Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы:
2.1. История открытия вируса ПВС - 9
2.2. Морфология вируса - 12
2.3. Эпизоотология -18
2.4. Клиническое проявление болезни - 22
2.5. Патогенез - 25
2.6. Патологоанатомические и гистологические изменения при ПВС - 28
2.7. Диагностика ПВС - 30
2.8. Вакцинопрофилактика при ПВС - 34
2.9. Заключение по обзору литературы - 40
3. Собственные исследования
3.1. Материалы и методы - 43
3.2. Результаты исследований - 54
3.2.1. Анализ заболеваемости собак парвовирусным энтеритом в питомниках - 54
3.2.2. Клинико-эпизоотические особенности течения ПВС - 58
3.2.3.3аболеваемость собак парвовирусным энтеритом в зависимости от породы, пола, времени года и возраста - 64
3.2.4. Изучение динамики антител при вакцинации щенков против ПВС в условиях питомника - 71
3.2.5. Динамика колостральных антител у щенков, полученных от дополнительно иммунизированных и не иммунизированных перед вязкой сук -79
3.2.6.Изучение патогенеза при ПВС - з
3.2.7.Оказание лечебной помощи при ПВС - 95
3.2.8. Мероприятия по профилактике ПВС в условиях питомников - 100
3.2.9.Мероптиятия по ликвидации ПВС на питомниках - 102
Обсуждение -104
Выводы -115
Практические предложения - 117
Список литературы
- Патологоанатомические и гистологические изменения при ПВС
- Анализ заболеваемости собак парвовирусным энтеритом в питомниках
- Изучение динамики антител при вакцинации щенков против ПВС в условиях питомника
- Мероприятия по профилактике ПВС в условиях питомников
Патологоанатомические и гистологические изменения при ПВС
Как и многие другие вирусы, парвовирусы были случайно открыты в конце 50-60 г., когда клеточные культуры нашли в большом объеме применение в вирусологии и в электронной микроскопии. В это время были развиты относительно простые методы морфологической характеристики вирусов. Сначала парвовирусы были выделены в тканях людей с опухолью, а также их перманентных клеточных линий, полученных из опухолей, хотя не стал известен ни один случай, который свидетельствовал бы в пользу того, что парвовирусы вызывают опухоли (Rott R.,1981).
Представители семейства Parvoviridae были впервые описаны Килхэмом и Оливьером в 1959 г. У собак были установлены три члена группы парвовирусов: 1-minute virus of canines (MVC) (Binn L.N. и др., 1970) в отечественной литературе получил название «минутный». 2.- дефектный собачий аденоассоциированный вирус (CAAN), который в 1968 г. выделили SugimuraH Yanadawa/R. 3.- парвовирус собак (CPV) (Appel MJ. 1978)
Первым собачьим парвовирусов был установлен MVC, который был выделен в 1967 г. из фекалий клиническм здоровых собак (Binn L.N.,1970). Он четко отличался от парвовирусов других видов (Siegl G. 1976) и был не родственен CPV (Carmichael L.E 1980). MVC имел очень узкий диапазон хозяев и культивировался без ЦПЭ только в собачьей клеточной линии. Патогенность MVC для собак окончательно не доказана хотя исследования сывороток собак показали, что носительство этого вируса распространено чрезвычайно широко. (Binn L.N., Lazar КС, Eddy G.N et al 1970). Второй собачий парвовирус был описан исследователями Sugimura и Yanadawa R. в 1968 г., которые, работая с изолятами аденовируса инфекционного гепатита собак, обнаружили в зараженных культурах клеток (штамм Matsuda) дефектный парвовирус неспособный к репродукции без вируса помощника, роль которого выполнял вирус гепатита. Выделенный вирус получил название -собачий аденоассоциировашвий вирус (CAAN).
Третий собачий парворирус был открыт в 1978 г. (Appel M.J., Eugester А.К et al 1978) после ряда эпизотий не установленной этиологии среди собак. Болезнь характеризовалась признаками гастроэнтерита и поражением сердечной мышцы. Наиболее подвержены заболеванию были щенки и молодые собаки. (Eugester А.К., 1978; Johnson R.H., 1979; Osterhaus A.D.M.E., 1980; Sehuera et al 1979; Black J.M., 1979). После того как было установлено, что это заболевание вызывает парвовирус (CPV) и, учитывая его близкие антигенные и патогенные свойства с панлейкопенией кошек (FPV) (Carmichael LJE et al, 1980, Osterhaus A.D.M.E., 1979; Siegl G., 1980) возник вопрос о его эволюции и таксонамии. Необходимы были изменения и в применяемой номенклатуре, поэтому MCV был переименован в CPV -1 (собачий парвовирус первого типа - в отечественной литературе - СПВ-1), а новый вирус получил название CPV -2 (СПВ-2) (Carpenter J.L., Roberts R.M., Harpster N.K., et ai 1980), который является наиболее патогенным для собак.
Parrish С. и др. (1985-1988) считают, что между 1979 и 1981 годами CPV-2 ранее циркулирующий в ряде стран Европы, США, Японии заменился, причем в глобальных масштабах, антигенно и генетически отличающимся штаммом в настоящее время обозначенным как CPV-2a. Оба вируса различаются между собой минимум по шести нуклеотидам генома и соответствующим аминокислотам капсидного белка. Однако иммунизация собак против CPV-2 защищала их от заболевания при последующием инфицировании CPV-2a. Несмотря на это, он продолжает распространяться в популяции ваюшнированных собак. Причина замены CPV-2 на CPV-2a пока не установлена. Да и вообще с происхождением CPV-2 ясности нет, как нет доказательств его присутствия у домашних или диких собак до конца 1976 r.(Pollock R.V.H., Parrish С, 1985).
Какие-либо изолированные популяции собачьих в качестве источников распространения как CPV так и CPV-2a по всему миру в течении нескольких лет после их появления, кажутся маловероятными (Parrish С. и др., 1988г).
Некоторые исследователи (Flover L.R.P.; Wilcox G.E.; Robinson W.F.; 1980; Moraillon A., Moraillon R., Person Y.M. и др., 1980) полагают, что преимущественно CPV-2 мог произойти от штамма лейкопении кошек или вируса энтерита норок, который пока не идентифицирован. Неизвестны и события приведпше к селекции CPV-2 и появлению CPV-2a. Все это требует дальнейших исследований механизмов изменений, определяющих круг хозяев, а также различий между CPV-2 (до 1980 г.) и CPV-2a (после 1980), которые привели к глобальным изменениям типа вируса всего за несколько лет после его появления (Parrisch C.R. et al 1988 г.).
Анализ заболеваемости собак парвовирусным энтеритом в питомниках
По сообщениям ряда исследователей (Eugester А.К. 1980; RottR. 1981; Hoffinarm R. 1981; Frese К. 1981; Heinacher M. 1981; et al.) первым клиническим признаком заболевания ПВС наиболее часто является рвота со слизью которая наблюдается вплоть до выздоровления или смерти. Заболевание возникает всегда внезапно. Кал вначале серый или желтоватый, часто имеет примеси крови, иногда геморрагический со слизью или водянистый с сильно зловонным запахом.
Moraillon А. сообщает, что французские ветврачи иногда ставят диагноз на основании специфического и металлического запаха фикалий, хотя этот признак нельзя не признать субъективным.
Eugester А.К.(1980) указывает на то, что некоторые случаи заболевания ПВС напоминают чуму плотоядных, или инфекционный гепатит. У отдельных собак после появления рвоты и диарии развиваются признаки поражения респираторной системы.
Appel MJ. et al 1979, Black J.M. et al 1979, Johnson R.H. 1979, BaUarini G. 1979, Lescure et al 1980, Voros et al 1981 отмечают, что при ПВС количество лейкоцитов значительно понижается и достигает 300-2500 в 1 мм. Лекопения часто сопровождается подъемом температуры тела. Инкубационный период при естественном заражении длится до 10 дней, а при экспериментальном 3-4 дня. Смертность колеблется в пределах 5-30% (Black J.M.- et al 1979; Johnson R.H.-1979; Mc. Carthy-1980; Touratier L -1980).
По данным Rott. R. (1981) из 50 случаев заболевания ПВС у 46 отмечалось продолжительная рвота слизисто-пенистой жидкостью. У 9 собак в рвотных массах имелась примесь крови. Звери отказывались от любого корма, часто даже от воды и становились инертными и апатичными. После продолжительной рвоты и диареи у животного наблюдалось значительное обезвоживание организма, глазные яблоки глубоко западали, снижалась упругость кожи. В среднем рвота, даже при симптоматической терапии продолжалась в течении 5 дней. Особенно частой и продолжительной она была на 2 день заболевания.
Ноптапп. R. (1981) сообщает, что болезнь может протекать почти скрытно, без клинических симптомов и лейкопении но в тяжелой форме. У некоторых щенков наблюдалась легкая степень апатии, без рвоты и поноса, но через 36 часов они погибали.
В результатах своих исследований Starke. G. Ншаг. P. Moring. H. (1979) сообщают, что клинические признаки заболевания ПВС отмечались у собак всех пород и возрастов.
Gass. Н (1982) отмечает, что у 5-7 недельных щенков встречается "мягкая" и инапарантная (скрытая) формы течения ПВС. У 9-12 недельных щенков заболеваемость достигает 50% и характеризуется более острым течением. Клинические симптомы включали в себя: лихорадку, дипрессию, дегидратацию, слущивания слизистой оболочки кишечника и водянистую диарею, иногда наблюдали рвоту. У пораженных собак было отмечено увеличение случаев респираторных болезней. Gass. H. указывает на то, что микробиологическая флора и паразиты имеющиеся в кишечнике вызывают повышенное отторжение его эпителия, что является очень важным в течении патогенеза при ПВС.
Carmichael L.E. Віші L.N. (1980) сообщают, что у молодняка ПВС протекает в 2-х формах: Сверхострой (молниеносной), которая приводит к гибели животных в течении 1-3 дней. У таких животных наблюдается коматозное состояние (Ваиагші G.-1979). При острой форме болезни гибель щенков отмечается в течении 5-6 дней. При этой форме течения заболевания у собак часто наблюдается различные осложнения (Touratier L.-1980). В 1979 году ряд авторов (Finnie J.W. et al 1979; Hezel В. et al 1979; Huxtable 1979; Jefferies A. R. et al 1979; Jeryk P.F., Thompson H.1979 et al и другие) в своих исследованиях наблюдали при ПВС негнойные миокардиты.
Hayes М.А. Russell R.G. Rabink L.A. (1979); Robinson W.F. Huxtabbe C.R. Howell J.M. (1979) выделили из кардиальных тканей больных щенков парвовирус.
Langhans. С. Studdert MJ. (1980) воспроизвели миокардит после экспериментального заражения. Они так же сообщают, что им не удалось воспроизвести миокардиальную форму заболевания у щенков в недельном возрасте. Однако, Carmichael L.E. Віші L.N. (1980) , заражая серонегативных щенков на 3-5 день после рождения вирусом CPV, воспроизвели миокардит.
У молодых собак в возрасте от 3 недель до 7 месяцев по данным Touratier L.-(1980) парвовирус вызывает не только гастроэнтерит, но и поражение сердечной мышцы. У больных животных развивается внезапная слабость и они погибают в течении 0,5-24 часов. При миокардиальном синдроме смертность достигает 70%. . У выживших животных отмечается поражение миокардита.
Иногда при миокардиальной форме отмечается внезапная смерть внешне совершенно здоровых собак. Carpenter J.N. и др. (1980) в опытах на щенятах одного помета в возрасте до 2-х недель показали, что ПВС клинически может проявляться в кишечной, сердечно-легочной или одновременно в двух формах. Проявление клинических признаков болезни зависит от различных факторов. Активно размножающиеся клетки являются необходимыми для развития вируса. Возраст, паразиты, беременность, голодание, перемена места или окружения, все это усиливает проявление клиники ПВС. Доза вируса, наличие колостральных антител так же оказывают влияние на клинику болезни. (Afshar A. 1981,AppelM.J.G. 1987,CarmichaelL.E. 1983)
Изучение динамики антител при вакцинации щенков против ПВС в условиях питомника
РГА и РТГА ставили на 96-ти луночных планшетах При постановке РГА учитывали возможность спонтанной агглютинации.В 5-6 лунках смешивали равные объемы (по 0,025) ЗФР и приготовленную взвесь эритроцитов. Планшеты встряхивали и выдерживали в холодильнике 2-4 С. Учет реакции осуществляли через полтора -два часа. Самоагглютинация проявлялась равномерным распределением эритроцитов на внутренней поверхности лунок в виде «зонтика» , при отрицательном результате отмечали оседание эритроцитов на дно лунки в виде пуговки .
Далее ставили РГА с исследуемым материалом. Готовили 2-кратное разведение испытуемого материала на ЗФР РН = 6,6 от 1:2 до 1:4096 в объеме 0,025 см3 и во все лунки вносили по 0,025 см3 суспензию эритроцитов . Одновременно ставили контроль эритроцитов Планшеты встряхивали и помещали в холодильник на 1,5-2,0 часа, устанавливая температуру 2-4 С.
Положительная реакция характеризовалась оседанием эритроцитов по всей поверхности лунки в виде « зонтика», а отрицательная - в виде пуговки. Наибольшее разведение исследуемого материала, при котором происходила агглютинация эритроцитов, считали титром агглютинирующего агента. Для идентификации выделенного в РГА гемагглютинирующего агента ставили РТГА.
В начале исследуемую и контрольную (нормальную) сыворотку инактивировали при температуре 56 С в течении 30 мин , затем охлаждали , после чего к 2 мл. сыворотки добавляли по 0.1-0.2 мл. отмытого осадка эритроцитов свиньи и выдерживали при температуре 2-4 С. в течении 2-х часов. После этого проводили центрифугирование при 2000 об/мин. в течении 10 мин.
Подготовленные таким образом сыворотки в виде надосадочной жидкости собирали для дальнейшего использования в РТГА.
Для постановки РТГА готовили рабочее разведение вируса, содержащее 4-S ГАЕ. РТГА, ставили на полесгироловых планшетах . .Готовили 2 кратное разведение подготовленных , как описано выше , контрольной (нормальной) и исследуемой сыворотки на забуферном физрастворе (ЗФР) РН= 6,6 в объеме 0,025 мл до разведения 1:4096, после чего добавляли в каждую лунку по 0,025 мл рабочего разведения антигена (8 ГАЕ). Планшеты встряхивали и выдерживали при температуре 2-4С в течении часа. Параллельно ставили следующий контроль: - контроль антигена - в 5 лунок пластины вносили по 0,025 мл ЗФР, затем в первую лунку добавляли 0,025 мл рабочей дозы антигена, тщательно перемешивали, отбирали микропипеткой такой же объем и переносили в следующую лунку и так далее, а из последней лунки удаляли 0,025 мл раствора, после этого во все лунки добавляли по 0,025 мл ЗФР. Контроль эритроцитов - в 5 лунок вносили по 0,05 мл ЗФР. Контроль сывороток на спонтанную агглютинацию - в 4 лунки вносили по 0,025 мл ЗФР и в каждую добавляли по 0,025 мл соответствующих сывороток. После постановки основного и контрольного опытов во все лунки вносили по 0,05 мл охлажденных эритроцитов свиньи в 0,5-1 % суспензии. Реакцию проводили при температуре 2-4 С, Учет результатов осуществляли через 1-1,5 часа. Нормальная сыворотка не дает задержки гемагглютинации и эритроциты равномерно распределяются на внутренней поверхности лунки в виде "зонтика". Контроль антигена - в первых двух лунках должен образоваться "зонтик". Контроль эритроцитов и сывороток - во всех лунках должны быть "пуговки". Титром исследуемых сывороток, считали наибольшее ее разведение , где отсутствовала агглютинация.
Биопрепараты использовали в соответствии с наставлениями по их применению. Щенков вакцинировали, начиная с 1,5 и 2-х месячного возраста. О реактогенных свойствах вакцин судили по результатам ежедневных наблюдений за животными, термометрию проводили до вакцинации и в течении 2-х недель после неё.
Одним из показателей антигенной активности профилактических препаратов, является наличие специфических антител в сыворотке крови вакцинированных животных. Определение специфических антител к возбудителю ПВС при помощи РТГА ставили микрометодом.
В качестве патологического материала брали участок тонкого отдела кишечника,селезенку, печень и сердце от павших собак из каждого материала раздельно готовили суспензию и осветляли центрифугированием . К полученному надосадку добавляли 100 ед /мл. пенициллина и 100 мкг / мл. стрептомицина и фильтровали через систему « Миллипор» с размером пор 0,22 нм. До заражения культуры клеток определяли титр изолятов в РГА. В качестве культуры клеток использовали перевивальную культуру клеток CRFK, заражали ее одновременно с посевом в суспензию. Доза вируса составляла 32 ГАЕ/мл.Зараженные культуры клеток выращивали при температуре 37 С в течение 5-6 суток .Клеточные культуры ежедневно просматривали под световым микроскопом и состояние монослоя сравнивали с контролем не зараженной культуры . О наличии изолята вируса в клеточных культурах судили по результатам исследования культуральной жидкости в реакции гемагглютинации . Наиболее часто положительный результат 25 % был отмечен при исследовании проб кишечника и только в четырех случаях удалось выделить гемагглютишфуюпдай агент в печени, селезенке и сердце.
Мероприятия по профилактике ПВС в условиях питомников
Как видно из рисунка № 1, при вакцинации в 45 дней нарастание титра антител идет медленнее по сравнению с вакцинацией в 60 дней, но в обоих случаях мы получили титр антител достаточный для защиты от спонтанного заражения ГОС. Наибольший титр антител после иммунизации наблюдается через 30 дней т.е. к 2,5-3 месяцам, но после 4-5 месяцев количество антител начинает снижаться. Возможно, это связано с гормональной перестройкой организма в период полового созревания или другими причинами.
При иммунизации щенков вакциной "Мультикан-4" титр антител к 7-8 месяцам, снижается до пороговых величин, это характерно и для некоторых других вакцин, содержащих в своем составе антиген ЛВС. Поэтому мы предлагаем в этом возрасте проводить дополнительную однократную вакцинацию.
Проведенные нами исследования по применению различных коммерческих ассоциированных вакцин с антигеном ЛВС показали, что в условиях питомников иммунизировать щенков целесообразно с полутора месяцев, вакцинация в более поздние сроки повышает риск заболевания щенков как до вакцинации, так и после нее, в результате того , что отдельные из них в этот период являлись вирусоносителем .
Совершенно непреемлимыми для питомников являются рекомендации по первичной иммунизации щенков в 3-3,5 месяца ( вакцина « Мультикан-4»).
Щенков в возрасте 21-25 дней необходимо продегельминтизировать препаратами, которые не оказывают выраженного иммунодепрессивного действия. За 7 дней до вакцинации щенкам дают "Декарис" т.к. он является не только антигельминтикем, но и иммуномодулятором. В 45 дней щенков вакцинируют против ЛВС применяя моновакцины такие как "Парводог", "Примадог", "Вангард-CPV", "Нобивак Parvo-C" и др. Моновакцины применяются для того, чтобы не перегружать иммунную систему щенка другими антигенами. Ревакцинация моновакцины не проводится, через 2 недели применяются ассоциированные вакцины по общепринятой схеме, согласно инструкции. Если эпизоотическая обстановка на питомнике не благополучна по нескольким инфекционным заболеваниям, то можно применять при ранней вакцинации и ассоциированные вакцины, желательно не содержащие в своем составе компонентов бешенства, т.к. прививать собак от этой болезни по нашему мнению желательно после 4-х мес. когда организм щенка обладает высокой иммунологической зрелостью. Иммунизация ассоциированными вакцинами проводится 2-х кратно: в 45 и 60 дней. В три месяца желательно провести контрольное исследование титра антител против ГГОС в РТГА. При низком титре применяют метод иммунокорекции и вакцинируют животных дополнительно.
Щенков, которых отнимают от сук в 30 дней, а иногда по различным причинам и раньше, имеющих недостаточную массу тела, неустойчивый стул, подвергают пассивной иммунизации поливалентной сывороткой против ЧС, ИГС, ГОС.
Если они в 1,5-2,0 мес. возрасте имеют настораживающие признаки: расстройство желудочно-кишечного тракта, капризный аппетит и тд., то пассивная иммунизация повторяется, проводится комплексная витаминотерапия и иммунокоррекция препаратами тимуса (Т-активин, Тимазин), костного мозга (В-активин).
Хорошие результаты получены при вакцинации щенков в 1,5 мес. моновакциной "Вангард -CPV" в которой титр парвовирусного антигена составляет 107 ССГО в дозе, такое количество антигена содержится и в ассоциированной вакцине "Вангард-7Ь", это позволяет преодолеть нейтрализующее действие колострального иммунитета. Результаты собственных наблюдений позволяют нам утверждать, что ранняя вакцинация щенков против ПВС, ЧС и ИГС в условиях питомников позволяет снизить количество заболеваний.
Изучение динамики колостральных антител у щенков имеет исключительно важное значение, так как от степени активности и продолжительности материнского иммунитета зависят сроки начала профилактики инфекционных заболеваний таких, как ПВС, ЧС и ИГС. По мнению Pollock R.V.H., Caimichael L.E.(1982) колостральный путь передачи антител обеспечивает у щенков 90% иммунитета против ПВС, на 10% возможна передача антител через плаценту.
Динамику колостральных антител изучали на щенках, полученных от 2 групп сук, одна из которых состояла из сук, дополнительно иммунизированных против ПВС перед вязкой. В первой группе находилось 8 сук, иммунизированых ассоциированной вакциной «Мультикан -6» за 10-12 месяцев до вязки. У всех сук непосредственно перед вязкой брали кровь на исследование титра антител против ПВС в РТГА.
Во второй группе было 12 сук, которых разделили на 4 подгруппы по 3 суки в каждой и за 2-4 недели до предполагаемой вязки иммунизировали вакцинами « Вангард-5Ь», «Nobivac - DHP», «Триовак» и «Мультикан-4», содержащими в своем составе антиген ПВС.
В конце первой половины щенности на 21 день у всех животных взяли кровь для проведения исследования.
Из результатов таблицы № 15 следует, что у дополнительно вакцинированных перед вязкой сук титр антител в молозиве, молоке и сыворотке крови выше, чем у не вакцинированных, но к 30 дню у ощенившихся сук отмечается снижение титров антител против ПВС. У полученных щенков по 15 голов из обеих групп брали кровь в 14;21;30;40;50;60;75;90 дней для исследования уровня специфических антител к ПВС. Результаты исследовании отображены в таблице № 16.
