Содержание к диссертации
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ1.1 Вирусы простого герпеса, аденовирусы и вирусы гриппа как возбудители социально значимых инфекционных заболеваний
1.1.1 Вирус простого герпеса
1.1.2 Аденовирусы
1.1.3 Вирусы гриппа
1.2 Интерфероны первого типа и их роль в функционировании иммунной системы человека и патогенезе герпетической, аденовирусной и гриппозной инфекции
1.3 Система ПОЛ-АОЗ и её роль в патогенезе вирусных инфекций
1.4 Модели для оценки противогерпетической, противоаденовирусной и противогриппозной эффективности лекарственных средств in vitro и in vivo
1.5 Методы оценки биологической активности интерферона
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1 Вирусы
2.2 Клеточные культуры
2.3 Определение цитотоксического действия веществ
2.4 Определение цитопатической дозы вируса
2.4.1 Определение 50% тканевой цитопатической дозы вируса (ТЦИД5о)
2.4.2 Определение цитопатической дозы вируса методом бляшкообразования
2.5 Определение специфической противовирусной активности интерферона
2.6 Определение противогерпетической активности соединений in vitro
2.6.1 Определение антигерпесвирусного действия вещества путем оценки его способности предотвращать вирусиндуцированное цитопатическое действие (ЦПД) в культуре клеток
2.6.2 Определение антигерпесвирусного действия вещества путем оценки снижения инфекционного титра вируса
2.7 Определение противогерпетической активности комбинации соединений in vitro
2.8 Определение противоаденовирусной активности соединений in vitro
2.9. Определение противогриппозной активности соединений in vitro
2.9.1 Определение противогриппозной активности соединений in vitro, визуальный учет цитопатического действия вируса
2.9.2 Определение противогриппозной активности соединений in vitro, учет цитопатического действия вируса с использованием автоматического спектрофотометра
2.10 Физико-химические методы анализа
2.10.1 Определение плотности растворов прозрачных жидкостей
2.10.2 Определение вязкости жидкостей
2.10.3 Определение рН жидкостей
2.11 Препараты
2.11.1. Препараты для разработки новой лекарственной формы
2.11.2Противогерпетическиехимиопрепараты
2.11.3 Препараты, активные в отношении вируса гриппа
2.12 Животные
2.13 Стандарты
ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА НОВОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ ИНТЕРФЕРОНА. ДЛЯ МЕСТНОГО ПРИМЕНЕНИЯ
3.1 Изучение свойств различных марок полимерной основы
3.2 Подбор антиоксидантов для новой лекарственной формы
3.3 Определение тканевой цитотоксической концентрации (ТЦ50) исследуемых веществ
3.4 Исследование влияния полимера на специфическую противовирусную активность интерферона
3.5 Подбор концентраций альбумина для обеспечения стабильности человеческого рекомбинаитного интерферона альфа-2 в процессе хранения
3.6 Подбор вспомогательных веществ для новой лекарственной формы с учетом возможности изучения in vitro с использованием культуры клеток
3.7 Изучение влияния антиоксидантов на специфическую противовирусную активность интерферона
3.8 Изотонирование растворов
ГЛАВА 4. АНТИВИРУСНАЯ АКТИВНОСТЬ НОВОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ ИНТЕРФЕРОНА ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО РЕКОМБИНАИТНОГО АЛЬФА-
4.1 Краткая характеристика свежевыделенных штаммов ВПГ
4.2 Оценка цитотоксического влияния различных концентраций новой лекарственной формы на жизнеспособность клеток (определение ТЦД50)
4.3 Противогерпесвирусная активность новой лекарственной формы
4.4 Антигерпесвирусная активность новой лекарственной формы в отношении вариантов вируса простого герпеса, изолированных из клинического материала
4.5 Противогерпесвирусная активность НЛФ в отношении вариантов вируса простого герпеса с устойчивостью к ацикловиру
4.6 Противоаденовирусная активность новой лекарственной формы
4.7 Противогриппозная активность новой лекарсвтенной формы
4.7.1 Оценка противогриппозной активности новой лекарственной формы, визуальный учет цитопатического действия вируса
4.7.2 Оценка противогриппозной активности новой лекарственной формы, учет цитопатического действия вируса с использованием автоматического спектрофотометра
ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ СОЧЕТАНИЯ НОВОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ И ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ В ОТНОШЕНИИ ВИРУСА ПРОТОГО ГЕРПЕСА
5.1 Антигерпесвирусная активность препаратов на модели вируса простого герпеса штамм Л2 в культуре клеток Vero
5.2 Изучение эффективности комбинирования новой лекарственной формы интерферона.и различных противогерпетических препаратов (двойные комбинации)
ГЛАВА б. ИЗУЧЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ СОЧЕТАНИЯ НОВОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ И ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ В ОТНОШЕНИИ ВИРУСА ГРИППА
6.1 Противовирусная активность препаратов в отношении вируса гриппа A H]Ni/USSR/
6.2 Противовирусная активность комбинаций препаратов и новой лекарственной формы в отношении вирусов гриппа A HiNi/USSR/77 и A H3N2/Aichi/
6.3 Противовирусная активность комбинаций препаратов и новой лекарственной формы в отношении вируса гриппа A HiNiAJSSR/77 при различных способах внесения исследуемых препаратов
ГЛАВА 7. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
Введение к работе
VSV -вирус везикулярного стоматита АВК -аденовирусный конъюнктивит АОЗ -антиокислительная защита АПК -антиген презентирующие клетки ДНК -дезоксирибонуклеиновая кислота ЕМС -вирус энцефаломиокардита мыши ИЛ -интерлейкины ИФН -интерферон МДА -молоновый диальдегид МИФ -метод имму но флюоресценции МНС -главный комплекс гистосовместимости МПК -максимально переносимая концентрация вещества НЛФ -новая лекарственная форма ОАВК -осложненный аденовирусный конъюнктивит ОРВИ -острые респираторные вирусные инфекции ПААГ -полиакриламидный гель ПМК -периферические моноциты крови ПОЛ -перекисное окисление липидов ПЦР -полимеразная цепная реакция РГА -реакция гемагглютинации РНК -рибонуклеиновая кислота РТГА -реакция торможения гемагглютинации ТЦД5о -тканевая цитотоксическая концентрация вещества ФНО -фактор некроза опухоли ЦПД -цитопатическое действие ВВЕДЕНИЕ. Традиционно лекарственные средства для терапии вирусных инфекций вводятся системно: парентерально или per os. При применении лекарственного средства per os возможно негативное воздействие препарата на гастроинтестинальный тракт, а так же разрушение действующего вещества после гастроинтестинальной абсорбции ферментами желудочно-кишечного тракта. При парентеральном введении не происходит деградации препарата печеночными ферментами, и действующее вещество быстро попадает в системный кровоток, однако сам путь введения - инъекция довольно болезненный. Кроме того, возможно негативное местное воздействие препарата на ткани в месте введения, выражаемое в виде тканевого некроза и тромбофлебита (124,128).
В последнее время исследователи уделяют большое внимание альтернативным путям введения препаратов - через слизистые оболочки прямой кишки, респираторного тракта, глаза, влагалища и матки и другие (141, 149, 163, 173, 203). Кроме широко известного введения лекартсвенного вщества через слизистую оболочку прямой кишки (ректальное введение), описано проникновение лекарственного вещества в системный кровоток через слизистую оболочку респираторного тракта, абсорбция вещества через респираторную слизистую равна практически 100% для низкомолекулярных неполярных гидрофобных веществ, для других полярных веществ она несколько ниже, около 90-99% (186,187, 195). Так же описано введение препарата через слизистую оболочку влагалища и матки (203).
По данным литературы, многие формы вирусных инфекций поддаются местному лечению, зачастую местное применение химиотерапевтических препаратов более эффективно, чем системное, поскольку обеспечивает высокую концентрацию действующего вещества непосредственно в очаге инфекции (17, 19, 40, 44, 63, 185, 205) без токсического воздействия на организм в целом.
Грипп является массовой инфекцией, ежегодно регистрируется огромное количество эпизодов заболевания, что наносит значительный экономический ущерб. Несмотря на достаточный арсенал лечебных актуальность профилактики и лечения гриппозной инфекции крайне высока, так как в настоящий момент наблюдается распространение новых вариантов вируса гриппа, а так же вариантов вируса, имеющих лекарственную устойчивость к химиотерапевтическим препаратам (35, 36, 57,158).
Для герпесвирусов возможны несколь форм инфекции: офтальмогерпес, генитальный герпес, герпетическое поражение кожи и слизистых ротоглотки, в качестве системного воздействия герпесвирусов можно отметить поражение центральной нервной системы.
Показана ассоциация некоторых урологических и гинекологических заболеваний с герпетической инфекцией: герпес - ассоциированные уретриты и эндометриты (18, 102, 103). В отдельных исследованиях выявлена связь течения пародонтита и пародонтоза с репликацией вируса герпеса в содержимом пародонтального кармана (198). В последнее время офтальмогерпес, как одно из проявлений герпесвирусной инфекции регистрируется значительно чаще, так же часто отмечается тяжелое течение заболевания (49, 70).
Герпетическая инфекция, вызываемая вирусом простого герпеса первого или второго типов является одной из самых распространенных инфекций среди населения. По данным ВОЗ к 18 годам около 90% жителей городов инфицированы одним или несколькими штаммами ВПГ (ВПГ 1 и 2-го типов, варицелла зостер, цитомегаловирус, вирус Эпштейн-Барр, ВПГ 6 и 8-го типов). По числу инфицированных людей, госпитализированных в стационары, герпесвирусная инфекция уступает только гриппу и другим ОРВИ вместе взятым. Несмотря на имеющийся в настоящий момент большой арсенал противогерпетических средств, эффективность терапии герпетической инфекции зачастую невысока. Так же в последнее время резко возросло число людей, инфицированных вирусами с устойчивостью к противовирусным препаратам (66, 191).
Таким образом, изменьчивость вирусов, наличие устойчивых к традиционной химиотерапии штаммов вирусов и отсутствие профилактического эффекта от традиционной этиотропной противовирусной терапии требует разработки новых препаратов, обладающих универсальным механизмом противовирусного действия и широким спектром противовирусной активности.
Интерферон человеческий рекомбинантный альфа-2 является аналогом эндогенного интерферона альфа человека, относящегося к интерферонам первого типа, и обладает противовирусными, иммуномодулирующими и антипролиферавными свойствами. Кроме того, ИФН обладает антимикробной активностью за счет способности стимулировать систему фагоцитов. ИФН является универсальным противовирусным средством и высоко эффективен в отношении широкого спектра вирусов (37, 90, 145).
Согласно данным литературы (140, 147, 173, 185, 205, 212) местное применение препаратов интерферона для терапии вирусных инфекций является перспективным направлением, поскольку обеспечивает высокую концентрацию интерферона в очаге воспаления, а так же даёт возможность проводить кроме противовирусной терапии местную иммунокоррекцию.
Во многих работах показана связь функционирования иммунной системы и течения вирусной инфекции. Установлено, что вирусы семейства герпеса могут поражать клетки иммунной системы, вызывая вторичные иммунодефициты, доказана связь между функционированием системы интерферона и течением инфекции, вызванной вирусом семейства герпеса (21, 38, 42, 58, 132). Выявлено, что у больных ВПГ - инфекцией значительно снижена способность к продукции экзогенного интерферона и других цитокинов, запускающих механизмы специфической (адаптивной) и неспецифической (нативной) противовирусной защиты (5, 77, 79).
В последнее время проводится много исследований в области оценки влияния процессов ПОЛ в патогенезе различных заболеваний, в том числе вирусных инфекций (1, 4,
6, 31, 34, 61). В работах (60, 153) показано четкое коррелирование тяжести проявлений катаракты и выраженности процессов ПОЛ в хрусталике глаза, так же доказано, что процессы ПОЛ вносят существенный вклад в течение диабетической ретинопатии (189). В работе (133) показано, что в патогенезе стромальных кератитов, в том числе и ассоциированных с вирусом герпеса, значительную роль играет апоптоз и некроз инфицированных кератиноцитов в строме роговицы. Известно, что одним из механизмов коррекции апоптоза клеток является использование антиоксидантов, позволяющих через процессы ингибирования ПОЛ уменьшать его интенсивность (23, 216). Влияние процессов ПОЛ на течение других вирусных инфекций изучено недостаточно, не разработаны способы коррекции ПОЛ. Так же не изучена возможность влияния с помощью антиоксидантов на интенсивность апоптоза и некроза эпителиальных клеток при развитии инфекции.
Под руководиством дбн, профессора В.В. Малиновской в течение многих лет прововдились исследования, направленные на поиск возможностей коррекции эндогенной системы интерферона, а так же возможностей повышения эффективности интерферонотерапии. Выявлена связь между течением вирусной инфекции и перекисным окислением липидов мембран (ПОЛ), показано, что при интенсификации процессов ПОЛ происходит увеличесние протеолитической активности сыворотки крови и инактивация циркулирующего интерферона. Предложены способы коррекции ПОЛ при генитальном герпесе антиоксидантами (103). В результате проведенных многолетних исследований В.В, Малиновской был разработан комплексный препарат на основе интерферона в комбинации с антиоксидантами в виде ректальных суппозиториев, показавший высокую эффективность в отношении широкого спектра вирусов. В настоящий момент препарат зарегистрирован на территории РФ в качестве лекарсвтенного средства под торговым названием Виферон.
Данная работа являете продолжением работ Малтновской В.В. в области создания комбинированных лекаревтенных форм на основе интерферона и антиоксидантов, обладающих широким спектром противовирусной активности.
Цель исследования: разработать новую пролонгированную лекарственную форму для местного применения, обладающую широким спектром противовирусной активности на основе интерферона в комбинации с антиоксидантами и другими вспомогательными веществами.
Задачи исследования:
1. Обосновать состав и изучить взаимодействие основных и вспомогательных компонентов и их концентрационных соотношений с целью обеспечения необходимых физико-химических, биологических и фармацевтических свойств новой лекарственной формы.
2. Изучить активность новой лекарственной формы на модели культуры клеток с использованием эталонных штаммов вирусов простого герпеса первого и второго типа, аденовируса и вирусов гриппа.
3. Изучить активность новой лекарственной формы на модели с использованием культуры клеток против вирусов простого герпеса и вирусов гриппа с лекарственной устойчивостью к противовирусным препаратам.
4. Изучить эффективность новой лекарственной формы в отношении клинических изолятов вируса простого герпеса и эпидемических штаммов вирусов гриппа сезона 2006 - 2007 года.
5. Исследовать возможность сочетанного применения новой лекарственной формы и других противовирусных препаратов (аналогов нуклеозидов, аналогов пирофосфатов, блокаторов кальциевых каналов), активных в отношении вирусов герпеса и гриппа. Оценить эффективность комбинации новой лекарственной формы и противовирусных препаратов в отношении вирусов герпеса и гриппа.
Научная новизна:
1. В опытах in vitro показано, что комбинация интерферона альфа-2 человеческого рекомбинантного, выбранного комплекса антиоксидантов, стабилизаторов активности интерферона, полимера-пролонгатора и других вспомогательных веществ позволяет усилить специфическую противовирусную активность интерферона в несколько раз. Так в отношении ВПГ-1 штамм Л2 комплексный состав препарата обеспечивает усиление специфической противовисруной активности в
3,85 раза.
2. Установлено, что противовирусная активность разработанной лекарственной формы зависит от концентрации препарата, схемы внесения препарата и множественности инфицирования. Наиболее сильно противовирусный эффект препарата проявляется при предварительном внесении до инфицирования, что свидетельствует о потенциале лекарственной формы в качестве профилактического средства.
3. Выявлена значительная противовирусная активность новой лекарственной формы в отношении широкого спектра вирусов (вирусов простого герпеса, гриппа и
аденовируса), в том числе по отношению к вирусам с лекарственной устойчивостью к химиотерапевтическим препаратам а так же в отношении клинических изолятов вирусов.
4. Установлено, что разработанная лекарственная форма составляет эффективные комбинации со многими противовирусными препаратами, причем с некоторыми из них комбинирование носит синергидный характер: при совместном присутствии препаратов концентрации, обладающие противовирусной активностью значительно ниже, чем таковые для взятых в отдельности соединений.
Практическая значимость
1. Разработан состав новой пролонгированной лекарственной формы широкого спектра действия на основе интерферона альфа-2 человеческого рекомбинантного в комплексе с антиоксидантами и другими вспомогательными веществами, стабильный в процессе хранения и удобная для применения про многих формах вирусных инфекций.
2. Полученные данные о значительной противовирусной активности новой лекарственной формы в отношении различных видов вирусов (грипп, аденовирус,
герпес) позволят проводить эффективную терапию инфекции в случаях, когда клинические симптомы заболевания не позволяют точно установить диагноз без серодиагностики возбудителя.
3. Показана значительная противовирусная активность разработанной лекарственной формы в отношении вирусов с лекарственной устойчивостью к химиопрепаратам, что позволит проводить терапию инфекции при неэффективности общепринятой химиотерапии.
4. Разработанная лекарственная форма интерферона альфа-2 человеческого рекомбинантного позволит проводить местную противовирусную терапию в тех областях клинической медицины, где ранее местная терапия препаратами интерферона не проводилась: в гинекологии при лечении герпес - ассоциированных эндометритов у женщин, а так же в урологии при лечении герпетических уретритов у мужчин и женщин.
5. Возможность комбинирования новой лекарственной формы с другими химиотерапевтическими препаратами позволит снизить терапевтические концентрации лекарственных соединений и, следовательно, избежать проявления побочных токсических эффектов при высокой эффективности терапии.
Внедрение результатов работы Состав разработанной лекарственной формы защищен патентом РФ RU 2270692 «Пролонтгированный раствор интерферона». В настоящий момент новая лекарственная форма проходит регистрацию на территории Российской Федерации в соответствие с действующим законодательством. В соответствие с требованиями Закона о лекарственных средствах РФ в Научно-исследовательском центре токсикологии и гигиенической регламентации биопрепаратов были проведены исследования общетоксического и аллергенного действия разработанной лекарственной формы на половозрелых и неполовозрелых животных. В результате проведенного исследования установлено, что препарат не обладает выраженными токсическими свойствами, не проявляет аллергизирующего и иммунотоксического воздействия, что даёт основание на проведение дальнейших клинических исследований эффективности и переносимости.
Апробация работы Материалы диссертации доложены на конгрессе «Человек и лекарство», г. Москва' в 2007 году; на международном симпозиуме общества исследователей интерферонов и цитокинов в Оксфорд, Англия в 2007 г; По материалам диссертации опубликовано научных работ в отечественной и зарубежной печати, а также получен патент РФ RU 2270692 «Пролонтгированный раствор интерферона».
В завершенном виде результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на заседании научной конференции отдела интерферонов ГУ НИИЭМ им.
Н.Ф.Гамалеи РАМН 6 марта 2008 года.
Структура диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, пяти глав, содержащих результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы и практические рекомендации, указателя литературы: изложена на 155 страницах машинописного текста, иллюстрирована 37 таблицами и 15 рисунками. Список литературы состоит из 218 работ отечественных (123) и зарубежных авторов (95).
Похожие диссертации на Антивирусная активность новой лекарственной формы интерферона для местного применения
