Содержание к диссертации
Введение 8
Глава I. Факторы местной противоинфекционной защиты на уровне
репродуктивного тракта женщин (обзор литературы) 14
1.1. Локальные факторы противоинфекционного иммунитета 14
1.2. Нейтрофилы и их значение в защите репродуктивного тракта
женщины 19
1.3. Апоптоз как один из механизмов гибели клеток 30
Глава II. Материалы и методы исследования 44
Общая характеристика обследованных 44
Микробиологические методы исследования 44
Метод выделения неитрофилов венозной крови 44
2.4. Метод забора материала из цервикального секрета
репродуктивного тракта женщин 45
2.5. Методы изучения жизнеспособности нейтрофильных
гранулоцитов периферической венозной крови 45
2.5.1. Метод определения жизнеспособности неитрофилов 45
2.5.2. Определение апоптоза по методу Gasiorowski К. с соавторами
(2001г.) 47
2.5.3. Метод оценки апоптоза с помощью проточной цитометрии 48
2.6. Исследование функциональной активности нейтрофильных
гранулоцитов периферической венозной крови 49
2.6.1 Метод исследования фагоцитарной активности неитрофилов
периферической крови 49
Метод определения внутриклеточного кислородозависимого метаболизма неитрофилов периферической крови с помощью НСТ-теста 50
Метод определения активности лизосомальных ферментов неитрофилов периферической крови 52
2.7. Метод получения секреторных продуктов неитрофилов 54
Метод определения бактерицидной активности нейтрофилов и их секреторных продуктов. Упрощенный фотонефелометрический метод определения бактерицидной активности по О.В Смирновой и Т.А. Кузьминой 54
Определение бактерицидных компонентов в продуктах секреции
нейтрофилов 56
2.9.1.0пределение оксида азота в супернатантах нейтрофилов
интактных и активированных контрольными штаммами
микроорганизмов по содержанию нитратов и нитритов (Н.Л. Емченко с
соавт., 1994 г.), в модификации Э.Н. Коробейниковой (2002 г) 56
2.9.2. Определение активности пероксидазы в супернатантах
нейтрофилов интактных и активированных контрольными штаммами
микроорганизмов (Т.Попов, Л. Нейковска) 58
2.9.3. Определение активности каталазы в супернатантах нейтрофилов
интактных и активированных контрольными штаммами
микроорганизмов по М.А. Корелюк с соавт. (1988), в модификации Э.Н.
Коробейниковой (2002 г) 60
2.10. Методы статистической обработки материала 60
Глава III. Функциональный ответ нейтрофилов периферической крови
после взаимодействия с латексом различными видами
микроорганизмов, цервикальной слизью и муцином 61
3.1. Оценка жизнеспособности нейтрофильных гранулоцитов
периферической крови после взаимодействия с частицами латекса,
Lactobacterium spp., Bifidobacterium spp., S. aureus, E. coli,
цервикальной слизью и муцином 61
3.2. Оценка апоптоза нейтрофильных гранулоцитов периферической
крови после взаимодействия с частицами латекса, Lactobacterium spp.,
Bifidobacterium spp., S. aureus, E. coli, цервикальной слизью и
муцином 64
3.3. Оценка функциональных свойств нейтрофильных гранулоцитов периферической крови после взаимодействия с частицами латекса, Lactobacterium spp., Bifidobacterium spp., S. aureus, E. coli и муцином...
Глава IV. Влияние супернатантов нейтрофилов, интактных и
активированных S. aureus (штамм 209), Е. coli (штамм М-17),
Lactobacterium spp., Bifidobacterium spp. на эталонные штаммы Е. coli
(штамм М-17), S. aureus (штамм 209), Lactobacterium spp.,
Bifidobacterium spp 76
Изучение бактерицидного действия супернатантов интактных нейтрофилов на Е. coli (штамм М-17), S. aureus (штамм 209), Lactobacterium spp., Bifidobacterium spp 77
Изучение бактерицидного действия супернатантов нейтрофилов, активированных S. aureus (штамм 209), на Е. coli (штамм М-17), S. aureus (штамм 209), Lactobacterium spp., Bifidobacterium spp 80
Изучение бактерицидного действия супернатантов нейтрофилов, активированных Е. coli (штамм М-17), на Е. coli (штамм М-17), S. aureus (штамм 209), Lactobacterium spp., Bifidobacterium spp 83
Изучение бактерицидного действия супернатантов нейтрофилов, активированных Lactobacterium spp. на эталонные штаммы бактерий Е. coli (штамм М-17), S. aureus (штамм 209), Lactobacterium spp., Bifidobacterium spp 86
Изучение бактерицидного действия супернатантов нейтрофилов, активированных Bifidobacterium spp. на эталонные штаммы бактерий Е. coli (штамм М-17), S. aureus (штамм 209), Lactobacterium spp.,
Bifidobacterium spp 89
Глава V. Оценка концентрации метаболитов оксида азота (нитратов и
нитритов), активности пероксидазы и каталазы в супернатантах
нейтрофилов, интактных и активированных Е. coli (штамм М-17),
S. aureus (штамм 209), Lactobacterium spp., Bifidobacterium spp 94
5.1. Оценка содержание конечных продуктов метаболизма оксида
азота в супернатантах неитрофилов, активированных и не
активированных . coli, S. aureus, Lactobacterium spp., Bifidobacterium
spp 95
Изучение активности пероксидазы в супернатантах неитрофилов интактных и активированных Е. coli, S. aureus, Lactobacterium spp., Bifidobacterium spp 97
Изучение активности каталазы в супернатантах неитрофилов интактных и активированных Ё. coli, S. aureus, Lactobacterium spp.,
Bifidobacterium spp 99
Заключение 101
Выводы 116
Список литературы 118
\
Введение к работе
Актуальность проблемы
Одним из важнейших и мало изученных механизмов
антимикробной защиты является колонизационная резистентность кожи и слизистых оболочек, под которой понимают устойчивость эпителия к колонизации условно патогенными и патогенными микроорганизмами. Колонизационная резистентность обеспечивается совокупностью разнообразных факторов: на слизистых оболочках это, прежде всего, муцин, образующийся в достаточно сложный биослой. В этот биослой встроены и в нем функционируют все защитные инструменты: резидентная микрофлора, секреторные антитела, разнообразные бактерицидные молекулы, такие как лизоцим, лактоферрин, токсические метаболиты кислорода, азота и т.д. (Железная Л.А., 1998; Краснопольский В.И., Радзинский В.Е. и др., 1999; Кира Е.Ф., 2001; Кафарская Л.И., Коршунова О.В. и др., 2002; Андреева Ю.С., 2005; Гольцфарб В.М., 2005).
До сих пор не ясна роль фагоцитирующих клеток (нейтрофилов и макрофагов) в защите слизистых оболочек. Фагоциты - это тканевые клетки. На сегодняшний день достаточно хорошо изучены лишь фагоциты легочных секретов (Пигаревский В.Е., 1982; Бережная Н.М., 1988; Бакуев М.М., 1992; Маянский Д.Н., Цырендоржиев Д.Д. и др., 1996; Ройт А., Бростофф Дж., 2000; Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001). Фагоцитирующие клетки слизистых оболочек других органов изучены мало.
Особый интерес представляют механизмы защиты слизистых оболочек репродуктивного тракта женщин, поскольку, в силу особенностей строения женских половых органов, между микробнообсемененным нижним отделом и стерильной полостью матки располагается лишь слизистая пробка шейки матки, которая и сдерживает натиск огромной армии возбудителей
9 (Бодяжина, В.И., 1980; Грищенко В.И., Дахно Ф.В, 1981; Долгушина В.Ф., 1991; Теплякова М.В., Радионченко А.А., 1991; Телешева Л.Ф., 2000).
В работе Андреевой Ю.С. показано, что нейтрофилы и их секреторные продукты участвуют в регуляции измененного микробиоциноза влагалища, поскольку они подавляют рост условно патогенной флоры и мало влияют на резидентные бактерии влагалищного биотопа (Андреева Ю.С., 2005).
Тканевые нейтрофилы, закончив свой жизненный цикл, погибают. При этом определенная часть клеток подвергается как апоптозу, так и некробиозу, вероятно, в результате активации структурами микроорганизмов, составляющих резидентную микрофлору биотопа. Смерть клеток происходит после реализации их биологической программы в очаге воспаления, в нормальной ткани, после их выделения на поверхность слизистых оболочек (Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001). Остается неясным вопрос о биологическом смысле такого "марша смерти" нейтрофилов в слизистый биослой.
Мы полагаем, что нейтрофилы, покидая ткани и выходя в слизистый биослой под влиянием «факторов слизистых оболочек», погибают и выделяют биоцидные продукты, которые участвуют в регуляции микробиоцинозов, заселяющих соответствующие биотопы, в том числе и нижний отдел гениталий. В этой связи возникло предположение, что функциональные свойства нейтрофилов изменяются под влиянием муцина и микроорганизмов, содержащихся в цервикальном секрете. Данное предположение и определило цель работы.
10 Цель исследования
Изучить влияние факторов цервикального секрета (резидентной и факультативной микрофлоры, муцина) на функциональную активность нейтрофилов, их способность секретировать биоцидные продукты.
Задачи исследования
Оценить в экспериментальной модели in vitro характер изменения жизнеспособности нейтрофилов периферической крови после их активации муцином, цервикальным секретом, различными видами микроорганизмов, обычно заселяющими слизистые оболочки нижнего отдела гениталий женщины (Lactobacterium spp., Bifidobacterium spp., S aureus (штамм 209), E. coli (штамм М-17)).
Исследовать in vitro апоптогенное действие муцина, различных видов резидентных и факультативных бактерий слизистых оболочек гениталий женщины на нейтрофилы периферической крови.
Изучить функциональную активность нейтрофилов периферической крови после их активации S. aureus (штамм 209), Е. coli (штамм М-17), Lactobacterium spp., Bifidobacterium spp., муцином в экспериментальной модели in vitro.
Определить бактерицидный эффект супернатантов нейтрофилов, интактных и активированных S. aureus (штамм 209), E.coli (штамм М-17), Lactobacterium spp., Bifidobacterium spp., в отношении этих же тест-культур бактерий.
Изучить концентрацию метаболитов оксида азота (нитратов и нитритов), активность пероксидазы и каталазы в супернатантах нейтрофилов, интактных и активированных in vitro различными видами микроорганизмов.
Научная новизна
Впервые был изучен характер изменения жизнеспособности нейтрофилов периферической крови после активации различными видами микроорганизмов, а также муцином и латексом in vitro. Показано, что нейтрофильные гранулоциты погибают в результате апоптоза или некроза после их активации Lactobacterium spp. и Bifidobacterium spp., S. aureus (штамм 209), E. coli (штамм М-17). Установлено, что резидентные бактерии репродуктивного тракта женщины (Lactobacterium spp., Bifidobacterium spp.) обладают большим апоптогенным действием, чем S. aureus и Е. coli. При этом Lactobacterium spp. и Bifidobacterium spp. индуцируют секрецию нейтрофилами продуктов с большей бактерицидностью, чем S. aureus и Е. coli. Впервые показано, что продукты нейтрофилов обладают селективной бактерицидностью по отношению к различным видам резидентной и факультативной флоры репродуктивного тракта женщины.
Теоретическая и практическая значимость работы
Полученные данные позволяют расширить представление о роли нейтрофилов в защите слизистых оболочек, об их участии в регуляции состава микробиоцинозов, заселяющих поверхность эпителия нижнего отдела гениталий женщины. Показано, что после контакта с Lactobacterium spp., Bifidobacterium spp., S. aureus (штамм 209), E. coli (штамм М-17) изменяется жизнеспособность гранулоцитов, а также спектр их противомикробной активности. Результаты исследования открывают перспективу для дальнейшего более детального изучения механизма селективной гибели нейтрофилов после воздействия на них бактерий и других факторов секретов слизистых оболочек, а также роли этих клеток в формировании колонизационной резистентности мукозного эпителия.
12 Основные положения, выносимые на защиту
Инкубация in vitro нейтрофилов периферической крови с различными представителями микрофлоры слизистых оболочек (Lactobacterium spp., Bifidobacterium spp., S. aureus (штамм 209), E. coli (штамм М-17), а также муцином, цервикальным секретом и латексом приводит к снижению жизнеспособности значительного числа фагоцитов.
Активация нейтрофилов периферической крови различными видами микроорганизмов (Lactobacterium spp., Bifidobacterium spp., S. aureus (штамм 209), муцином, цервикальным секретом, латексом в экспериментальной модели in vitro увеличивает число погибших (трипанопозитивных) клеток и клеток, ушедших в апоптоз. Lactobacterium spp. и Bifidobacterium spp. обладают большим апоптогенным действием, чем S. aureus (штамм 209) и Е. coli (штамм М-17).
После культивирования in vitro нейтрофилов со взвесью Lactobacterium spp., Bifidobacterium spp., S. aureus (штамм 209) и E. coli (штамм М-17) фагоциты изменяют свою функциональную активность.
Культивирование нейтрофилов с активирующими их различными факторами сопровождается выделением в околоклеточную среду бактерицидных продуктов. Lactobacterium spp. и Bifidobacterium spp., индуцируют секрецию нейтрофилами факторов с большей бактерицидной активностью, чем S. aureus и Е. coli.
В супернатантах нейтрофилов, интактных и активированных различными видами микроорганизмов, содержание количества метаболитов оксида азота (нитратов и нитритов) разное, так же как активность пероксидазы и каталазы.
Взаимодействие нейтрофилов и резидентных бактерий цервикального биотопа играет важную роль в повышении биоцидности секретов нижних отделов гениталий женщин. Под влиянием Lactobacterium spp. нейтрофилы выделяют продукты, обладающие
13 селективной бактерицидностыо в отношении факультативной флоры данного биотопа.
Апробация работы
Основные положения диссертации доложены, обсуждены и опубликованы на Всероссийском научном Форуме имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге: Молекулярные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунотерапии» (г. Санкт-Петербург, 2006, 2007), Конференции иммунологов Урала (г. Оренбург, 2006), VI и V итоговой научно-практической конференции молодых ученых, ЧелГМА (Челябинск, 2005, 2006). Результаты исследования используются в процессе преподавания на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии, а так же в практической работе лаборатории противоинфекционного иммунитета НИИ иммунологии ГОУ ВПО Челябинской государственной медицинской академии.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста и содержит введение, обзор литературы, материалы и методы, 3 глав собственных исследований, заключение, выводы, список литературы. Указатель литературы включает 136 отечественных и 76 иностранных источников. Иллюстрации представлены 33 таблицами и одним рисунком.
![Фармакологическая коррекция функциональной активности нейтрофилов в условиях влияния магнитных полей повышенной напряженности [Электронный ресурс]](/i/i/4406/188443.png "Фармакологическая коррекция функциональной активности нейтрофилов в условиях влияния магнитных полей повышенной напряженности [Электронный ресурс] Разинькова Наталья Сергеевна")
