щепящих ферментов рестрикции 44

5.2. Анализ генотипической гетерогенности популяции аденовирусов серотипа 3 с помощью мелкощепящей рестрикїазн. Ст 131 86

Заключение 104

6. Геномный полиморфизм популяции аденовирусов серотипа 7, выделенных на территории. Советского Союза *07

6.1. Анализ генотипов аденовирусов серотипа 7, циркулировавших на территории СССР, с помощью круп-нощепящих ферментов рестрикции 107

6.2. Анализ генотипической гетерогенности популяции аденовирусов серотипа 7с.помощью.мелкощепящей рестриктазы Cfr 131

7. Коррелятивная взаимосвязь медду феногипическими и ге-

нотипическими профилями циркулирующих штаммов адено-вирусов серотипов Зи7 138

7.1. Биологические свойства аденовирусов.серотипов . 3 и 7 с разными генотипами 138

7.2. Биологическая совместимость аденовирусов серотипов 3 и 7 с разными генотипами *58

Заключение 167

8. Обсуждение результатов 170

ВЫВОДЫ 193

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ igg 

Введение к работе

Актуальность проблемы. Аденовирусы серо типов 3 и 7 относятся к группе эпидемически актуальных вирусов. По данным Всесоюзного Центра по гриппу и OPS, в период с 1976 по 1988 гг. они составляли соответственно 25% и 11$ от . 2005 аденовирусных изолягов, выделенных на территории Советского Союза. Аденовирусы серотипов 3 и 7 часто этиологически связаны с развитием эпидемических вспышек ОРЗ, особенно среди детей младшего возраста. Они играют ведущую роль в генезе ОРЗ, пневмоний, конъюнктивитов, энтеритов, фарингоконъюнкти-вальной лихорадки и нередко в генезе осложнений - менингитов и энцефалитов.

Вместе с тем до настоящего времени основным методом идентификации и сравнительного изучения аденовирусных изолягов являлся вирусологический анализ, включающий в себя нейтрализующие тесты и реакции торможения гемагглюгинации. В последние годы стало быстро развиваться новое направление исследований, основанное на принципах молекулярной эпидемиологии, внедрение которого в практику этиологического надзора за острыми респираторными вирусными инфекциями в ряде стран мира дало возможность существенно унифицировать и повысить качество идентификации вирусных антигенов и нуклеиновых кислот. В частности, применение методов молекулярной гибридизации ДНК, рестрикци-онного анализа ДНК и моноклональных антител в сочетании с высокочувствительными иммунохимическими методами позволяет выявлять и изучать уровни природной изменчивости аденовирусов (генетический дрейф). Однако наиболее доступным, чувсгвитель ным и высокоинформагивным является метод рестрикционного анализа ДНК с помощью крупнощепящих ферментов рестрикции, используемый для определения вариабельности геномов аденовирусов /164/.

Актуальность генетического типирования вирусов с помощью рестрикционного анализа определяется возможностью выявления . ряда закономерностей циркуляции аденовирусов одного серотипа, но с разными гєнотипическими характеристиками, а также возможностью выяснения характера эволюции геномов аденовирусов и, наконец, установлением коррелятивной связи между генотипами штаммов и УРОЕНЯМИ.ИХ вирулентности, другими биологическими свойствами вирусов.

Вопросы, касающиеся изучения основных направлений молекулярной эпидемиологии аденовирусных инфекций, обусловленных АдЗ и Ад7, и глобальное распространение генотипов указанных, вирусов достаточно подробно освещены в литературе /10,14,95, 97/. Тем не менее, до сих пор остаются нерешенными проблемы, связанные с причинами и характером эволюции геномов аденовирусов в плане изменения их вирулентности и эпидемической активности. В связи с этим продолжают оставаться актуальными исследования, посвященные изучению характера циркуляции генотипов в течение продолжительного периода Бремени в сравнительно ограниченном регионе земного шара, как, например, исследования эволюции геномов Дд7 в странах Западной Европы /169/ и в Китае /95/. Следует отметить, что в Советском Союзе подобного рода исследования ранее не проводились, и.нет сведений об эпидемически актуальных генотипах аденовирусов серотипов 3 и 7, циркулировавших на территории СССР.

С другой стороны, в настоящее время в процессе рестрикци-онного анализа ДНК аденовирусных изолятов общепринятым является использование крупнощепящих рестриктаз, узнающих 6 пар оснований. Уровни гомологии ме&ду сравниваемыми генотипами в данном случае определяются с высокой точностью по проценту комигрирующих рестрикционных фрагментов. Однако при этом сравнительному анализу подвергается относительно небольшая часть генома, и определяющим условием является выбор подходящего набора ферментов рестрикции,, дающих наибольший спектр геномных вариантов. Б случае исследования эволюции геномов бо-, лее адекватными будут ВЫЕОДЫ, основанные на сравнении нуклео-тидных последовательностей геномных вариантов. Но метод сек-венирования ДНК остается очень трудоемким для анализа большого числа аденовирусных изолятов. Поэтому актуальной является разработка более дешевого, быстрого и доступного метода, позволяющего проанализировать незначительные геномные изменения у большого числа штаммов и практически независящего от выбора ферментов.рестрикции. Таким методом может быть анализ ДНК аденовирусных изолятов с помощью мелкощепящих эндонуклеаз рестрикции, узнающих 4 пары оснований. К достоинствам разрабатываемого метода следует отнести: во-первых, использование очень небольшого числа ферментов рестрикции (вплоть до одного) вместо 10-12 ферментов при применении.метода с крупнощепящими рестршстазами; во-вторых, .исследованию подвергается большая часть генома в.результате.сравнения наборов мелких фрагментов рестрикции.ДНК; в-третьих, существенно повышается точность анализа эволюционных взаимосвязей, геномных вариантов.

В рамках данной проблемы наряду с интенсивными исследовани ями геномной гетерогенности аденовирусов на молекулярном уровне малоизученными являются вопросы, касающиеся установления корреляций мезду генотипическими и фенотипическими характеристиками штаммов. Б основном уделяется внимание лишь определению взаимосвязи между генотипом вирусов и клинической картиной заболевания, индуцированного ими, а также взаимосвязи между генотипами вирусов и их антигенными характеристиками /10,14,82,172/. Однако в том и другом случаях не было выявлено четко выраженного соответствия.

Вместе с тем актуальными являются исследования репродукционных свойств штаммов аденовирусов с разными генотипами, поскольку указанные свойства должны играть.значительную роль в процессе циркуляции вирусов. К.сожалению, в доступной нам литературе не были обнаружены исследования в этой области.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение геномной гетерогенности популяции аденовирусов серотипов 3 и 7, циркулировавших на территории Советского Союза, при использовании как стандартного метода ресгрикционного анализа с помощью крупнощепящих рестрик-газ, так и нестандартного метода ресгрикционного анализа с помощью мелкощепящих рестрикгаз; а также изучение эволюционных, взаимосвязей.геномных вариантов АдЗ и Дц7 разных лег выделения.

Б соответствии с поставленной целью, были определены, следующие задачи.

I. Разработать наиболее результативные способы очистки аденовирусных вирионов от конгаминирующих ДНК-содержащих вирусов (аденоассоциированных вирусов) и неполных частиц, накапливающихся в процессе репродукции вирусов в клетках тканевых культур Нер-2 и Heia, а также разработать оптимизированные ме тоды.выделения ДНК аденовирусов.

2. Разработать метод анализа ДНК аденовирусов с помощью мелкощепящих ресгрикгаз.

3. Изучить геномную гетерогенность популяции аденовирусов, серотипа 3, циркулировавших на территории СССР в период с 1976 по 1988 гг., при использовании крупнощепящих и мелкощепящих ресгриктаз.

4. Изучить геномную гетерогенность популяции аденовирусов серотипа 7, циркулировавших в Советском Союзе в период 1976-1988 гг., при использовании крупнощепящих и мелкощепящих рестриктаз.

5. Провести анализ эволюции генотипов аденовирусов серо-, типов 3 и 7, циркулировавших на территории Советского Союза.

6. Исследовать ряд биологических свойств штаммов аденовирусов серотипов 3 и 7 с разными генотипами.

7. Оценить биологическую совместимость аденовирусов серогипов 3 и 7 с разными генотипами при их сокультивировании в клетках тканевых культур.

Н.а учная новизна работы.

1. Разработан новый методический прием для изучения геномной, изменчивости аденовирусов с помощью мелкощепящих рестриктаз, позволяющий более адекватно устанавливать эволюционные связи геномных вариантов циркулирующих вирусов.

2. Впервые генотипированы штаммы аденовирусов серогипов 3 и 7, циркулировавшие на территории Советского Союза. Установлены эпидемически актуальные генотипы аденовирусов серотипов 3 и 7 для территории страны в целом.

3. Впервые проанализирована эволюционная взаимосвязь геном ных вариантов циркулировавших штаммов аденовирусов серотипов 3 и 7, выявленных с помощью мелкощепящеи рестриктазы Cfr 131. Установлено, что для эволюции геномов АдЗ региональная локализация, свойственна в большей степени, чем для эволюции геномов Ад7.

4. Впервые показана возможность существования определенной взаимосвязи ряда биологических свойств штаммов, аденовирусов таких, как температурная зависимость репродукционной активности и интерферирующие свойства в отношении вируса везикулярного стоматита, - и генотипов тестированных штаммов.

5. Впервые проведено исследование внутритиповой и межтипо-вой интерференции на тканевых культурах штаммов аденовирусов серотипов 3 и 7 с разными генотипами.

Практическое значение работы.

Внедрение в систему этиологического мониторинга за аденовирусной инфекцией Е. масштабах страны методов генетического типярования аденовирусов.

В совместных исследованиях с д.б.н. проф.Н.С.Дяченко (институт микробиологии и вирусологии им.Д.К.Заболотного АН УССР) показана возможность использования штаммов АдЗ и Ад7 с новыми генотипами в качестве модельных вирусов для поиска ингибиторов вирусной репродукции.

Депонирование в Государственную коллекцию.вирусов пяти оригинальных, авторских штаммов аденовирусов с изученной геноти-пической характеристикой и рекомендованных в качестве диагностических: Ад7/Воронеж/1708/80/р -N ГКВ 2216, Ад7Дерсон/ 3022/86 /П -NTKB 2213, Ад7Дер с он/3024/86 /М -НГКВ 2214, Ад7Дерсон/3160/86/Г1 -NTKB 2215, Ад7/Алма-Ата/3234/87/f 1 - ГКВ 2217.

В качестве диагностикума для РСК (реакции связывания комплемента) рекомендован.и внедрен в практику.ВНИИ гриппа Мин-здрава СССР штамм Ад7Дерсон/3160/86/ И , что позволило существенно увеличить (на 30$). чувствительность реакции при выявлении аденовирусной инфекции у детей.

Основные положения, выносимые назащиту.

1. В природной популяции аденовирусов серотипа 3 при использовании крупнощепящих рестриктаз обнаружено. 4 генотипа: АдЗа4, АдЗаЭ, АдЗаЮ и АдЗаІІ. Эпидемически актуальными генотипами аденовирусов серотипа 3 для Советского Союза являлись АдЗа4 и ЛдЗаЭ.

2. В природной популяции аденовирусов серотипа 7 при использовании крупнощепящих рестриктаз идентифицировано 4 генотипа: Дц7р, Ад7а, Дц7а(1-5) и Ад7:М ..На территории Советского Союза в период с 1976 по 1979 гг. эпидемически актуальным являлся Ад7а-генотип, тогда как в период 1986-1988 гг. эпидемически . актуальным стал Ад7Г1 -генотип.

. 3, Использование мелкощепящих ферментов рестрикции, узна- гащих 4 пары оснований, - новый методический подход в изучении геномной.изменчивости .аденовирусов.

4. Использование мелкощепящих рестриктаз позволяет выявлять различия в структуре популяций циркулировавших штаммов аденовирусов серотилов 3 и 7 по генотипической характеристике в разные годы наблюдения: в противоположность исключительной гетерогенности популяции аденовирусов серотипа 3 и способности возбудителей к активной копиркуляции на протяжении определенного периода наблюдения, для популяции аденовирусов серо типа 7 свойственны значительная гомогенность штаммов, циркулировавших на территории страны в отдельные.годы, а также последовательная смена генотипов во времени.

5. Применение мелкощепящих рестриктаз в изучении геномной гетерогенности аденовирусов позволяет более адекватно устанавливать эволюционные связи геномных вариантов; для эволюции геномов АдЗ характерна региональная локализация в значительно большей степени, чем для эволюции геномов Ад7.

6. Штаммам аденовирусов серотипов 3 и 7 с разными генотипами свойственна различная степень внугригиповои.и межтиповой интерферирующей активности на тканевых культурах.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены: на научной конференции молодых ученых и специалистов (Ленинград, 1988), на Всесоюзной.конференции "Молекулярная биология ДНК-содержащих вирусов, имеющих практическое значение для сельского хозяйства и медицины" (Киев, 1990).

Метод геногипирования аденовирусов Енедрен в практику работы ВДТ при.ВНИИ гриппа Минздрава СССР (акт внедрения от 16.05.1989 г.).

По теме диссертации опубликовано 2 статьи.

Объем, и структура диссертации. Материалы.диссертации изложены на 218 страницах машинописного текста, иллюстрированы . 21 рисунками и 23 габлицалш. Работа состоит из введения, грех глав обзора литературы, четырех глав собственных исследований, заключения, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего работы 7 отечественных и 183 иностранных авторов.

Похожие диссертации на Геномный полиморфизм и эволюционная изменчивость природных популяций аденовирусов серотипов 3 и 7 в процессе их эпидемической циркуляции в СССР