Содержание к диссертации
Стр.
СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ 4
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА 1. Иммунная дисфункция при персистенции
патогенных стафилококков (обзор литературы) 15
Дисбактериоз кишечника: микробиологические и иммунологические аспекты 15
Золотистый стафилококк: биология микроба, его патогенный и персистентный потенциал, иммунотропные эффекты 24
Функциональная характеристика нейтрофильных гранулоцитов при стафилококковых поражениях 43
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 66
2.1 .Иммунологические методы 67
Микробиологические методы 93
Статистические методы 99
ГЛАВА 3. Характеристика иммунологических сдвигов у пациентов с дисбактериозом кишечника, ассоциированным
с Staphylococcus aureus 100
ГЛАВА 4. Персистентные характеристики копроизолятов золотистых стафилококков при стафилококк-
ассоциированном дисбактериозе кишечника 109
ГЛАВА 5. Влияние факторов персистенции золотистых
стафилококков на хемотаксический ответ нейтрофилов при
экспериментальной стафилококковой инфекции 115
ГЛАВА 6. Характер хемотаксического ответа нейтрофилов
на золотистые стафилококки, обладающие различной
активностью факторов персистенции 127
Влияние перистирующих штаммов стафилококков на нейтрофилы практически здоровых людей 127
Особенности хемотаксического ответа нейтрофилов пациентов с кишечным дисбактериозом
на золотистый стафилококк 134
6.3. Влияние перистирующих штаммов
стафилококков на хемотаксический ответ
нейтрофилов пациентов с дисбактериозом кишечника,
ассоциированным с S.aureus 139
ГЛАВА 7. Анализ влияния факторов персистенции золотистого стафилококка на продукцию цитокинов лейкоцитами периферической крови практически здоровых
лиц 144
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 156
ВЫВОДЫ 173
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 175
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 177
СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ
АЛА - антилизоцимная активность
АФ - активность фагоцитоза
АЭ - активность неспецифических эстераз
ГА - гемолитическая активность
ГАЛТ - гастро-ассоциированная лимфоидная ткань
ИАД - индекс адгезии
ИАЭ - индекс активности неспецифических эстераз
ИВ - индекс влияния
ИРИн - индекс резистентности к интерциду
ИРТКБ - индекс резистентности к тромбоцитарному катонному
белку
ИСЛЛ - индекс суммарной люминесценции лизосом
ИСЦК - индекс суммарного цитохимического коэффициента
эстеразной активности
ИХК - индекс хемокинеза
ИХТ - индекс хемотаксиса
КОЕ - колониеобразующая единица
ЛА - лизоцимная активность
ЛПС - липополисахарид
НСТ-тест - тест восстановления нитросинего тетразолия.
С5а-ФК - С5а фрагмент комплемента, анафилотоксин
СМА - спонтанная миграционная активность
СН50 - активность комплемента по 50% гемолизу
СЦК - суммарный цитохимический коэффициент эстеразной
активности
ФГА - фитогемагглютинин
ФИ - фагоцитарный индекс
ФЧ - фагоцитарное число
ЦИК - циркулирующие иммунные комплексы
CD - кластер дифференцировки
IFN - интерферон
IgA - иммуноглобулины класса А
IgG - иммуноглобулины класса G
IgM - иммуноглобулины класса М
IL - интерлейкин
Th - Т-хелпер
Введение к работе
Актуальность проблемы
Изучение микроэкологии человека относится к одному из наиболее актуальных направлений медицинской науки и практики. Это обусловлено открытием важнейшей роли нормальной микрофлоры организма человека, покрывающей в виде биопленки кожу и слизистые оболочки, в регуляции всех жизненно важных процессов целостного организма. На сегодняшний день можно уверенно говорить, что нет ни одной функции организма, на которую прямо или косвенно не влияло бы состояние микробиоценоза человека (Бондаренко В.М., Мацулевич Т.В., 2007; Дисбиоз кишечника..., 2007).
В настоящее время активно обсуждается роль изменений состава и активности микробиоценоза в патогенезе широкого круга заболеваний человека, что хорошо отражает постоянно возрастающее число научных публикаций по данной проблеме (Кулагина Е.П., 1995; Паршута Л.И., 1998; Бухарин О.В. и др., 2005). Следует признать, что у врачей различных специальностей представления о роли нормальной микрофлоры, причинах её изменений, подходах к коррекции дисбиотических расстройств нуждаются в постоянном совершенствовании.
Обсуждая вопросы микроэкологических нарушений, то есть дисбактериоза, кишечника и их роли при различных инфекционных и соматических заболеваниях, многие клиницисты ограничиваются рассмотрением гастроэнтерологической патологии. Такое положение сложилось исторически и связано с двумя обстоятельствами: во-первых, желудочно-кишечный тракт имеет наиболее представительный и относительно изученный состав нормальной просветной и пристеночной микрофлоры (395 филогенетически обособленных групп или филотипов),
во-вторых, микроэкологическое состояние пищеварительной системы оказывает огромное влияние на основные физиологические функции макроорганизма. Дефицит основных представителей микробиоты, в первую очередь бифидобактерий и лактобацилл, может приводить к различным негативным последствиям. Так, микробиоценозы кишечника принимают непосредственное участие в осуществлении трофостата организма, то есть в поддержании постоянства снабжения его питательными веществами, в создании эффективного местного и системного иммунитета и в функционировании гормональной системы человека.
Дисбиозная микрофлора желудочно-кишечного тракта может оказывать отрицательное влияние на жизнедеятельность и состояние организма человека. Многочисленные данные свидетельствуют о вовлеченности дисбиотических изменений кишечной флоры в патогенез целого ряда заболеваний, таких как синдром раздраженной кишки, ишемическая болезнь сердца, атеросклероз, ожирение, дислипопротеидемия, онкопатология различной локализации, аллергопатология, поражения кожи и другие заболевания, ассоциированные с нарушением функционирования иммунной системы (Дисбиоз кишечника..., 2007).
Staphylococcus aureus, будучи хорошо изученным микроорганизмом, продолжает привлекать внимание микробиологов и врачей всех специальностей. Интерес к данным бактериям обусловлен их важным биомедицинским значением. Стафилококки, как неотъемлемый элемент практически всех микробиоценозов организма человека, не только участвуют в обеспечении колонизационной резистентности макро организма, но также являются инициаторами инфекционно-воспалительных процессов любой локализации
(Петровская В.Г., Марко О.П., 1976). В то же время открытым остается вопрос о патогенетическом значении обнаруженной у микроорганизмов, в том числе S.aureus, группы свойств, отражающей способность бактерий инактивировать отдельные факторы иммунитета макроорганизма (лизоцим, система комплемента, катионный белок тромбоцитов, катионный белок лейкоцитов "интерцид") и, соответственно, представленной антилизоцимным, антикомплементарным, антибетализиновым и антиинтерцидным признаками (Бухарин О.В., 1994; Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., 1996, Бухарин О.В. и соавт., 2002). Фактический материал, накопленный преимущественно при изучении взаимодействия с макроорганизмом шигелл, сальмонелл, менингококков и эшерихий, свидетельствует о существенном вкладе этих свойств в формирование хронических форм инфекции и бактерионосительства, что дало основание рассматривать их в качестве факторов, определяющих персистентный потенциал бактерий (Бухарин О.В., 1999). Следует отметить, что практически любая форма дисбактериоза кишечника может сопровождаться стафилококковой бактериемией (КрасноголовецВ.Н., 1989).
Показано, что при длительном течении нарушение микробиоценоза приводит к изменениям иммунологического статуса по типу вторичного иммунодефицита, клиническим проявлением которого являются рецидивирующие и хронические воспалительные заболевания, обусловленные условно-патогенными микроорганизмами (Билибин А.Ф. и др., 1975; Башмаков М.А., 1977; Красноголовец В.Н., 1989; Бондаренко В.М., Мацулевич Т.В., 2007). Нарушение микробного пейзажа приводит к изменению реактивности иммунной системы, что способствует возникновению аллергических поражений кожи, органов дыхания и пищеварительной системы (Воронцов И.М., Маталыгина
O.A, 1986; Чарыева B.P., 1985; Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 1999). Объективная оценка лабораторных показателей иммунитета и активности фагоцитов у больных с поражениями иммунной системы при дисбактериозе кишечника, вызванном условно-патогенными микроорганизмами, остается на сегодняшний момент наименее разработанной. Характер изменений фагоцитарной, хемотаксической и хемокинетической активности нейтрофилов подробно изучен при многих гнойно-воспалительных процессах при острой патологии и травматической болезни (Зурочка А.В., 1991; Студеникина Ю.Н., 2000; Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001; Злакоманова О.Н., 2002). Отмечено снижение противомикробной активности нейтрофилов к патологическим бионтам при дисбактериозе (Парцалис Е.М., Ревякина В.А., 1983), которое может быть как первичным, так и вторичным. С точки зрения клинико-лабораторной оценки, поражения иммунной системы на фоне дисбактериоза являются наиболее сложными для верификации иммунологического диагноза и требуют индивидуальной тактики ведения больного и иммунокоррекции этих состояний, где важную роль играют именно нейтрофилы, как наиболее мобильные клетки, обеспечивающие первую линию защиты от инфекции. Однако функциональная активность нейтрофилов по отношению к условно-патогенным микроорганизмам на данный момент изучена недостаточно. На сегодняшний день больные с дисбактериозом кишечника являются сложной группой для понимания врачей-клиницистов и, нередко, неэффективно лечатся у разных специалистов (гастроэнтерологов, аллергологов-иммунологов, инфекционистов). Вероятно, они имеют определенный дефект функции клеток иммунной системы, приводящий к длительно протекающему нарушению микробиоценоза. Кроме того, у таких больных необходимо решить
вопрос о патогенетической значимости бактериального агента в поддержании хронического патологического процесса.
Все это и послужило обоснованием цели настоящего исследования.
Цель и задачи исследования
Целью настоящего исследования явилась оценка состояния иммунной системы и изучение влияния стафилококков с различной активностью факторов персистенции на хемотаксис нейтрофилов и иммунную систему у пациентов с дисбактериозом кишечника, ассоциированным с золотистым стафилококком.
Для достижения этой цели нами были поставлены следующие задачи:
Оценить характер изменений показателей иммунной системы у пациентов с дисбактериозом кишечника, ассоциированным с золотистым стафилококком.
Определить наличие и выраженность ряда биологических, в том числе персистентных, характеристик, у копроизолятов S. aureus, выделенных от пациентов с дисбактериозом кишечника.
Изучить влияние золотистых стафилококков с разными персистентными свойствами на хемотаксис нейтрофилов при экспериментальной гнойной инфекции стафилококковой этиологии.
Охарактеризовать особенности хемотаксической реакции нейтрофилов периферической крови на S. aureus с различной выраженностью факторов персистенции в норме и у пациентов
с дисбактериозом кишечника, ассоциированным с золотистым
стафилококком.
5. Проанализировать характер влияния продуктов секреции
золотистых стафилококков с персистентными
характеристиками на продукцию цитокинов лейкоцитами периферической крови.
Положения, выносимые на защиту
При дисбактериозе кишечника нарушаются механизмы вовлечения в воспалительную реакцию лимфоцитов, и формируется дисбаланс иммунной системы, о чем свидетельствует уменьшение содержания CD3+-, CD4+- и СВ8+-лимфоцитов, снижение соотношения CD4/CD8 и количества CD1 lb-позитивных лимфоцитов.
Золотистые стафилококки, персистирующие в кишечнике человека при дисбактериозе, характеризуются своеобразными биопрофилями, особенностями которых являются редкое наличие у копроштаммов S.aureus антилизоцимного признака, частое присутствие у них лизоцимной и гемолитической активности и вариабельный уровень устойчивости к бактерицидному действию катионных белков лейкоцитов и тромбоцитов человека.
Дисбактериоз кишечника, ассоциированный с персистирующими S.aureus, сопровождается угнетением хемотаксических реакций нейтрофилов, нарушением ферментативных и кислородзависимых механизмов киллинга фагоцитированных микроорганизмов. При этом преимущественно страдают хемотаксис и адгезия.
4. Персистирующие стафилококки активируют компенсаторно-приспособительные системы макроорганизма, направленные на преодоление хронического инфекционного процесса и мобилизацию механизмов регуляции по ТЫ-типу, что сопровождается угнетением продукции IL4 при стимуляции продукции ПЛр и IFNy, что свидетельствует снижении функциональной активности Т1і2-лимфоцитов.
Научная новизна
Впервые показано, что персистирующие в кишечнике человека золотистые стафилококки характеризуются различной устойчивостью к катионным белкам лейкоцитов ("интерцид") и тромбоцитов (тромбодефенсины). Среди копроштаммов S. aureus большинство изолятов проявляет относительно высокую чувствительность к указанным катионным белкам, но часть культур обладает высокой устойчивостью и даже "супер-резистентностью" к их бактерицидному действию.
Впервые установлено, что у пациентов с кишечным дисбактериозом (при вегетировании в кишечнике золотистых стафилококков с различной экспрессией факторов персистенции) наблюдаются разнонаправленные иммунопатологические процессы и выраженные изменения функциональных характеристик фагоцитов крови, которые могут способствовать персистенции потенциально патогенных микроорганизмов, в том числе S. aureus. При этом выявлен ряд закономерностей, характерных для больных с дисбактериозом кишечника, ассоциированным с S. aureus: подавление экспрессии мембранных молекул CD3, CD4, CD8, CD10, CD34 и CDllb на лимфоцитах периферической крови; угнетение хемотаксических
реакций нейтрофилов, снижение их ферментативной (эстеразной) и кислородзависимой киллинговой активности; ингибирование у мигрирующих нейтрофилов продукции молекул CD lib и CD 13, что в совокупности свидетельствует о существенных нарушениях механизмов вовлечения лимфоцитов и нейтрофилов в процесс элиминации патологических агентов. Подана заявка на патент РФ «Способ выявления нарушения функции фагоцитов при развитии рецидивирующих инфекционных процессов».
Впервые обнаружено, что в процессе формирования
дисбактериоза кишечника при селекции золотистых стафилококков
происходит изменение специфики взаимодействия между
персистирующей флорой и иммунной системой макроорганизма.
Характер этого взаимодействия, с одной стороны, носит позитивно-
приспособительную направленность для микроорганизмов (избегание S.
aureus бактерицидных и фагоцитарных систем), с другой стороны,
отражает активацию компенсаторно-адптивной системы
макроорганизма, нацеленную на преодоление развития хронического инфекционного процесса и мобилизацию механизмов регуляции по ТЫ-типу. Об этом, в частности, свидетельствуют особенности продукции цитокинов лимфоцитами крови (угнетение продукции IL4 на фоне стимуляции продукции 1Ы(3 и IFNy) под влиянием фильтратов копроштаммов S. aureus, изолированных от больных с дисбактериозом кишечника.
Теоретическая и практическая значимость
Теоретическая значимость результатов исследования состоит в расширении знаний о характере иммунологических нарушений и особенностях функциональной активности нейтрофилов у пациентов с дисбактериозом кишечника, ассоциированным с золотистыми стафилококками, обладающих разной выраженностью персистентных свойств.
Выявленные угнетение хемотаксической и ферментативной активности нейтрофилов и зафиксированные разнонаправленные изменения состояния иммунной системы при дисбактериозе кишечника в зависимости от выраженности факторов персистенции S. aureus позволят разработать рациональные подходы к этиотропной и патогенетической терапии данной патологии, которая должна быть направлена на элиминацию из кишечника стафилококков и одновременную коррекцию нарушений функции клеток, участвующих в противоинфекционной защите организма, путем восстановления хемотаксической, поглотительной и киллинговой функций фагоцитов, а также переключение иммунного ответа с ТЫ- на Тп2-тип реагирования (активация В-лимфоцитов), с учетом индивидуальной активности основных провоспалительных и противовоспалительных цитокинов.
Апробация работы
Результаты проведенных исследований доложены и обсуждены на Всероссийском научном Форуме имени академика В.И. Иоффе Дни иммунологии в Санкт-Петербурге «Молекулярные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунотерапии» (г. Санкт-Петербург, 2005, 2006, 2007), Конференции иммунологов Урала (г. Челябинск, 2003; г. Оренбург, 2006), Российской научной конференции «Персистенция микроорганизмов» (г. Оренбург, 2006). Работа была поддержана грантами Правительства Челябинской области (2004, 2006).
Апробация диссертации была проведена на совместном заседании НИИ иммунологии ЧелГМА, кафедры микробиологии ЧелГМА, самостоятельного курса клинической лабораторной диагностики ЧелГМА, ЦНИЛ ЧелГМА (2007).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 5 в центральной печати из перечня, рекомендованного ВАК.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 199 страницах машинописного текста и содержит введение, обзор литературы, материалы и методы, 5 глав собственных исследований, заключение, выводы, практические рекомендации, список литературы. Указатель литературы включает 117 отечественных и 57 иностранных источников. Иллюстрации представлены 27 таблицами и 4 фотографиями.
\
