Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1 Протеолитические ферменты в растениях и их роль 8
1.2 Протеолитические ферменты в высших грибах, распространение и их роль 12
1.3 Содержание и питательная ценность белков в высших грибах 20
1.4 Ингибиторы протеолитических ферментов, свойства и и распространение в растениях 21
1.4.1 Ингибиторы протеиназ из пасленовых 24
1.4.2 Ингибиторы протеиназ из злаковых 26
1.4.3 Ингибиторы протеиназ из тыквенных и других семейств 28
1.4.4 Белки — ингибиторы протеиназ в семенах 30
1.4.5 Роль ингибиторов протеолитических ферментов в растениях 33
1.5 Ингибиторы протеолитических ферментов в высших и несовершенных грибах 36
2. Материалы и методы исследований 41
2.1 Определение количества белка 43
2.2.1 Определение активности ферментов по природным субстратам 44
2.2.2 Определение активности ферментов по синтетическим субстратам 46
2.3 Определение ингибитора химотрипсина 47
2.4 Определение ингибитора трипсина 48
2.5 Определение активности по молоку цистеиновых и сериновых протеиназ 50
2.6 Методы изучения физико - химических свойств ферментов 51
3. Резульаты и их обсуждение 53
3.1 Количество общего и растворимого белка в соке плодовых тел базидиомицетов 53
3.2 Ингибиторы протеолитических ферментов 60
3.2.1 Ингибиторы трипсина 60
3.2.2 Ингибиторы химотрипсина 65
3.3 Активность протеолитических ферментов 66
3.3.1 Активность ферментов по синтетическим субстратам 66
3.3.2 Динамика изменения активности трипсиноподобных и химотрипсиноподобных ферментов при хранении 69
3.4 Активность протеолитических ферментов по природным субстратам 75
3.4.1 Молокосвертывающая активность ферментов, действие ингибиторов, физико — химические свойства 15
3.4.2 Динамика изменения активности молокосвертывающих ферментов при хранении 80
3.4.3 Активность щелочных и кислых протеиназ и их свойства 83
3.4.4 Физико - химические свойства щелочных и кислых протеиназ 87
3.4.5 Протеолитические ферменты и их ингибиторы у вида Amanita phalloides 91
Заключение 93
Выводы 95
Список литературы 96
- Ингибиторы протеолитических ферментов, свойства и и распространение в растениях
- Определение активности ферментов по природным субстратам
- Активность ферментов по синтетическим субстратам
- Протеолитические ферменты и их ингибиторы у вида Amanita phalloides
Введение к работе
Актуальность проблемы. Протеолитические ферменты выполняют разнообразные физиологические функции в живом организме, начиная с переваривания белков пищи и запасных белков семян до специфических регуляторных процессов, таких как активация зимогенов, образование гормонов и других физиологически активных пептидов из их предшественников, транспорт белков, защитные реакции. В связи с этим изучение механизмов регуляции активности протеолитических ферментов приобретает особую актуальность. Взаимодействие протеиназ с эндогенными белковыми ингибиторами является одним из главных и наиболее древним в эволюционном отношении механизмов регуляции активности протеиназ у живых организмов.
Процессы протеолиза у бактерий, растений и животных изучен достаточно широко и полно. Однако уровень знаний о протеолитических ферментах грибных организмов неравнозначен. Особое место среди мицелиальных грибов занимают базидиомицеты, которые сегодня по праву рассматриваются как перспективные продуценты белка кормового и пищевого достоинства (Бухало А.С., 1988). Дефицит животного сырья и несовершенство микробных препаратов - стимулировали интерес к базидиальным грибам как возможным продуцентам протеолитических ферментов ( Белова Н.В., 1992). Два обстоятельства оправдывают поиск ферментов пищевого и медицинского назначения среди высших базидиомицетов: наличие среди них большого числа съедобных грибов и отсутствие спороношения в культуре, что уменьшает опасность профессиональных заболеваний в условиях производства (Псурцева Н.В. с соавт., 1994).
Протеолитические ферменты применяются в пищевой, кожевенной, легкой, молочной промышленности. С увеличением выработки сыров
возрос интерес к замене животного химозина ферментами другого происхождения. Исследованы культуры базидиомицетов (Kawai М., 1973) способных синтезировать молокосвертывающие ферменты и установлено, что виды Irpex lacteus и Fomitopsis pinicola - образуют протеазы, являющиеся хорошими заменителями химозина.
Особое внимание обращает на себя роль протеолитических ферментов и их ингибиторов в процессе пищеварения у человека и животных. Ингибиторы протеиназ могут в существенной степени затруднять пищеварение белков. С другой стороны, находящиеся в растениях протеолитические ферменты стимулируют этот процесс.
В связи с этим изучение содержания протеиназ и их ингибиторов в пищевых продуктах приобретает особое значение при разработке вопросов питания человека.
Данные о содержании протеиназ и их ингибиторов в растениях, обнаруженные нами в литературных источниках, касаются, в основном, представителей семейств бобовых, злаковых, пасленовых и тыквенных, реже - зонтичных и крестоцветных. Еще меньше литературных сообщений об активности протеаз и их ингибиторов в представителях класса базидиомицетов.
Исследование специфичности протеиназ по отношению к синтетическим и природным субстратам у базидиомицетов различных таксономических и экологических групп закладывает научные основы понимания функциональной роли этих ферментов в жизнедеятельности базидиальных грибов, взаимосвязи грибных организмов с другими компонентами биоценозов, позволяет оценить уровень пластичности ферментных систем базидиомицетов в различных экологических условиях.
Способность синтезировать протеиназы трипсиноподобных и химотрипсиноподобных ферментов в плодовых телах базидиомцетов изучается впервые. Исследование возможностей использования плодовых тел базидиомицетов в качестве продуцентов протеолитических ферментов представляет перспективным направлением экспериментальной микологии.
Цели и задачи исследования. Целью работы было детальное исследование протеолитической активности по природным и синтетическим субстратам, количественное определение содержания общего и водорастворимого белка, а также установление ингибиторной активности трипсина и химотрипсиноподобных ферментов в плодовых телах высших базидиомицетов, наиболее распространенных в Краснодарском крае.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1) Исследовать количество белка, активность трипсиноподобных, химотрипсиноподобных, эластолитических, кислых и щелочных протеиназ.
2) Количественно охарактеризовать активность ингибиторов трипсина и химотрипсина
3) Установить характер распределения протеолитической активности по таксономическим группам.
4) Изучить свойства протеиназ высших грибов: термостабильность, оптимум рН активности, интервал рН стабильности.
Научная новизна. Впервые количественно определена активность протеолитических ферментов по природным и синтетическим субстратам, а также активность ингибиторов трипсина и химотрипсина в 18 видах высших грибов, наиболее распространенных в Краснодарском крае. Изучены свойства протеолитических ферментов: термостабильность, оптимум рН активности, интервал рН стабильности.
Установлена связь уровня протеолитической и ингибиторной активности с эколого-трофическими свойствами базидиомицетов. Наибольшая активность протеиназ и ингибиторов обнаружена у сапротрофов, меньшая у ксилотрофов и минимальная у симбиотрофов.
На основе полученных данных в качестве продуцентов молокосвертывающих ферментов, нами рекомендованы виды Boletus edulis, В. castanus, Leccinum auranticum, Cantarellius aurantiaca порядка Boletales и Lactarius piperatus порядка Russulales.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Высшие грибы, наиболее распространенные в Краснодарском крае, относящие к классу базидиомицетов, содержат значительное количество общего и водорастворимого белка
2. В грибах обнаружена протеолитическая активность ферментов по молоку, казеину, гемоглобину, а также по синтетическим субстратам определена активность эластолитических, трипсиноподобных и химотрипсиноподобных ферментов.
3. Установлена активность ингибиторов трипсина и химотрипсина в исследованных видах.
4. Предложена модификация метода Бредфорд для определения количества водорастворимого белка в образцах, содержащих небелковые, а также интенсивно окрашенные примеси в растительных экстрактах.
Ингибиторы протеолитических ферментов, свойства и и распространение в растениях
Общим свойством белков — ингибиторов является способность образовывать с ферментами устойчивые соединения (Кдисс= 10" — 10" ), лишенные как ферментативной, так и ингибиторной активности (Мосолов В. В., 1993)
Белки - ингибиторы составляют особую группу белков растений, объединяемых общей способностью образовывать с ферментами стехиометрические комплексы, что приводит к конкурентному ингибированию каталитической активности. Среди этих белков наиболее распространенными и в наибольшей степени изученными являются ингибиторы протеиназ и - амилаз (Валуева Т.А., Мосолов В. В., 1999)
Ингибиторы протеиназ обнаружены у растений, принадлежащих к различным систематическим группам: у бобовых, пасленовых, злаковых, тыквенных, сложноцветных, сосновых, частушковых, ароидных, бромеилевых, гречишных, молочайных, тутовых, маревых, крестоцветных, вьюнковых, мальвовых, зонтичных, кариковых (Ковалева О.В., 1998). На их долю приходится значительная часть растительного белка семян. Высокой активностью характеризуются запасающие органы растений, где содержание ингибиторов колеблется в пределах от 5 до 20% от общего количества водорастворимого белка (Мосолов В. В., Валуева Т. А., 1993).
К настоящему времени известно, что семена содержат ингибиторы, действующие на протеиназы трех классов (сериновые, цистеиновые и металлопротеиназы), в них не обнаружены ингибиторы аспартильных протеиназ. Согласно сложившимся представлениям, каждый ингибитор может действовать на ферменты, принадлежащие только к одному классу, то есть существуют ингибиторы сериновых протеиназ (Валуева Т.А., Мосолов В. В. 1999).
Из всех исследованных растительных семейств особенно высоким содержанием ингибиторов отличается семейство бобовых.
По данным В.В. Мосолова и Т.А. Валуевой (1993), ингибиторы бобовых растений объединены в 3 семейства:
1. семейство ингибитора трипсина Кунитца из сои;
2. семейство ингибитора трипсина и химотрипсина Баумана -Бирк;
3. семейство родственных белков - ингибиторов, подавляющих активность сериновых протеиназ микроорганизмов и не действующих на трипсин и химотрипсин.
Содержание ингибиторов протеиназ в бобовых растениях может иногда достигать значительных величин. Так, в семенах маша, нута и фасоли обыкновенной их количество составляет 0,25, 1,5 и 3,6 г/кг. В семенах лимской фасоли содержание ингибитора трипсина достигало 0,5г на 100г бобов (Мосолов В.В., 1998). Особенно высокое содержание ингибиторов протеиназ в запасающих органах растений, таких как семена и клубни, позволяет высказать предположение о том, что они могут выступать в роли белков. Характер изменений в содержании ингибиторов протеиназ на разных стадиях развития не противоречит такой возможности. Так, в зерне ячменя ингибиторы химотрипсина и микробных протеиназ синтезируются на той же стадии развития, как и запасные белки (Bodew W., Huber R., 1992).
В 1993 году И.П. Гладышевой, Т.З. Шарафутдиновым и Т.В. Тихоновой (1993) было сообщено о выделении из фасоли отечественной селекции и коммерческой соевой муки изоиннгибиторов типа Баумана — Бирк. Выделенные ингибиторы являлись двухцентровыми и связывали трипсин на одном, а химотрипсин, лейкоцитарные эластазу и катепсин на другом реактивном центре, а в 1995 году из бобов сои выделен новый вид ингибиторов протеиназ типа Кунитца (Зимачева А.В., Мосолов В.В., 1995).
Из семян гречихи (Fagopyrum esculentum) выделены низкомолекулярные ингибиторы сериновых протеиназ (BWI). Все ингибиторы обладали высокой рН — и термостабильностью в диапозоне 2 - 12. Кроме трипсина ингибиторы подавляли активность химотрипсина и бактериальных субтилизиноподобных протеиназ. Анализ аминокислотных последовательностей и физико - химических свойств ингибиторов BWI — ЗС и BWI -4С позволил отнести их к семейству ингибитора протеиназ из картофеля (Цыбина Т. А. с соавт., 2001)
Было установлено также присутствие трипсиновых ингибиторов в нуте, коровьем горохе, конских бобах, лобии и каяне, а также содержание ингибиторов трипсина и химотрипсина в семенах и клубнях крылатых бобов . При исследовании термостабильности ингибиторов оказалось, что ингибиторы нута и коровьего гороха разрушались при кипячении в течение часа, в то время как ингибиторы конских бобов, лобии и каяна практически не инактивировались. Исключительно устойчив при автоклавировании оказались ингибиторы конских бобов, а для лобии и каяна степень разрушения составила 33 и 83% соответственно. Ингибиторы из клубней крылатых бобов, в противоположность ингибиторам из семян могли быть легко инактивированны с потерей до 90% активности двухминутным кипячением свежезамороженного порошка клубней (Chabala J., et al., 1981).
Таким образом, бобовые растения содержат один или более ингибиторов, которые обладают способностью подавлять активность трипсина, химотрипсина, эластазы, катепсина, а также сериновых протеаз микроорганизмов. Все эти ингибиторы в той или иной мере устойчивы к различным денатурационным воздействиям и протеолитическому перевариванию (Мосолов В.В., 1998).
Определение активности ферментов по природным субстратам
Протеолитическую активность щелочных протеиназ определяли по методу М. Кунитца ( цит. по Нортропу Д. С сотр., 1950), сущность которого заключается в количественном спектрофотометрическом определении продуктов гидролиза казеина при длине волны 280 нм после осаждения непереваренных остатков трихлоруксусной кислотой (ТХУК). Ход определения: 1 мл 1% - го казеина, приготовленного на 0,1М фосфатном буфере рН 7,6, прогревали с 1 мл пробы при 35С в течение 20 минут, реакцию останавливали, добавляя 3 мл 0,3 М ТХУК и встряхивали. Смесь оставляли в течение 1,5 часа при комнатной температуре. После этого осадок отфильтровывали. В контроле исследуемый раствор добавляли после трихлоруксусной кислоты. Из оптической плотности опытного раствора вычитали оптическую плотность контроля. Активность ферментов выражали в единицах оптической плотности.
Протеолитическую активность кислых протеиназ определяли с использованием денатурированного гемоглобина методом М. Anson (1938), измеряя спектрофотометрически при длине волны 280 нм продукты гидролиза гемоглобина после осаждения ТХУК.
Ход определения: Субстрат - 1% раствор гемоглобина: 1 г гемоглобина тщательно растирали с 80 мл воды, затем добавляли 20 мл 0,3 М раствора HCL, рН раствора 1,5- 2,5. К 1 мл гемоглобина добавляли 1 мл опытного раствора и ставили смесь на инкубацию при 35С на 10 минут. Затем добавляли 3 мл 0,ЗМ трихлоруксусной кислоты и встряхивали. Через 10 минут осадок отфильтровывали. В контроле 1 мл опытного раствора добавляли после 0,3М трихлоруксусной кислоты. Из оптической плотности раствора вычитали оптическую плотность контрольного раствора. Активность протеиназ выражали в единицах оптической плотности на 1 грамм сырого гриба.
Химазную (молокосвертывающую) активность химотрипсина определяли методом Н. П. Пятницкого (1969). Химотрипсин принадлежит к числу ферментов, створаживающих молоко. Молокосвертывающая активность химотрипсина — отличительный признак в ряду других щелочных протеиназ. Под действием химотрипсина происходит ограниченный протеолиз казеиногена молока с отщеплением стабилизирующего гликомакропептида и образованием в воде нерастворимого п - казеина, который выпадает в осадок в виде хлопьев. Скорость створаживания молочно — ацетатной смеси (МАС) прямо пропорциональна активности фермента при времени створаживания молока от 4 до 60 минут. МАС представляет собой смесь равных объемов свежего коровьего молока и 1 М ацетатного буфера рН 5,0.
Ход определения: к 0,25 мл пробы фермента приливали 2,5 мл прогретой до 35С МАС и измеряли время до появления первых хлопьев выпадающего в осадок п — казеина. За единицу химазной активности принимали такое количество фермента, которое створаживало 2,5 мл MAC за 1 минуту при температуру 35С. Активность вычисляли по формуле:
A=l/t Где А - активность, t - время от начала реакции до начала створаживания МАС в минутах, и пересчитывали на 1 мл образца фермента.
Амидазную активность трипсиноподобных ферментов определяли по гидролизу N - бензоил - D, L - аргинин - п - нитроанилида (БАПНА) спектрофотометрически (Тирру Н. et al., 1962). Субстрат представляет собой 0,0005 М раствор БАПНА в 0,02 М трис - HCL буфере рН 8,2. К 2,5 мл субстрата приливали 0,5мл 0,02 М буфера трис - HCL буфера рН 8,2, 0,25 мл дистиллированной воды и 0,25 мл раствора фермента и измеряли оптическую плотность при длине волны 400 нм. Смесь инкубировали при 35С в течение 30 минут, после чего вновь измеряли оптическую плотность. Прирост оптической плотности за 30 минут инкубации пропорционален активности фермента, причем линейная зависимость сохранялась до величины прироста 0,3 единицы А4оо- Для выражения активности в мкМ расщепленного субстрата в минуту, результат умножали на коэффициент 2,97.
Амидазная активность химотрипсина заключалась в определении спектрофотометрически п — нитроанилида, который освобождается при разрыве пептидной связи между фенилаланином и п- нитроанилидом субстрата N- сукцинил - L - фенилаланин - п- нитроанилида (СФПНА) (ErlangerB. F. Etal., 1966)
Ход определения: К 1,75 мл субстрата (0,0005М раствор в 0,05 М трис - HCL буфере рН 7,5) приливали 0,25 мл пробы. Измеряли оптическую плотность при 410 нм. Ставили в водяную баню для инкубации при 35 С на 30 минут. По окончании снова измеряли оптическую плотность при той же длине волны и находили разность между конечным значением оптической плотности и первоначальным.
Для выражения активности в мкМ расщепленного субстрата в минуту, результат умножали на 2,97.
Эластолитическую активность определяли по гидролизу субстрата N- сукцинил - триаланин - п - нитроанилида (СТАПНА) (Katagiri К. Et al., 1978), сущность которого в определении п - нитроанилина, высвобождающегося из субстрата под действием эластазы.
Ход определения: к 1 мл 0,02 М трис - HCL буфера рН 8,2 мл 0,02 М добавляли 0,25 мл воды, 0,25 мл пробы и 1 мл субстрата (0,1 мМ раствор в 0,02 М трис - HCL буфере рН 8,2). Измеряли оптическую плотность при 410 нм. Ставили в водяную для инкубации при 35С на 30 минут. По окончании снова измеряли оптическую плотность при той же длине волны и находили разность между конечным значением оптической плотности при длине волны и находили разность между конечным значением оптической плотности при той же длине волны и первоначальным.
Для пересчета единиц прироста оптической плотности при длине волны 410 нм в мкМ субстрата, расщепленного за 1 минуту, полученный результат умножали на коэффициент 0,67.
Активность ферментов по синтетическим субстратам
Нами впервые в высших грибах была исследована активность трипсиноподобных, химотрипсиноподобных, по субстратам N — бензоил - D, L - аргинин - п - ниртоанилида (БАПНА) и N- сукцинил — L -фениалаланин - п- нитроанилид (СФПНА) соответственно. Активность трипсиноподобных и химотрипсиноподобных ферментов обнаружена во всех исследованных видах. Активность трипсиноподобных ферментов колебалась в диапозоне от 0,3 до 2,2 мкМ (табл.6). Среди видов четырех порядков наиболее высокая активность обнаружена в порядке Boletales, где максимальная активность у видов Boletus edulis - 2,2 мкМ и минимальная в Cantarellus aurantiaca - 1,4 мкМ. В порядке Agaricales наибольшая трипсиноподобная активность у вида Flammulina velutipes - 1,3 мкМ семейства Tricholomataceae и наименьшая у вида Pleurotus ostreatus — 0,2 мкМ семейства Pleurotaceae. В порядке Russulales максимальное количество трипсиноподобных ферментов наблюдалось у вида Lactarius pubescens -1,6 мкМ, а минимальное у вида Lactarius piperatus - 0,9 мкМ. В порядке Aphyllophorales активность трипсиноподобных ферментов высокая у вида Hericium erinaceus - 2,1 мкМ.
Активность химотрипсиноподобных ферментов колебалась от 1,3 до 4,8 мкМ активности. Наиболее высокой обладали грибы порядка Boletales, вид Boletus edulis. В порядке Agaricales высокой активностью отличался вид Flammulina velutipes - 2,4 мкМ; в порядке Russulales -Lacatarius piperatus - 2,9 мкМ. Наименьшей химотрипсиноподобной активностью обладали грибы порядка Aphyllophorales, вид Hericium erinaceus-2,1 мкМ.
Между содержанием трипсиноподобных и химотрипсиноподобных фементов у всех видов порядков Boletales, Agaricales, Aphyllophorales, Russullales существует положительная корреляционная зависимость г - 0,64. Между триспсинподобными и химотрипсиноподобными ферментами у видов внутри порядков Boletales и Agaricales также наблюдается положительная корреляционая зависимость, г - 0,32 и г - 0,26 соответственно.
Эластолитическая активность по субстрату N- сукцинил - триаланин - п- нитроанилиду (СТАПНА) установлена в видах порядка Boletales. Эластолитическая активность в высших грибах колебалась от 0,09 до 0,24 мкМ, где высокие значения обнаружены у вида Boletus edulis и минимальные у Cantarellus aurantiaca. Эластолитическая активность обнаружена в самых различных источниках: бактериях, многих видах беспозвоночных и позвоночных животных (Shotton D. М., 1970; Sutherland J. L., et al., 1191). По доступной нам литературе сведений об эластолитической активности в базидиомицетах не обнаружено.
Таким образом, во всех исследованных видах установлена активность трипсиноподобных и химотрипсиноподобных ферментов и только у видов порядка Boletales - эластолитических. Из исследованных видов максимальными значениями активности по всем субстратам обладали виды порядка Boletales и в частности вид Boletus edulis.
Протеолитические ферменты и их ингибиторы у вида Amanita phalloides
Среди исследованных нами видов один был ядовитым - Amanita phaloides. Нам было интересно сравнить активность протеолитических ферментов и их ингибиторов этого вида со съедобными грибами. Количество общего белка (по Кьельдалю), определенное нами в Avfnita phaloides составило 25%, растворимого 2,2%, по Бредфорд 3,6 мг/мл. Содержание ингибитора трипсина, установленное нами, было 1,2 мг/мл, ингибитор химотрипсина не обнаружен. Активность трипсиноподобных ферментов составляла 0,4 ед, химотрипсиноподобных 1,8 ед. По всем перечисленным показателям вид Amanita phaloides занимал промежуточное положение по сравнению с остальными видами.
По сравнению с другими видами, Amanita phaloides обладал минимальной активностью трипсиноподобных ферментов - 0,4 ед. Однако она сохранялась в течение 5 месяцев при хранении в замороженном состоянии (рис. 10), что являлось отличительным признаком в сравнении с другими видами. Наблюдалась низкая активность молокосвертывающих ферментов - 0,4ед с интервалом рН стабильности 6-10, ферменты полностью ингибировались фенилметилсульфонилфторидом, после действия монойодацетатом активность составила 25% от исходной. Активность молокосвертывающих ферментов оставалсь неизменной при хранении в замороженном состоянии в течение 4 месяцев. Активность щелочных протеиназ составила 0,28 ед с оптимумом рН 8,5, кислых -0,12 ед, с оптимумом рН 3,5.
Таким образом, проанализировав полученные данные у вида Amanita phaloides по сравнению с другими видами, можно сказать, что отличительным признаком была высокая стабильность трипсиноподобных ферментов при хранении в замороженном состоянии. По остальным показателям Amanita phaloides не выделялся по сравнению со съедобными. Заключение
В результате проделанной нами работе исследовано 18 видов высших базидиомицетов, наиболее распространенных в Краснодарском крае. Установлено было наличие химотрипсинподобных, трипсиноподобных, молокосвертывающих, эластолитических, кислых и щелочных протеиназ, а также ингибиторной активности трипсина и химотрипсина.
Определено количество общего и водорастворимого белка в исследованных видах, установлено что растворимый белок от общего составляет от 7 до 17% в зависимости от вида. Сравнивая данные, полученные методом Лоури и Бредфорд, с использованием калибровочного графика, построенного по казеину, пришли к заключению, что метод Лоури дает значительно завышенные, не реальные результаты количества растворимого белка по сравнению с данными, полученными методами Кьельдаля. Таким образом, метод Лоури не позволяет определить белок в интенсивно окрашенных продуктах без калибровочной, полученной по очищенному белку грибов. Максимальное количество общего и водорастворимого белка обнаружено в Boletus edulis порядка Boletalcs. Предложенная нами модификация метода Бредфорд позволяет количественно определять белок в окрашенных растворах.
Ингибиторы трипсина и химотрипсина в исследованных видах обнаружены впервые. Ингибиторы протеолитических ферментов затрудняют пищеварение белков и приводит к отрицательным физиологическим показателям, поэтому полученные данные имеют большое значение при составлении рационов питания человека.
Ингибиторы трипсина обнаружены во всех видах и установлен закономерный характер распределения активности ингибитора трипсина по таксономическим группам: максимальное содержание у видов Boletales, далее следуют порядки Agaricales, Russullales, Aphyllophorales. Активность ингибиторов химотрипсина обнаружена в 6 из 18 видов и от 1,1 до 36 раз выше активности ингибитора триписна в зависимости от вида, минимальная разница у вида Leccinum melanum порядка Boletales и максимальная у вида Coriolus versicolor порядка Aphyllophorales. У видов порядка Russulales активность ингибитора химотрипсина не обнаружено.
Наличие активности трипсиноподобных, химотрипсиноподобных и эластолитических ферментов было обнаружено впервые. Максимальной активностью по синтетическим субстратам обладали виды порядка Boletales, которые по типу эколого — трофических связей относятся к сапротрофам.Установлена динамика изменения активности трипсиноподобных, химотрипсиноподобных и молокосвертывающих ферментов в течение 7 месяцев при хранении в замороженном состоянии. Проанализоировав динамику изменения активности протеиназ в исследованных видах базидиомицетов, можно сказать, что стабильность в замороженном состоянии у химтрипсиноподобных ферментов выше, чем трипсиноподобных, но ниже молокосвертывающих.
Во всех видах установлена активность молокосвертывающих ферментов, максимальная активность наблюдалась в видах порядка Boletales. Можно предположить, что наиболее перспективными видами для поисков заменителями химозина являются Boletus edulis, В. Castanus, Leccinum auranticum, Cantarellius aurantiaca порядка Boletales и Lactarius pipcratus порядка Russulales. Ингибиторный анализ молокосвертывающих ферментов показал, что во всех исследованных видах установлена активность цистеиновых и сериновых протеиназ, причем активность сериновых протеиназ более выражена. Проанализировав характер распределения протеолитической активности по таксономическим группам можно сказать, что наиболее активными по природным и синтетическим субстратам являлись виды порядка Boletales, далее следуют Agaricales, Russulales и Aphyllophorales. Нами выявлена и количественно измерена активность кислых и щелочных протеиназ у видов порядка Boletales и Agaricales и менее выражена у видов порядка Russulales и Aphyllophorales. Максимальную активность щелочных протеиназ наблюдали у видов Boletus edulis и Flammulina velutipes, кислых у вида Leccinum auranticum и L. melanum. Установлена положительная корреляционная зависимость между щелочными и кислыми протеиназами.
Впервые рассчитаны интервал рН стабильности и оптимум рН активности по природным субстратам. Проанализировав распределение протеолитической активности с учетом трофических связей базидиомицетов установили, что биосинтез протеиназ более выражен у макромицетов с сапротрофным типом питания, тяготеющих органикой к древесным или богатым органикой (лигнино - целлюлозными компонентами) субстратам.
Похожие диссертации на Протеолитические ферменты и их ингибиторы в высших грибах
