Введение к работе
I.I. Актуальность теш. Значительный экономический ущерб животноводству наносят болезни молодняка: колибактерпоз„ анаэробные инфекции, стафшюкоккозн п сгрептококкозн.
Условнопатогенные микробы* которые прп экстенсивном способе ведения пивотноводства не представлял! особой опасности, яря интенсивной системе содержания глвогных резко усилило своя вирулентность.
В крупных ятвотноводческлд комплексах циркулируют множество вирулентных сарогрупп килечной палочки, патогеяность которых нельзя объяснить одним только понижением резистентности ялвог— ных или пассированием через' восприимчивый организм. Если учесть, что в желудочно-кишечном тракте кивотных наряду с кишечной палочкой присутствуют анаэробные микроорганизмы, то при определенных условиях биоценоза меяду ниш» по-видимому, мокет происходить обмен генетическим материалом и передача патогенных свойств.
Токсигенностъ анаэробных бактерии обусловлена плаэмидной ДНК / Rood J. et al , 1978; Donald 1. et al , I984j Charles H,-
et al , 1984/„ которая локализована в клетке автономно (не исклочено интегрирование с хромосомой). Она з мокат переноситься от анаэробов к е.соіі к стафилококкам. Кисечная палочка, имея селективные превмущоства размножения в келудочно-кишзчяоы трак-то , вызывав? соотввтсгвусзне заболевания у человека и япвогпых.
Несмотря ка го, что биологические свойства анаэробных микроорганизмов с сзерпхпй п стафилококков хороио изучены, механизмы возникновензя колявкЗйкцяй недостаточно вскрыты, отсутствуй? данные о возможном влпянип гоксягэкных анаэробов на патогенные
и другие свойства сои и стафилококков.
Изучение этих вопросов позволят раскрыть механизм развития эшерихиозов, разработать средства профилактики и лечения коли-бакгериоза новорожденных животных, выяснить знехромосомнуг и хромосомную наследственность клостридий, эшернхий и стафилококков.
1.2. Цель и задачи .работы. Целью исследования является изу
чение возможности передачи различных биологических свойств - па
тогенносте, гемолитической активности, антигенных,детерминант,
ферментативной способности, резистентности к антибиотикам от
ТОКСИГвННиХ КЛОСТрЩЩЙ / Cl.perfringene, Cl.eepticum, Cl.oedema-
tiene, Cl.chauvcei / к эшврихсям и стафилококкам. В coos-
вегствіїи с отим на разрешение были поставлены следуюіпне задачи:
-
Остановить возможность передачи патогенных, геыолигя-іеских, антигенных, ферментативных свойств, устойчивости к антибиотика?: с помощью коїшогации и трансформации от токснгенвых :слосгридий к эшерихням и стафилококкам,
-
Установить возможность передачи гемолитических, формеїь-тативннх свойств, устойчивости к антибиотикам о? патогенных анаэробов к этеряхиям и стафилококкам при совместном заморашіаа-гаш.
-
Изучить иымуногвнше свойства рекомбинантов E.coli и огалоивлх штаммов токснгонных клостридий и кх протективнув активность г опта эшарнхиозов.
1.3. } іучвая новяана результатов. Изучается возможность
переноса ра зліг -них свойств о? гохсигопных анаэробных гакрооргв-
їіззїюв к вдгорахням и стафилококкам.
Обнаружена передача патогенних свойств, геаголитнческоЛ активности, антигенных двтершван*, ферментативных свойств в ус-
.- з -
ойчивосги к антибиотикам or вирулентных клосгридий к эшарахиям : стафилококкам; при этом патогенные свойства ггреимупественно :ервносягся конъюгацией - трансформация для этой цели менее ригодна, но во реализуется передача гемолитических и фврмвнга-изных свойств, а также рвзясгвнтносгь к антибиотикам. Эти приэ-акя передаются, в частности, при совместном замораживании клос-ридий с эшерихиямн я клосгридий с стафилококками.
Доказана возможность получения гибридных штатов с иолвз-зыи саойсгзаг.я в результате скрещивания гоксигенных анаэробов эшерюсиямя, передачи при этом антигенных свойств, характерных ія клосгридий, что позволило изготовить вакинн, обладавшие .імуногенними свойствами против клосгридиозов и эшерихиозов, а ікло лочобнно гипериммушшо сыворотки.
Разработана методика скрощиванля анаэробных мнкрооргянизів с эиерихилш и стафплокоюеамтг в 'їязиологячоском растворо ici . Разработана гакзо we годика солвісплснирооянпя рокопбп-нтов E.coli из органлзга іЕтяпх мшоіі, шкгтптроваїшнх смэсьп :остридий с зперютяш. Впервые показана возмоглоегь непользе— нля вакцины протав колябактеряоза новорожденных ллвоттгх, яз-говлэнноЯ из вирулентны;: эталонны:: ягажоп клоетрггдий. Обнару-на антигенная связь иетпгу токспгоштак анаэроба»*! я эгаеряхия-, токспгоннкгя аіпзробаг-і и сгаїТклококкак:. токспгзнгап.ст аназ-баш я сгролтококга?.::-;.
1.4. Практическая значимость работы» Продлит ог/зя работа зволя? более углубленно попить воптюск згпологлг заевихиозоз гозиций внохромосог.згои г. хрог.гасог,:яо;ї юсладствонностк гзкду зоробішл: гпфооргагпізг'г.":, r-mpxizv-nr: і: о?зсТ?!лококкз1.;:и с сг.о вопроси тонно;: нігсоноршг с цольп долучання ятэ».с;оз ir.ntpo-танззмов с полезнигд свойсгх-nrr., усовершенствовать прсфгляк-
- 4 -гику и лечение новорожденных животных при коли бактериоз е.
Результаты исследования коренный обраэоы изыендат имеющив-ся до сих пор представления о вирулентности к.соіі и стафилококков и дают совераенно новое направление исследованиям в области инфекционной патологии и генетики этих микроорганизмов. Теоретические обобцвния, основанные на экспериментальных данных, позволили изготовить вакцины и сыворотки для профилактика и лечения эшерихиозов.
-
Публикация. По материалам диссертации опубликовано 18 работ.
-
Объем работы. Диссертация изложена на 367 страницах машинописного текста, иллюстрирована 55 таблицами, 26 фотографиями. Список цитированной литературы включает 349 источников, а том числе, 209 отечественных.
Возможность передачи свойства токсинообразовакия, гемолитической активности, антигенных свойств, ферментативной активности, резистентности к антибиотикам и др. изучили на модели токсигенных анаэробов, эшерихии и стафилококков. При этой направляющими били штаммы клострпдий.
. Для экспериментального доказательства существования спонтанного переноса различных свойств от патогенних клостридий к эшерихияы і стафилококкам использовали как эталонные штаммы указанных микроорганизмов, так и культури, выдалонные из объектов анеяшей среды и организма животных.
В опытах по переносу ніу и Ent факторов, антигенных свойств огаммы доноров (клостридий), как правило, были ток'^я-гегошш, жмыуногенныда, а культуры реципиентов полностью лише-
.-5-ны этих свойств, не имеют общих антигенов с донорами. Штамм* доноров к реципиентов отличалась также по чувствительности к различным антибиотикам. В качестве питательной среды использовали Кнтт-Таровди, бульон Хоттингера, МПБ, МЖ, глюкозокровяной агар, агар Эндо. Конъюгацию между анаэробами, эоерихнями s стафилококками ПРОВОДИЛИ ПО Ваганабе /1961/, Saemnan /1969/, дж.Миллер /1976/; идентификацию бактерий, синтезирующих гемолизин, осуществляли по Госбел, Ройер, Покора н др. /1974/; идентификацию бактерий, синтезирующих экзотоксин, - заражением белых мышей культурами рекомбинантов в брюшную полость.
Ввиду того, что не разработана стандартная методика скрещивания токсигенных анаэробов с аэробными видами бактерий, в зависимости от цели эксперимента, внесены соответствующие изменения в них, в частности, в одном случае конъюгация осуществлена в 0,15 II растворе н*С1 , в другом - на полноценной среде о последующим заражением я отбором рекомбинантов в организме павших подопытных животных с целью лучшего селекционирования клонов с сообщенным свойством токсинообразования.
Достоверность передачи токсигенных свойств штаммам реципиентов контролировала икыунологическн. Для этой цели использовали диагностические сыворотка ci.perfringena , изготовлен-ныв Алма-Атинским биокомбннатоы, и гиперяшунные кроличьи сыворотка, получаемые наш. Ставили реакции нейтрализация п агглютинации. В РН антитоксические снвороют, гомологичные типу донорного штата, нейтраягзогалн культуры рекомбинантов о? соответствующих кроссов. В пробирочной РА пологатольннй результат получала о гомологячезйз топу донора сыворотками.
Спонтанную трансдукцпэ псклшчаян добавлением it культурам реципиентов Зяльтрагов культур допоров, а трансфор*лацЕЛ - до-
бавланием к смеси клеток донора я реципиента ДКК-азы.
Перед лоегалоакоЯ опытов у всех испытуешх. пгаммов изучали морфологические, биохимические, гемолитические, вирулентные и аитигешше свойства, отношение к отдельным антибиотикам, ауксо-трофность.
.Трансформацию изучали по мотке резистентности к стрептомицину и передаче Hly -фактора. Пред-даритель но определяли чувствительность к антибиотикам мотодом серийных раззэдений и методом дифбузни в агар с примвненяим дисков, содержа,цих антибиотики, согласно методическим указаниям, утвержденным ГУВ МСХ СССР /1972/.
Для получения сгрбпгомицинорезистенгных вариантов пользе- , валясь методиками Д.Г.Кудлай /1950/, Сцибальского и Бризона /1952/, методом реплик /Д.Ледерберг, Э.Леберберг, 1952/,
Изолирование ДЯК из бактериальных клеток проводили по методике Мармура /1961/.
Опыты по трансформации ставили в соответствии методикам, описанным Эвери с сотр. /1944/ и Мармур /1961/.
Проводили сравнительное изучение иммуногеняых свойств культур реципиентов, доноров, грансконъюгантов и трансформантов. Вакцины для иммунизации готовили по общепринятой методике, проверяли ах на стерильность, безвредность и активность. Формол-вакцши животным вводила подкожно двукратно, с интервалом в 12 дней мену*,, первой и второй инъекцией. Степень напряженности иммунитета у вакцинированных животных проверяли чороз 21-22 дня поело окончания иммунизации. Контрольное зараконло проводили различными дозами культуры. Активность сыворотки крови иммунизированных животных проверяли методой нейтрализация культуры черэз 21-22 дня после окончания иммунизации. Ультраструктуру
КЛ9Т0К КЛООГРЯДИЙ Изучали ПО HJter, , Kellenberger и др. ДЭ58/, Kellenberger /I960/, Mc.Quillen /1965/ и др. По разработанной нами методике готовили препараты для обнаружения конъюгирующихся клеток.
