Содержание к диссертации
Введение
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
Актуальность стафилококковых инфекций 10
Биологические свойства стафилококков 12
Химиотерапия и физиотерапия стафилококковых инфекций 14
Физическая сущность фототерапии 17
Влияние оптических излучений на микроорганизмы 21
Влияние оптических излучений на макроорганизмы 28
Применение оптического излучения в медицине и ветеринарии 33
Заключение по обзору литературы 38
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 40
Материалы и методы исследований 40
Результаты собственных исследований 43
1 Разработка способа и методики облучения микроорганизмов 43
2 Биологические свойства золотистого стафилококка (штамм АТСС 6538 Р ВКПМ-6646) 49
3 Влияние оптического излучения с различными характеристиками на морфологические свойства и патогенность золотистого стафилококка. 52
4 Изменение скорости роста и чувствительности золотистого стафилококка к антибиотикам под влиянием изучаемых параметров оптического излучения. 56
5 Выбор оптимальных характеристик оптического излучения 99
Изучение изменений патогенности золотистого стафилококка на лабораторных животных. 109
Обсуждение результатов исследований 111
ВЫВОДЫ 119
ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ 121
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 122
ПРИЛОЖЕНИЕ
- Биологические свойства стафилококков
- Разработка способа и методики облучения микроорганизмов
- Изменение скорости роста и чувствительности золотистого стафилококка к антибиотикам под влиянием изучаемых параметров оптического излучения.
Введение к работе
На протяжении существования медицинской науки, ведется поиск наиболее эффективных и наиболее безопасных методов лечения. Задача отчасти является противоречивой - оказать мощное губительное воздействие на патологический агент и целительное или стимулирующее на больной организм. Применяя даже самые современные химиотерапевтические средства, приходится мириться с их побочными эффектами: иммунодепрессивным и токсическим для различных органов и систем действием, индивидуальной непереносимостью, несочетаемостью с другими лекарственными препаратами. Кроме того, применение химиотерапевтических препаратов сопровождается повышением резистентности к антибиотикам большей части патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (В.И. Рубцов, 1999; Э.И. Веримей, М.Л. Жолнерович, 1999; Е.А. Денисова, 2000; В.Г. Гавриш, А.В. Егунова, 2000; идр).
По большей части, именно этими обстоятельствами обусловлен интерес практикующих врачей к немедикаментозным методам терапии. В частности, к фототерапии, которая все шире применяется в медицине и ветеринарии. Фототерапия - это новый перспективный метод лечения и профилактики заболеваний, в основе которого лежит воздействие лучами видимого и невидимого света на ткани организма. Свет — один из наиболее доступных и распространенных лечебных факторов. Он достаточно эффективен при многих распространенных заболеваниях. В современной медицине используется не только видимая часть лучистой энергии, но и не воспринимаемые человеческим глазом лучи - инфракрасные и ультрафиолетовые. Особо в светолечении стоит лазерная терапия -использование с лечебными целями когерентного монохроматического светового излучения
В настоящее время изучено действие оптического излучения с различной длиной волны на физиологические и патологические процессы в макроорганизме. В тоже время недостаточно изучено взаимодействие оптического излучения с микрофлорой, являющейся важным фактором в этиологии заболеваний сельскохозяйственных животных. Не изучены вопросы совместного применения оптического излучения с химиотерапевтическими препаратами при терапии заболеваний, обусловленных условно - патогенной микрофлорой. На данный момент не существует единой теории, объясняющей механизмы действия оптического излучения с различными характеристиками на физиологию микроорганизмов. Соответственно, нет четкого научного обоснования для выбора оптимальных параметров оптического излучения при проведении фототерапевтических процедур. Использование большого количества фототерапевтических приборов, генерирующих оптическое излучение с разнообразными характеристиками, в терапии заболеваний, обусловленных условно - патогенной микрофлорой, приводит к получению таких же разнообразных результатов, часто противоречивых. Все это негативно сказывается на внедрении фототерапии в практическую деятельность ветеринарных специалистов, как нового перспективного способа физиотерапии.
Одним из основных представителей условно - патогенной микрофлоры является золотистый стафилококк, который часто выделяется как самостоятельный возбудитель или в ассоциациях при гинекологических заболевания сельскохозяйственных животных.
В связи с этим, актуальна проблема получения экспериментальных данных о влиянии оптического излучения с разными параметрами на возбудителей неспецифических инфекций, на примере золотистого стафилококка, как наиболее характерного представителя условно -патогенной микрофлоры.
Цель и задачи исследований
Цель исследований - Изучить влияние оптического излучения с различными характеристиками на биологические свойства условно — патогенной микрофлоры на примере золотистого стафилококка.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
- разработать методику изучения влияния оптического излучения с различными характеристиками: инфракрасного 940 нм, красного 660 нм, желтого 590 нм, зеленого 570 нм, синего 430 нм, при модуляции их частотами: 0 Гц, 5, 50, 100, 250, 500, 1000, 3000, 5000, 10000, 25000 Гц на микроорганизмы;
- изучить влияние оптического излучения с различными характеристиками на биологические свойства золотистого стафилококка, и обосновать оптимальные сочетания оптического излучения и антибиотиков, оказывающие бактериостатическое действие на микроорганизм и повышающие его чувствительность к антибиотикам.
Научная новизна
Изучены биологические свойства золотистого стафилококка при воздействии оптического излучения с широким диапазоном характеристик. Определены параметры оптического излучения, оказывающие бактериостатическое действие и стимулирующие рост золотистого стафилококка, повышающие и понижающие чувствительность золотистого стафилококка к антибиотикам. Установлено, что применение инфракрасного излучения с частотой модуляции 3000 Гц и красного с частотой модуляции 1000 Гц, вызывает подавление роста золотистого стафилококка, повышает его чувствительность к антибиотикам, не влияет на показатели патогенности. Разработана методика изучения влияния оптического излучения с широким диапазоном характеристик на микроорганизмы (Патент РФ RU 42430 U1 от 07.08.2004).
Практическая ценность и реализация результатов исследований
Экспериментально обоснована методика изучения влияния оптического излучения с широким диапазоном характеристик на микроорганизмы. Материалы диссертации включены в методические рекомендации "Приборное обеспечение стимуляции репродуктивных функций, физиотерапии и физиопрофилактики гинекологических болезней у коров" (утверждены ученым советом ГНУ ИЭВС и ДВ прот. №6 от 30.09.2003г. и подсекцией "Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока" прот. №18 от 30.09.2003г.).
Основные положения, выносимые на защиту
- методика изучения влияния оптического излучения с широким диапазоном характеристик: 940 нм, 660, 590, 570, 430 нм, при модуляции их частотами: 0 Гц, 5, 50, 100, 250, 500, 1000, 3000, 5000, 10000, 25000 Гц на микроорганизмы;
- новые научные данные по влиянию различных характеристик оптического излучения на биологические свойства золотистого стафилококка и оптимальные сочетания оптического излучения и антибиотиков, оказывающие бактериостатическое действие на микроорганизм и повышающие его чувствительность к антибиотикам.
Апробация работы
Материалы исследований доложены и обсуждены на заседаниях методического и ученого совета ИЭВС и ДВ (2001-2004); Конференции молодых ученых "Актуальные проблемы патологии свиней, крупного и мелкого рогатого скота" (Владимир, 2002); Международной научно- практической конференции "Информационные технологии, информационные измерительные системы и приборы в исследовании сельскохозяйственных процессов. Агроинфо - 2003. " (Новосибирск, 2003); Международной научно-практической конференции "Актуальные вопросы зоотехнической науки и практики как основа улучшения продуктивных качеств и здоровья животных" (Ставрополь, 2003); Годичном собрании СО РАСХН 2003 года (Новосибирск, 2003); Международной научно-практической конференции "Аграрная наука Сибири, Монголии, Казахстана и Башкортостана — Сельскому хозяйству" (Павлодар, 2003); Международной научно-практической конференции " Новейшие направления развития аграрной науки в работах молодых ученых." (Новосибирск, 2004); Сибирской международной научно- практической конференции "Актуальные вопросы ветеринарной медицины" (Новосибирск, 2004);
Биологические свойства стафилококков
Стафилококковые инфекции широко распространены во многих странах мира. Это связано с тем, что стафилококки обладают значительной резистентностью к воздействию факторов внешней среды, способностью быстро адаптироваться к лекарственным препаратам, особенно антибиотикам. Постоянным источником стафилококков во внешней среде являются человек и животные, имеющие заболевания стафилококковой этиологии (В.М. Карташова, А.И. Иващура, 1988).
Стафилококки представляют собой грамположительные сферические клетки диаметром 0,5 - 1,5 мкм, в препаратах располагаются поодиночке, парами, но чаще в результате характерного деления более чем в одной плоскости, образуют группы клеток, напоминающие гроздья винограда.
Молодые кокки интенсивно окрашиваются по Граму; по мере старения многие клетки становятся грамотрицательными. Стафилококки неподвижны, спор не образуют. Под действием некоторых химических веществ (например, пенициллина) они подвергаются лизису или переходят в L - форму (Э. Джавец, Д.Л. Мельник, Э.А. Эйдельберг, 1982).
В состав клеточной стенки разных видов стафилококков входит глицеринтейхоевая или рибитолтейхоевая кислота, а также так называемый белок А, наличие которых дает возможность дифференцировать виды стафилококков.
Стафилококки являются хемоорганотрофами с окислительным и бродильным типами метаболизма, расщепляют многие углеводы в аэробных и анаэробных условиях. Диагностическое значение имеет способность сбраживать глюкозу и маннит в аэробных условиях. Стафилококки образуют разнообразные внеклеточные ферменты: плазмокоагулазу, гиалуронидазу, протеазы, эстеразы, лизоцим, фосфатазу, эндонуклеазы, активно гидролизуют белки, жиры, разжижают желатины, восстанавливают нитраты.
По типу дыхания стафилококки относятся к факультативным анаэробам, лучше развиваются в аэробных условиях. При культивировании в аэробных условиях они нуждаются в аминокислотах и витаминах, а в анаэробных условиях, кроме того, необходимы урацил и сбраживаемый ими углевод. Температурный оптимум 35 - 40 С, но могут расти в интервале 6,5 - 46 С, оптимум рН 7,0 - 7,5, возможен рост при рН в пределах 4,2 - 9,3. Очень многие штаммы способны расти в присутствии 15 % NaCl или 40 % желчи. (А. К. Акатов, B.C. Зуева, 1983).
Стафилококки хорошо растут на мясо - пептонных средах, образуя круглые диаметром 6-7 мм., гладкие с ровными краями, блестящие, выпуклые, непрозрачные пигментированные колонии (белого, золотистого, лимонно - желтого цвета). Цвет пигмента может быть различен у разных штаммов одного и того же вида, в связи с чем не является дифференцирующим признаком (В. Д. Тимаков, 1983). Капсулообразующие штаммы формируют более мелкие колонии. Колонии могут быть серого или серо — белого цвета с желтоватым, желто — оранжевым или оранжевым оттенком. Пигментообразование наблюдается при выращивании на средах, содержащих кровь, сыворотку крови, молоко, углеводы, в присутствии кислорода. (М.А. Сидоров, Д.И. Скородумов, В.Б. Федотов, 1995). Клетки имеют диаметр 0,5 -1,0 мкм в окрашенном препарате расположены единично, парами и скоплениями. Некоторые штаммы имеют капсулу или псевдокапсулу, что сочетается с их повышенной резистентностью.
Коагулазу вырабатывают почти все штаммы вида. Отдельные штаммы могут образовывать альфа- или бета-гемолизин. Согласно современной таксономии золотистый стафилококк должен обладать тремя обязательными свойствами: плазмокоагулирующей, ДНКазной активностью и сбраживанием маннита в анаэробных условиях (В.М. Карташова, А.И. Иващура, 1988).
Золотистый стафилококк обитает на слизистых оболочках носовой полости, носоглотки, кожных покровах, в желудочно-кишечном и генитальном трактах животных и человека. Оценивается как потенциально патогенный микроорганизм и является возбудителем бактериемии, маститов, пневмоний, абсцессов, пищевых токсикозов.
Разработка способа и методики облучения микроорганизмов
Первый этап работ заключался в разработке методики облучения микроорганизмов и оборудование для облучения, обеспечивающих минимальную погрешность эксперимента и получение адекватных результатов измерений.
Изначально планировалось облучение микроорганизмов на плотной питательной среде в чашках Петри, для чего был изготовлен соответствующий комплект облучателей. Облучатели представляли собой смонтированные в одном корпусе 5 групп излучающих диодов с различной длиной волны излучения. Облучатели подключали к центральному блоку, при помощи которого осуществляли переключение длины волны и частоты модуляции излучения.
Для проведения эксперимента согласно этой методике, брали 6 чашек Петри с плотной питательной средой (мясо — пептонный агар) проводили точечные посевы культуры музейного штамма золотистого стафилококка. После этого проводили облучение чашек с посевами. Первая чашка всегда являлась контролем и не подвергалась облучению, вторая чашка облучалась инфракрасным излучением (длина волны 940 нм), третья — красным (660 нм), четвертая - желтым (590 нм), пятая -зеленым (570 нм), шестая - синим (430 нм). Облучение каждой чашки проводили по 10 минут, при одной частоте модуляции. После чего чашки помещали в термостат. Учет результатов проводили через 24 часа, путем измерения с помощью линейки диаметра выросших колоний.
В ходе дальнейшей работы был обнаружен целый ряд недостатков этой методики:
- оценка скорости роста микроорганизмов, методом измерения диаметра колоний с помощью линейки, ведет к получению большой ошибки измерения, так как разрешающая способность линейки ограничена величиной 1 мм. Это не позволяет регистрировать промежуточные значения диаметра колоний.
- в лабораторных условия практически невозможно обеспечить равномерную освещенность поверхности плотной питательной среды, а следовательно и микроорганизмов. Разная величина освещенности ведет к неравномерному облучению микроорганизмов и получению недостоверных результатов.
- методика не позволяет оценивать динамику изменений скорости роста микроорганизмов на начальных стадиях роста. Так, например, через 2, 4, 6, 8 часов с начала культивирования колонии микроорганизмов еще не обнаруживаются как таковые.
— методика является чрезмерно материалоемкой, требует большого количества лабораторной посуды, большого расхода питательной среды и затрат рабочего времени, так как облучение чашек осуществляется последовательно.
Затем была разработана вторая методика, согласно которой, облучение микроорганизмов проводили в жидкой питательной среде (МПБ) в пробирках, также с помощью нового отдельного комплекта облучателей, помещаемых в пробирки. Для проведения эксперимента согласно этой методике в 6 пробирок с жидкой питательной средой (по 10 мл мясо - лептонного бульона в каждой пробирке) проводили посевы, внося в каждую пробирку по 0,2 мл взвеси золотистого стафилококка (штамм АТСС 6538 Р ВКПМ-6646) в стерильном физиологическом растворе с концентрацией 1 млрд. МТ в 1 мл по ОСМ ГИСК им. Л.А. Тарасевича. После этого проводили облучение пробирок с посевами. Первая пробирка всегда являлась контролем и не подвергалась облучению, вторую пробирку облучали инфракрасным излучением (длина волны 940 нм), третью - красным (660 нм), четвертую - желтым (590 нм), пятую -зеленым (570 нм), шестую - синим (430 нм). Облучение каждой пробирки проводили по 10 минут, при одной частоте модуляции.
Изменение скорости роста и чувствительности золотистого стафилококка к антибиотикам под влиянием изучаемых параметров оптического излучения
Первый этап работ заключался в разработке методики облучения микроорганизмов и оборудование для облучения, обеспечивающих минимальную погрешность эксперимента и получение адекватных результатов измерений.
Изначально планировалось облучение микроорганизмов на плотной питательной среде в чашках Петри, для чего был изготовлен соответствующий комплект облучателей. Облучатели представляли собой смонтированные в одном корпусе 5 групп излучающих диодов с различной длиной волны излучения. Облучатели подключали к центральному блоку, при помощи которого осуществляли переключение длины волны и частоты модуляции излучения.
Для проведения эксперимента согласно этой методике, брали 6 чашек Петри с плотной питательной средой (мясо — пептонный агар) проводили точечные посевы культуры музейного штамма золотистого стафилококка. После этого проводили облучение чашек с посевами. Первая чашка всегда являлась контролем и не подвергалась облучению, вторая чашка облучалась инфракрасным излучением (длина волны 940 нм), третья — красным (660 нм), четвертая - желтым (590 нм), пятая -зеленым (570 нм), шестая - синим (430 нм). Облучение каждой чашки проводили по 10 минут, при одной частоте модуляции. После чего чашки помещали в термостат. Учет результатов проводили через 24 часа, путем измерения с помощью линейки диаметра выросших колоний.
В ходе дальнейшей работы был обнаружен целый ряд недостатков этой методики:
- оценка скорости роста микроорганизмов, методом измерения диаметра колоний с помощью линейки, ведет к получению большой ошибки измерения, так как разрешающая способность линейки ограничена величиной 1 мм. Это не позволяет регистрировать промежуточные значения диаметра колоний.
- в лабораторных условия практически невозможно обеспечить равномерную освещенность поверхности плотной питательной среды, а следовательно и микроорганизмов. Разная величина освещенности ведет к неравномерному облучению микроорганизмов и получению недостоверных результатов.
- методика не позволяет оценивать динамику изменений скорости роста микроорганизмов на начальных стадиях роста. Так, например, через 2, 4, 6, 8 часов с начала культивирования колонии микроорганизмов еще не обнаруживаются как таковые.
— методика является чрезмерно материалоемкой, требует большого количества лабораторной посуды, большого расхода питательной среды и затрат рабочего времени, так как облучение чашек осуществляется последовательно.
Затем была разработана вторая методика, согласно которой, облучение микроорганизмов проводили в жидкой питательной среде (МПБ) в пробирках, также с помощью нового отдельного комплекта облучателей, помещаемых в пробирки. Для проведения эксперимента согласно этой методике в 6 пробирок с жидкой питательной средой (по 10 мл мясо - лептонного бульона в каждой пробирке) проводили посевы, внося в каждую пробирку по 0,2 мл взвеси золотистого стафилококка (штамм АТСС 6538 Р ВКПМ-6646) в стерильном физиологическом растворе с концентрацией 1 млрд. МТ в 1 мл по ОСМ ГИСК им. Л.А. Тарасевича. После этого проводили облучение пробирок с посевами. Первая пробирка всегда являлась контролем и не подвергалась облучению, вторую пробирку облучали инфракрасным излучением (длина волны 940 нм), третью - красным (660 нм), четвертую - желтым (590 нм), пятую -зеленым (570 нм), шестую - синим (430 нм). Облучение каждой пробирки проводили по 10 минут, при одной частоте модуляции.
