Введение к работе
Актуальность проблемы. Молекулы двухцепочечной ДНК (ДНК) служат мишенью многих противоопухолевых и противовирусных агентов. Узкая бороздка В-формы ДНК представляет собой ключевой участок воздействия большого числа низкомолекулярных соединений, способных нековалентно и сайт-специфично связываться с нуклеотидными последовательностями. Создание таких соединений -узкобороздочных лигандов является перспективной задачей современной молекулярной биологии. Данные вещества, благодаря возможности высокоспецифично взаимодейстовать с определенной последовательностью нуклеотидов, теоретически могут обладать способностью отличать поврежденную ДНК опухолевых клеток, либо ДНК, подвергшуюся воздействию вирусов, от неповрежденной ДНК здоровых клеток. При этом они лишены недостатков, свойственных традиционным биологически активным препаратам на основе алкилирующих агентов и интеркаляторов, в частности - не повреждают ДНК и не вызывают значительного искажения ее пространственной структуры.
Основное требование к структуре молекул узкобороздочных лигандов - их серповидная форма, изогеометричная узкой бороздке ДНК. Удобным повторяющимся структурным мотивом, удовлетворяющим данному условию и при этом комплементарным по отношению к нуклеотидной последовательности расположением доноров водородной связи, является гетероциклический бензимидазольный фрагмент. Такой мотив содержится, в частности, в структуре флуоресцентного красителя Хёхст 33258 (Ш), используемого в цитологии в качестве ДНК-специфичной метки.
н,с.
. Ht н
bis-Ht(n)
(СН2)п
о хо
н,с
сн.
DB(n)
н,с
ХхКР
о о
Рис. 1. Химическая структура красителя Ш и димерных бисбензимидазолов серий bis-Ht(n) и DB(n), где п - число метиленовых групп в линкере.
Ранее в нашей лаборатории был осуществлен синтез аналогов Ш - димерных
бисбензимидазолов bis-Ht(n) (рис. 1). Однако из-за большой склонности к образованию
агрегатов эти соединения имели низкую растворимость в водных растворах. При создании
новых ДНК-специфичных лигандов DB(n) для увеличения растворимости гидрофобные фенильные ядра, присутствующие в молекулах bis-Ht(n), были заменены на гидрофильные CONH-группы.
Целью работы являлось создание и исследование серии флуоресцентных ДНК-сайт-специфичных димерных бисбензимидазолов.
В задачи работы входило: (1) синтез серии димерных бисбензимидазолов DB(n), различающихся длиной олигометиленового линкера, соединяющего два бисбензимидазольных фрагмента молекулы; (2) изучение их взаимодействия с ДНК различными оптическими методами; (3) определение константа связывания (Ксв) с ДНК для отдельных представителей серии; (4) исследование DB(n) в качестве ингибиторов нескольких ДНК-зависимых ферментов; (5) определение мутагенности для наиболее биологически активного из соединений; (6) тестирование синтезированных димерных бисбензимидазолов в качестве флуорохромов в цитологии.
Научная новизна. Разработан удобный метод синтеза димерных бисбензимидазолов DB(n), позволяющий варьировать длину линкера в молекулах, где п -число метиленовых групп в линкере. Метод основан на синтезе мономерного бисбензимидазола MB с его последующей конденсацией с а,ю-алкандикарбоновыми кислотами, либо их активированными диэфирами. Данным способом впервые получены и охарактеризованы димерные бисбензимидазолы DB(n). Спектральными методами изучено взаимодействие данных соединений с ДНК. Показано, что DB(n) in vitro ингибируют некоторые ДНК-зависимые ферменты. Установлено, что эти соединения являются эффективными флуорохромами при дифференциальной окраске хромосом в цитологии.
Практическая значимость. Синтезированные димерные бисбензимидазолы DB(n) оказались эффективными ингибиторами трёх ДНК-зависимых ферментов: ДНК-топоизомеразы-1, ДНК-метилтрансферазы мыши Dnmt3a и хеликазы NS3 вируса гепатита С человека (HCV), проявляющими ингибирующую активность в низких микромолярных концентрациях. Было установлено, что DB(n) являются перспективными флуоресцентными красителями в цитогенетических исследованиях, поскольку данные соединения способны проникать через клеточную и ядерную мембраны и окрашивать ядра клеток, а также дифференциально окрашивать хромосомы человека и растений.
Апробация результатов работы. Материалы диссертационной работы представлены на следующих научных конференциях: конференция молодых учёных Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (Москва, 2008 г.); XX и XXIII зимние молодежные научные школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2008 г., 2011 г.); XXIV International
Congress of IS AC (International Society of Analytical Cytology) (Budapesht, 2008 г.); Keystone Symposia on Molecular and Cellular Biology: DNA Replication and Recombination, (Keystone, Colorado, 2011); Albany 2011: The 17th Conversation (Albany, New York, 2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 статей и 7 тезисов.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 222 источника. Работа изложена на 138 страницах машинописного текста и содержит 2 таблицы, 28 рисунков и 104 схемы.
