Введение к работе
Актуальность проблемы. Со времени открытия феномена флуоресценции зелёного белка (GFP) медузы Aequorea victoria прошло уже почти пятьдесят лет. Однако лишь в конце XX века благодаря бурному развитию технологий рекомбинантных ДНК с одной стороны и технических возможностей оптической микроскопии с другой, флуоресцентные белки нашли широкое прикладное применение в биологии. Множество исследовательских групп в течение двух последних десятилетий занято получением и описанием новых вариантов GFP-подобных белков, а также разработкой методик и технологий на их основе. Из организмов, относящихся к различным таксономическим группам, выделены десятки флуоресцентных белков, на основе которых с помощью рационального дизайна созданы тысячи мутантных вариантов, оптимизированных для решения конкретных прикладных задач и обладающих теми или иными уникальными свойствами. На сегодняшний день исследователям доступны флуоресцентные белки с эмиссией почти в любой части видимого спектра. Единственным существенным пробелом остаётся дальнекрасная область, где отсутствуют белки, обладающие яркой стабильной флуоресценцией, пригодные для практического применения. Однако ткани животных наиболее эффективно пропускают свет именно в дальнекрасной и инфракрасной областях за счёт низких значений поглощения и рассеяния. По этой причине получение ярких GFP-подобных белков с максимумами эмиссии флуоресценции более 630 нм является актуальной задачей. Получение таких белков позволит значительно повысить чувствительность методов визуализации, требующих проникновения сигнала через толщу живых тканей, например, в экспериментальной онкологии (для исследования развития опухолей, метастазирования и эффективности терапии), при изучении стволовых клеток, в биологии развития, нейрологии и многих других областях биомедицинской науки. Кроме того, получение белков, флуоресцирующих в дальнекрасной области видимого спектра, позволит расширить возможности многоцветного мечения, создать принципиально новые пары донор-акцептор для методов, основанных на безызлучательном переносе энергии (FRET), откроет новые возможности в дизайне биосенсоров.
Цели и задачи работы. Целью настоящей работы являлось получение новых вариантов GFP-подобных флуоресцентных белков с максимумами эмиссии флуоресценции в красной, дальнекрасной и околоинфракрасной областях видимой части спектра, обладающих яркой и стабильной флуоресценцией и предназначенных для эффективной визуализации в лабораторных животных. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
Получить и охарактеризовать максимально яркий красный флуоресцентный белок.
На его основе, получить флуоресцентные белки, характеризующиеся максимальным батохромным сдвигом спектра эмиссии при минимальных потерях в яркости флуоресценции.
На основе полученных красных и дальне-красных флуоресцентных белков, получить мономерные версии со сходными спектральными характеристиками, применимые для мечения белков слияния для визуализации в живых клетках и тканях.
Научная новизна и практическая ценность работы. В результате работы получен набор GFP-подобных флуоресцентных белков с эмиссией флуоресценции в диапазоне от красной до околоинфракрасной. Наряду с димерными вариантами получены мономерные аналоги, предназначенные для мечения целевых белков. Все белки охарактеризованы in vitro и
Получение ярких красных флуоресцентных белков
протестированы на моделях in vivo от культур клеток, до лабораторных животных. Полученные белки активно используются во многих лабораториях мира. Впервые был получен яркий и пригодный для практического применения флуоресцентный белок с максимумом эмиссии более 630 нм, а также белок с одним из самых длинноволновых максимумов эмиссии (при 670 нм). Описаны некоторые эффекты влияния аминокислотных замен в микроокружении хромофора на характеристики GFP-подобных белков: фотостабильность, яркость, спектры возбуждения и эмиссии флуоресценции. Экспериментально подтверждено расположение некоторых аминокислотных остатков, отвечающих за олигомеризацию.
Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 100 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 137 ссылок. Диссертация содержит 16 рисунков и 1 таблицу.
Апробация работы. Основные материалы диссертации были доложены на Ежегодном съезде Германского Общества клеточных биологов (Франкфурт-на-Майне, 2007); Международном научно-методическом семинаре «Инновационные методы микроскопии в исследовании живых систем» (Санкт-Петербург, 2008); Ежегодном съезде Европейского молекулярно-биологического общества (Амстердам, 2009); Конференции «Физиология 2010» (Манчестер, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано шесть статей в международных рецензируемых журналах.
