Содержание к диссертации
Введение
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Эпизоотическая ситуация по туберкулёзу и нокардиоформным актиномицетным инфекциям в НЗ РФ 20
1.2 Идентификация микобактерий и нокардиоформных актиномицетов, вызывающих положительные туберкулиновые реакции и заболевания сельскохозяйственных животных 26
1.3 Питательные среды для выращивания микобактерий и нокардиоформных актиномицетов 41
1.4 Бактериологические исследования патологического материала при туберкулёзе сельскохозяйственных животных 46
1.5 Дезинфектанты, применяемые в животноводстве при туберкулёзе и но кардиоформных актиномицетных инфекциях 48
2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Материалы и методы исследований 54
2.2 Результаты исследований 61
2.2.1 Идентификация микобактерий и нокардиоформных актиномицетов, вызьгоающих положительные туберкулиновые реакции и заболевания у свиней и крупного рогатого скота 61
2.2.1.1 Родококковая инфекция у свиней 61
2.2.1.2 Родококковая инфекция у крупного рогатого скота 79
2.2.1.3 Родококки в кормах из комбикормового завода 79
2.2.1.4 Коринебактериоз у хряков 83
2.2.1.5 Микобактериоз, вызванный Mycobacterium xenopi у крупного роганого скота 90
2.2.1.6 Новый способ хранения микроорганизмов в лаборатории 96
2.2.1.7 Значение лабораторных диагностических исследований в программе эпизоотологического мониторинга туберкулёза сельскохозяйственных животных 97
2.2.2 Разработка бактерицидного средства для предпосевной деконтаминации патологического материала от животных положительно реагирующих на туберкулин, а также от больных туберкулёзом людей 102
2.2.2.1 Выбор оптимального многокомпонентного дезинфицирующего средства в лабораторных условиях 102
2.2.2.2 Апробация новых методов деконтаминации посевного материала от больных туберкулёзом людей 107
2.2.2.3 Разработка нового способа деконтаминации материала от положительно реагирующих на туберкулин с.-х. животных 111
2.2.3 Разработка новых питательных сред для культивирования и идентификации микобактерий
и нокардиоформных актиномицетов 121
2.2.3.1 Характеристика «Гумивита» 122
2.2.3.2 Изготовление плотных питательных сред: АГ, АГЖ, АГЖЗ для роста микобактерий и нокардиоформных актиномицетов 123
2.2.3.3 Изучение на новых питательных средах скорости, интенсивности роста референс-штаммов микобактерий и свежевыделенных штаммов из образцов патологического материала от положительно реагирующих на туберкулин животных 124
2.2.4 Разработка нового способа дезинфекции животноводческих помещений препаратом «лесептик» 129
2.2.4.1 Дезинфекция на свиноводческом комплексе «Ильиногорское» .129
2.2.4.2 Испытание препарата «Лесептик» на тест-объектах 135
2.2.4.3 Разработка нового способа дезинфекции животноводческих помещений 138
2.2.4.4 Применение «Лесептик» в производственных условиях 139
3 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 142
4 ВЫВОДЫ 151
5 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 154
6 ЛИТЕРАТУРА 156
7 ПРИЛОЖЕНИЕ 213
- Эпизоотическая ситуация по туберкулёзу и нокардиоформным актиномицетным инфекциям в НЗ РФ
- Идентификация микобактерий и нокардиоформных актиномицетов, вызывающих положительные туберкулиновые реакции и заболевания сельскохозяйственных животных
- Материалы и методы исследований
Введение к работе
Туберкулёз является антропозоонозом, поэтому усилия микробиологов, эпизоотологов и эпидемиологов должны быть объединены для решения общей задачи — борьбы с этой инфекцией, основу которой представляет своевременная диагностика.
Диагноз на туберкулёз у животных устанавливают на основании результатов патологоанатомических, бактериологических, включая биологическую пробу, аллергических исследований с учётом эпизоотологических данных и клинических признаков болезни. Однако до настоящего времени нет быстрых и надёжных методов прижизненной диагностики туберкулёза животных.
Туберкулёз как антропозооноз представляет мировую проблему несмотря на значительные успехи, достигнутые в различных научных и практических сферах. На современном этапе борьбы с туберкулёзом животных основой профилактических и оздоровительных мероприятий является диагностика этой болезни.
Для прижизненной диагностики туберкулёза сельскохозяйственных животных в данное время основным массовым методом в ветеринарной практике является внутрикожная туберкулиновая проба с применением ППД для млекопитающих. Однако нередким является наличие положительно реагирующих на туберкулин животных в благополучных по туберкулёзу хозяйствах — это так называемые неспецифические или парааллергические реакции на туберкулин. Актуальность этой проблемы увеличивается из года в год; так в настоящее время в благополучных хозяйствах выявляется большое количество реагировавших животных, чем в неблагополучных по туберкулёзу хозяйствах [А.Х. Найманов, Н.П. Овдиенко, 2003]. Массовые выявления неспецифических реакций на туберкулин приводят к забою большого количества реагирующих здоровых животных, что увеличивает
8 размеры экономического ущерба и вызывает обоснованные сомнения в правильности диагностики туберкулёза. Известно, что причиной неспецифических реакций на туберкулин у скота являются не только микобактерии туберкулёза, но и многие условно-патогенные и сапрофитные микобактерии, нокардиоформные актиномицеты и коринебактерии, имеющие общие с микобактериями туберкулёза антигены. Некоторые виды или штаммы этих микроорганизмов могут вызывать у скота поражения, сходные с туберкулёзными, что значительно усугубляет проблему.
Так рядом исследователей: [Р.А. Агзамова 1996; Е.А. Асташова 1989; А.П. Бобчёнок 1996; А.И. Завгородний 1987; А.Л. Лазовская, К.Н. Слинина, З.В. Воробьёва 2001, 2004, 2006 гг.] показана роль в возникновении неспецифических реакций на туберкулин родственных микобактериям микроорганизмов - нокардий, родококков и коринебактерии, хотя до сих пор значение этих микроорганизмов явно недооценивалось. Известна роль атипичных микобактерии в возникновении неспецифических реакций на туберкулин для млекопитающих. Однако не изучена способность микроорганизмов, родственных микобактериям по антигенной структуре и многим другим свойствам, сенсибилизировать организм животных и вызывать параспецифические реакции на туберкулин. Доказано, что родококки, нокардий сенсибилизируют организм животных к ППД-туберкулину млекопитающих. Известно, что положительные реакции у животных на туберкулин вызываются не только сенсибилизацией организма микобактериями, но и другими актиномицетами в силу наличия у них общих антигенов. При этом положительные туберкулиновые реакции симулируют туберкулез и, несмотря на отсутствие у животных характерных для туберкулеза изменений при патологоанатомических исследованиях, неясная ситуация нередко приводит к неоправданному убою скота. Отсутствие эффективных способов диагностики актиномицетных инфекций вызывают
9 необходимость разработки и усовершенствования средств и методов для их диагностики, профилактики и лечения.
Несомненно, требуется совершенствование бактериологической, серологической, хемотаксономической диагностики туберкулёза, микобактерио-зов и нокардиоформных актиномицетных инфекций с применением новейших достижений биохимии и молекулярной биологии, обеспечивающих экспресс-идентификацию бактерий всех уровней таксономической иерархии: род, вид, штамм [Л.М. Пинчук, А.Л. Лазовская, 1989; О.А. Нестеренко, 1985; Т.Ф. Оттен, 2003].
Для выделения из патологического материала нокардиоформных актиноми-цетов необходимы новые питательные среды и новые способы деконтамина-ции материала, а редкое выделение их объясняется отсутствием необходимых питательных сред и жесткой обработкой материала. Все методы обработки посевного материала расчитаны на выделение МБТ и отмечены лишь единичные случаи выделения нокардиоформных актиномицетов. Это объясняется рядом причин, первой среди которых является отсутствие знаний у практических врачей, навыков и целенаправленности на выявление таких микрооргагинизмов. Жёсткая обработка посевного материала уничтожает слабокислотоустойчивые микроорганизмы, а также частично снижает жизнеспособность патогенных микобактерий. В отличие от кислотоустойчивых микобактерий родококки, коринебатерии, нокордии часто погибают при жёсткой предпосевной обработке. Выбор деконтаминанта и характер предпосевной обработки патологического материала, как утверждают исследователи [А.Л.Лазовская, К.Н. Слинина, Е.А. Ильина 2003, 2006, 2007] в значительной степени определяют успешность бактериологического и микроскопического методов выявления микобактерий и нокардиоформных актиномице-тов.Недостатки методов предпосевной обработки биоматериала от положительно реагирующих на туберкулин животных определили направленность
10 исследований автора по подбору компонентов для нового деконтаминанта и способов его применения [273, 274, 278]. Успешность конструирования деконтаминанта определила его дальнейшее использование в качестве дезинфектанта в хозяйствах с родококковой инфекцией [168, 276].
Большое значение имеет и проблема индикации и идентификации кислотоустойчивых микроорганизмов. Методы, принятые в настоящее время в ветеринарной практике, не всегда результативны. Для диагностики таких культур должны быть использованы дополнительные тесты. Несомненно, требуется совершенствование эпизоотологической, патоморфологической, бактериологической, прижизненной серологической диагностики туберкулёза, микобактериозов и нокардиоформных актиномикозов с применением новейших достижений, профилактики и мер борьбы с туберкулёзом животных с учётом региональных природно-хозяйственных особенностей.
Важное значение имеют бактериологические исследования с углубленным изучением культурально-биохимических [А.Л. Лазовская, Е.А. Ильина, [и др.] 2002,2004] и хемотаксономических свойств штаммов микобактерий и нокардиоформных актиномицетов [О.А. Нестеренко, 1985; Г.Ф. Леванова, Е.И. Квасников, Т.М. Ногина [и др.] 1982, 1985]; Т.Ф. Оттен, А.В. Васильева 1996, 2005].
Особенное значение в патологии свиней, лошадей и крупного рогатого скота могут играть нокардиоформные актиномицеты; некоторые штаммы в результате пассажей на животных приобретают вирулентность и вызывают у новорождённых животных остро протекающее заболевание с частым летальным исходом [А.Л.Лазовская, К.Н.Слинина, З.Г.Воробьёва: 2001, 2004, 2006].
В НИВИ НЗ РФ ранее были разработаны «Методические рекомендации по стандартизации методов идентификации бактерий с применением систем индикаторных бумажных (СИБ)» [В.В.Сочнев, А.Л.Лазовская [и др. 1987].
Успешное применение СИБ для идентификации свежевыделенных штаммов микобактерий позволило А.Л. Лазовской, К.Н. Слининой, З.Г. Воробьёвой в дальнейших научных исследованиях использовать этот метод и для нокардиоформных актиномицетов[2001,2004, 2006].
Создание компьютерного банка данных исследований ДНК позволит контролировать ситуацию с распространением микобактерий туберкулеза, в различных регионах не только в России, но и за рубежом.
В России такого рода исследования еще не приобрели широкого распространения, но рядом авторов уже показана на практике эффективность геномного анализа при изучении микобактерий [В.Н. Степаншина, О.Ю. Манзенюк [и др.] 2000; И.Г. Шемякин, 2000; Г.Ф. Леванова, А.Л. Лазовская, СЮ. Кашников, К.Н. Слинина, 2001; А.Л. Лазовская, З.Г. Воробьёва, К.Н. Слинина, 2004].
Достаточно сложные методы геномного анализа определили направление исследований по подбору ключевых тестов в системе СИБ для штаммовой характеристики микобактерий и родококков, что позволяет проводить кластрирование свежевыделенных культур [А.Л. Лазовская, К.Н. Слинина, З.Г. Воробьёва, 1999, 2003, 2004].
Одним из наиболее успешных методов индикации кислотоустойчивых микроорганизмов и видовой идентификации микобактерий является хемотаксономическии метод определения жирнокислотного состава клеток с использованием газовой хроматографии (Методические рекомендации. -Н.Новгород, 1987, 1991, 1993), работы А.Л. Лазовской, Л.М. Пинчук, О.Ф. Рачковой.
Значение газохроматографического способа идентификации микобактерий возрастает в связи с широким распространением в последние годы мибактериозов вызываемых условно-патогенными и сапрофитными микобактериями. ГЖХ оказывает существенную помощь в расшифровке этиологии заболеваний.
Серологические исследования с помощью латексного антигенного ди-агностикума позволяют выявлять специфические антитела в первые недели заражения животных и могут вполне сочетаться с ежегодной серологической проверкой скота на бруцеллёз [46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 60, 61, 62]. Выявление в стаде даже нескольких животных с высокими титрами антител к мико-бактериям туберкулёза уже свидетельствует о неблагополучии этого поголовья.
Всё вышеизложенное определило выбор темы и направление наших исследований.
Цель и задачи исследований. Цель исследований предполагает усовершенствование методов диагностики туберкулёза, микобактериозов и но-кардиоформных актиномицетных инфекций при возникновении положительных туберкулиновых реакций на основе разработанного латексного антигенного диагностикума, на разработанных новых питательных средах с применением различных методов идентификации и предпосевной деконтаминации патологического материала, нового способа обеззараживания животноводческих помещений. Исходя из поставленной цели, были определены следующие задачи:
выяснить роль микобактерий и нокардиоформных актиномицетов у положительно реагирующих на туберкулин животных;
разработать латексный антигенный диагностикум (ЛТА) для выявления противотуберкулезных антител;
выяснить роль родококков и коринебактерий в патологии животных;
изучить культурально-биохимические, биологические, хемотаксономи-ческие и серологические свойства микобактерий, нокардиоформных актиномицетов и коринебактерий, выделенных от положительно реагирующих животных на туберкулин;
- разработать новые питательные среды для идентификации микобакте
рий, нокардиоформных актиномицетов и коринебактерий;
- разработать новый поливалентный дезинфектант и способы его
применения для деконтаминации патологического материала и
дезинфекции животноводческих помещений;
- разработать новый, простой и дешёвый способ консервации культур
микроорганизмов, позволяющий длительное время сохранять их
биологические свойства.
Научная новизна. В настоящей работе показано значение микобактерий, родококков и коринебактерий в патологии свиней и крупного рогатого скота, вызывающих не только положительные туберкулиновые реакции и ограниченные поражения лимфатических узлов и тканей у взрослого поголовья, но и тяжёлые заболевания молодняка часто с летальным исходом (до 50%);
- разработан антигенный диагностикум (ЛТА) для выявления
противотуберкулезных антител;
- установлена роль родококков и коринебактерий в появлении
положительных туберкулиновых реакций у животных;
- показана роль родококков и коринебактерий в патологии животных;
-изучены культурально-биохимические, биологические,
хемотаксономические и серологические свойства родококков и коринебактерий, выделенных от положительно реагирующих на туберкулин сельскохозяйственных животных, причем родококки отнесены к виду Rhodococcus equi, а коринебактерий к виду Corynebacterium pseudotuberculosis;
на территории Российской Федерации от положительно реагирующего на туберкулин крупного рогатого скота с туберкулёзноподобными изменениями в органах выявлена культура медленнорастущего условно-патогенного вида М. xenopi;
- показано значение хемотаксономических исследований на основе
жирнокислотного состава клеток с применением газового хроматографа для
14 родовой и видовой идентификации микобактерий, нокардиоформных актиномицетов и коринебактерий;
разработаны новые агаровые питательные среды для идентификации микобактерий, нокардиоформных актиномицетов и коринебактений на основе гумивита, желтка и агара оптимальные для исследования ферментативных свойств, жирнокислотного состава клеток и выделения культур из патологического материала;
разработан новый поливалентный дезинфектант для деконтаминации патологического материала от положительно реагирующего на туберкулин скота и больных туберкулёзом людей;
разработан новый способ деконтаминации патологического материала, позволяющий повысить выделение и скорость роста микобактерий и нокардиоформных актиномицетов;
обработка биоматериала с использованием 0,3% раствора препарата «Лесептик» при экспозиции 24 часа либо 0,5% раствора при экспозиции 3 часа позволяет выявлять нокардиоформные актиномицеты и микобактерий на 20-30% больше, чем при традиционной обработке 6% - ным раствором серной кислоты;
разработан эффективный способ применения препарата «Лесептик» для дезинфекции животноводческих помещений в составе 10% гашёной извести, приготовленной на 1%> растворе «Лесептика» и в виде 0,7-1,0%) раствора для обработки обуви в дезинфекционных ваннах;
разработан новый простой и дешёвый способ консервации культур микроорганизмов, позволяющий длительное время сохранять их биологические свойства.
Новизна научных исследований подтверждена 12 патентами Российской Федерации.
Практическая значимость. Результаты исследования могут быть применены в работе практических и научно-исследовательских лабораторий,
15
использованы для бактериологической, серологической диагностикики,
туберкулёза и нокардиоформных актиномицетов, в работе
эпизоотологических и эпидемиологических служб при разработке
профилактических мероприятий, а так же при создании мониторингов этих
инфекций. Лабораторное исследование биоматериала от
сельскохозяйственных животных на основе нового способа деконтаминации и культивирования на новых питательных средах сокращает сроки выращивания и повышает частоту выделения микобактерий и нокардиоформных актиномицетов, что позволяет ускорить диагностику и повысить эффективность санитарно-гигиенических мероприятий.
Рекомендованные меры по профилактике туберкулёза и нокардиформных актиномицетов (смена корма, способ применения дезинфицирующего препарата «Лесептик», лабораторные исследования с новыми средами и способами деконтаминации посевного материала) позволили исключить возникновение положительных туберкулиновых реакций у животных.
Научные разработки вошли в следующие нормативно-технические документы, которые утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхоза России:
1. Технические условия на «Набор для диагностики туберкулеза
крупного рогатого скота в реакции агглютинации латекса РАЛ» (ТУ 9388-
001-0067433-99 Утверждены 1999).
2. Наставление по применению набора для диагностики туберкулеза
крупного рогатого скота в реакции агглютинации латекса (РАЛ)
(Утверждены 1999).
3. Методические рекомендации по серологической диагностике туберкулеза сельскохозяйственных животных (Утверждены РАСХН, Москва, 1999).
4. Методические рекомендации / Новые методы исследования возбудителей антропозоонозов. Туберкулёз (Утверждены РАСХН, Москва, 2003).
5. Временное наставление по применению дезинфицирующего средства «Лесептик» (Утверждено Комитетом Госветнадзора администрации Нижегородской области. -Нижний Новгород, 2001).
Научные разработки автора защищены патентами:
Способ получения латексного антигенного микобактериального диагностикума / Пат. РФ 2117294С1;опубл. 10.08.1998 г. Бюл. № 22.
Способ выявления микобактериальных антигенов/
Пат. РФ 2147125С1;опубл. 27.03.2000 г. Бюл. № 9. - Зс. - 2 табл.
Способ дезинфекции при туберкулёзе/Пат. РФ 2161508С1;опубл. 10.01.2001г. Бюл. №1.- 8с.
Способ выявления микобактериальных антигенов /Пат. РФ 2188428С2; опубл. 27.08.2002.Г. Бюл.№ 24.
5. Дезинфекционное средство «Лесептик»/Пат. РФ 2197994С2;опубл.
10.02.2003 г. Бюл. № 4. - 6с.
6. Дезинфицирующее средство/Пат. РФ 2224544С1;опубл. 27.02.2004
г. Бюл. № 6.
7. Способ бактериологического выявления нокардиоформных
актиномицетов / Пат. РФ 2321636С1;опубл. 10.04.2008 г. Бюл.№ 10.
8 Питательная среда для выделения из биологичекого материала и культивирования микобактерий / Пат. РФ 2315812;опубл. 27.01.2008г. Бюл. №3.
9. Способ дифференциации аллергических реакций на ППД-
туберкулин для млекопитающих животных/ Пат. РФ 2288953С1; опубл. 10.
12. 2006 г. Бюл. №34.
Способ оценки антагонистической активности молочнокислых бактерий кишечной группы к патогенным микобактериям с использованием двухслойной среды / Пат. РФ 2317332С1; опубл. 20.02.2008г. Бюл. №5.
Плотная питательная среда для культивирования микобактерий/ Пат. РФ 2320716;опубл. 27.03.2008 г. Бюл. № 9.
Питательная среда для культивирования микобактерий и нокар-диоформных актиномицетов/ Пат. РФ 2322495;опубл.20.04.2008 г.Бюл. №11.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и одобрены на международной конференции «Профилактика диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных» (Ульяновск, 2006); симпозиуме в НИИ по изучению лепры «Иммунодиагностика и иммунореа-билитация при лепре, туберкулёзе и других хронических заболеваниях» (Астрахань, 1998); Всероссийской научно-практической конференции: Сельскохозяйственная наука Республики Мордовия (Саранск ,2005); конференции ведущих учёных России, СНГ и др. стран «Научные основы профилактики и лечения болезней животных» в Уральском НИВИ, (Екатеринбург, 2005); научной конференции посвященной 85-летию академика РАМН И.Н. Блохиной «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний» (Нижний Новгород, 2006); научно-практ. конф. «Новые технологии в повышении сохранности с.-х. животных» (Нижний Новгород, 2007, 2008).
Публикации: Основные научные положения диссертации изложены в З.В научных работах, в том числе ІЯ работ опубликованы в изданиях, регламентированных ВАК РФ для докторских диссертаций, которые отражают основное содержание диссертации. Материалы диссертации защищены 12 патентами РФ:.
Личный вклад соискателя. Представленная диссертационная работа является результатом 13-летних научных исследований автора. Изучение па-толого-морфологических, биологических, серологических исследований патологического материала, разработка дезинфектанта, способов деконтамина-ции патологического материала, выделение культур микобактерий и нокар-диоформных актиномицетов, изучение, биологических и серологических свойств, способов дезинфекции животноводческих помещений, выполнены лично Слининой К.Н. По материалам собственных исследований диссертантом лично и в соавторстве с Лазовской А.Л., Воробьёвой З.Г. опубликовано J.8 научные работы в том числе, 1$ работ в изданиях, регламентированных ВАК РФ для докторских диссертаций. Соавторы опубликованных научных статей подтверждают отсутствие заимствования их данных со стороны Слининой К.Н. (справки от А.Л. Лазовской и З.Г. Воробьёвой представлены в диссертационный совет).
Выражаем искреннюю благодарость доктору медицинских наук, профессору Лазовской Алле Леоновне, доктору биологических наук Воробьёвой Зое Глебовне за научные консультации и помощь при планировании, выполнении и анализе полученных результатов данной работы, выражает искреннюю благодарность за помощь в организации и выполнении данной работы директору ГНУ научно-исследовательского ветеринарного института Нечернозёмной зоны РФ доктору ветеринарных наук, профессору, член-корреспонденту РАСХН П.Н. Сисягину, зам директора по научной работе З.Я. Косорлуковой, официальным оппонентам: заслуженному деятелю науки РФ, доктору ветеринарных наук, профессору Н.П. Овдиенко, доктору ветеринарных наук А.И. Молеву, доктору ветеринарных наук В.Л. Кувшинову. Внедрение результатов исследований. Научные разработки внедрены в сельскохозяйственные предприятия Российской Федерации (Рязанской, Нижегородской, Орловской областей, в Республике Саха (Якутия), в практику хозяйств СК Дзержинский, совхоз «Горьковский», свиноводческого комбината ОАО «Ильиногорское»,», в Орловской области в ОАО «Знаменский» в
19 работу ГУЗ НО областного и городского противотуберкулёзных диспансеров, Нижнего Новгорода.
Основные положения, выносимые на защиту: - представитель но-кардиоформных актиномицетов Rhodococcus equi, а так же Corynebactermm pseudotuberculosis являются причиной положительных туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота и свиней;
роль родококков и коринебактерии в патологии животных;
антигенный диагностикум (ЛТА) для прижизненной диагностики туберкулёза в реакции агглютинации латекса (РАЛ);
- культурально-биохимические, биологические, хемотаксономические
и серологические свойства микобактерий, нокардиоформных актиномице
тов и коринебактерии.
роль М. хепорі в возникновении патологоанатомических изменений сходных с туберкулёзом;
новые питательные среды на основе гумивита и агара в идентификации микобактерий и нокардиоформных актиномицетов;
новый поливалентный дезинфектант «Лесептик» для предпосевной деконтаминации патологического материала от положительно реагирующих на туберкулин сельскохозяйственных животных и больных туберкулёзом людей;
новый способ применения дезинфектанта «Лесептика» для дезинфекции животноводческих помещений в составе 10% гашёной извести, приготовленной на 1% растворе препарата и в виде 0,7-1,0% раствора для обработки обуви в дезинфекционных ваннах;
новый способ консервации для длительного хранения микроорганизмов.
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 21? страницах компьютерного текста, содержит разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, практические приложения. Работа включает 40 таблиц и 12 рисунков, 476 источников литературы, в том числе 131 работу зарубежных авторов.
Эпизоотическая ситуация по туберкулёзу и нокардиоформным актиномицетным инфекциям в НЗ РФ
В России туберкулёз крупного рогатого скота начали регистрировать с 1892 г. Эта болезнь наносит значительный экономический ущерб животноводству и представляет угрозу для здоровья людей. Борьба с туберкулёзом животных была и остаётся в нашей стране проблемой государственной важности и является одной из важнейших задач ветеринарной службы страны. Актуальность проблемы возросла в связи с социально-экономическими преобразованиями и реформированием сельскохозяйственного производства.
Анализ данных показывает, что число регистрируемых пунктов неблагополучных по туберкулёзу крупного рогатого скота заметно возрасло.
Среднегодовой темп роста прироста этого показателя был достаточно велик - 6,3%. В этот период явно сказывались последствия перевода животноводства на промышленную основу и ухудшение условий содержания и кормления скота на крупных комплексах и фермах, особенно в зонах развитого молочного скотоводства. Форсированное накопление возбудителя при появлении больных животных на промышленных фермах приводило к интенсивному перезаражению скота и возникновению крупных и потому особо опасных эпизоотических очагов.
Начиная с 1990 года обстановка стала изменяться в лучшую сторону. Если на 1 января 1977 года в Российской Федерации регистрировалось 1945 пунктов, то на 1 января 2003 года только 196, что в 10 раз меньше.
Заметно снижался и показатель заболеваемости: если в 1987 году было выявлено 242,0 тыс. голов больного туберкулёзом скота, что составило 0,4% от поголовья крупного рогатого скота на начало года, то в 2002 году выявлено 6,6 тыс. голов, или 0,02%. Аналогичным образом менялись в последние годы и другие важные показатели, характеризующие эпизоотическую обстановку. Уже с 1989 года число оздоровлённых за год пунктов стало превышать число вновь выявленных. В 2002 году было оздоровлено от туберкулёза крупного рогатого скота 108 неблагополучных ферм, а выявлено новых очагов инфекции 71.Тенденция снижения напряжённости эпизоотической обстановки по данному заболеванию подтверждается результатами ветсанэкс-пертизы при убое животных. Вместе с тем, в ряде регионов страны добиться решительных сдвигов в деле оздоровления животноводства от туберкулёза не удалось. В настоящее время туберкулёз крупного рогатого скота регистрируется в 34 субъектах Российской Федерации. При этом в 7 субъектах эта болезнь имеет широкое распространение - более 10 неблагополучных пунктов в каждом из них. Это Волгоградская (23 пункта) Новосибирская (23) Саратовская (18), Оренбургская (16), Курганская (11), Ставропольский край (12), Северо-Осетинская республика (13) [19, 81, 129, 154, 208, 209, 309].
В 2001-2007 годах туберкулёз крупного рогатого скота регистрировался в хозяйствах следующих областей и республик Северо-Восточного региона: в Мордовской республике, Свердловской области, Пермской области. В Нижегородской области за последние 9 лет туберкулёз сельскохозяйственных животных не выявлялся (табл.1). Такая достаточно благополучная отчётность по туберкулёзу в значительной степени связана со значительным сокращением поголовья скота в хозяйствах Российской Федерации. Возросшее в последнее десятилетие в нашей стране внимание к туберкулёзу сельскохозяйственных животных и людей имеет веское обоснование и связано с целым рядом причин, хотя актуальность этой проблемы всегда оставалась острой для ветеринарных и медицинских специалистов ввиду огромного экономического и социального ущерба, наносимого туберкулёзом. Нельзя не отметить, что в определённые периоды советской России благодаря определённым усилиям государственных органов власти, ветеринарной и медицинской служб были досгтигнуты значительные успехи в оздоровлении животноводческих хозяйств и населения от этой опасной антропозоонозной инфекции, позволившие существенно сократить заболеваемость животных и людей туберкулёзом. Однако в последние годы эпидемическая и эпизоотическая обстановка по туберкулёзу остаётся весьма тревожной.О существенном возрастании в последние годы количества случаев заболевания людей туберкулёзом свидетельствуют данные Минздрава РФ, а также сообщения средств массовой информации (печати, радио, телевидение). Касаясь эпизоотологи-ческих и эпидемиологических аспектов проблемы туберкулёза, необходимо учитывать, что заражение людей и животных может происходить не только по линии «от человека к человеку» или «от животного к животному», но также и в результате передачи человеку микобактерий бычьего вида (Mycobacterium bovis), а млекопитающим животным - микобактерий человеческого вида (Mycobacterium tuberculosis).
Трудности и сложности борьбы с туберкулёзом обусловлены многими обстоятельствами, к числу которых относятся структурные и биологические особенности возбудителя болезни, в частности особый химический состав микробной клетки, обеспечивающий высокую устойчивость бактерий к воздействию физических факторов и дезинфицирующим средствам, их продолжительную выживаемость во внешней среде, способность адаптироваться, изменяться (переходить в L-форму) и длительно сохранять жизнеспособность в неблагополучных условиях обитания [4, 7, 8, 9, 10, 11, 244].
Идентификация микобактерий и нокардиоформных актиномицетов, вызывающих положительные туберкулиновые реакции и заболевания сельскохозяйственных животных
В литературе существуют многочисленные сообщения о том, что наряду с возбудителем туберкулеза из организма человека и животных нередко выделяют микобактерии, которые по своим свойствам отличаются от мико-бактерий туберкулеза [Е. Runyon 1959, 1960; Meissner, 1960; В.А. Кузяев, 1970; Д. Яначкова, 1970; М.П. Зыков и соавт., 1971; К. Dedie, W. Schoene, 1971; А.Е. Рубахин, Н.М. Макаревич, Д.Я. Баканова, 1972; P.O. Драбкина [и др.], 1974; Ю.К. Вейсфейлер, 1975 [и др.], а также нокардиоформные актино-мицеты и коринебактерии [Н.М. Колычев [и др.] 136; А.Л. Лазовская, К.Н. Слинина [и др.] 171, 173, 284, 285; О.А. Нестеренко, Е.И. Квасников, Т.М. Ногина, 230, 231; G.F.Prescoort 421, 422; G.A.Yager 475; A. Kolman, J. Baess [etal.] 392; M. Goodfellow, D.E. Minikin 380].
В ряде случаев выделенные микобактерии оказались этиологическим фактором различных заболеваний у людей и животных и были названы нетуберкулёзными так как этим подчеркивается их отличие от М. tuberculosis и М. bovis. Бактериологическая и биохимическая дифференциация таких нетуберкулёзных микобактерии позволила выделить 6-8 таких условно-патогенных видов [104, 108, 109]. Особый интерес для наших исследований представляют нокардиоформные актиномицеты, коринебактерии и медленнорастущие нетуберкулёзные микобактерии. При проведении массовых аллергических исследований туберкулином крупного рогатого скота в благополучных по туберкулезу стадах иногда обнаруживали положительные реакции на туберкулин, а из органов таких животных в ряде случаев выделяли нетуберкулёзные микобактерии, но при вскрытии не обнаруживали патологических изменений, свойственных туберкулезу [273, 274, 278, 284, 285].
Одним из малоизученных, но достаточно важных для млекопитающих условно-патогенных микроорганизмов, являются родококки (Rhodococcus), относящиеся к нокардиоформным микроорганизмам или актиномицетам [171, 173, 217, 218, 240, 284, 285, 349, 364, 369].
Филогенетическая группа обозначенная как «нокардиоформные акти-номицеты» включает роды Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus [352, 380, 399, 422, 431, 444]. Все актиномицеты внутри этой группы-аэробы, грам+, каталазоположительны и морфологически разнообразны. Коринебактерии, многие родококки и некоторые микобактерии имеют типичную морфологическую форму в виде разветвленного мицелия с последующим фрагментированием на бациллярные или коккоидные элементы. Нокардии и некоторые микобактерии образуют воздушные гифы, причем иногда они не видны невооруженным глазом, но бывают покрыты полностью воздушным мицелием в виде белого порошка. Родококки не имеют воздушного мицелия, что морфологически отличает их колонии от колоний нокардии и микобактерии [121, 136]. Нокардиоформные актиномицеты лучше характеризовать на базе химических критериев. Все они содержат мезодиами-нопимелиновую кислоту в качестве диаминовой кислоты пептидогликана клеточной стенки. Клеточная стенка содержит арабинозу и галактозу в качестве превалирующих Сахаров, миколовые кислоты, большое количество насыщенных и не насыщенных жирных кислот, дифосфатидилглицерол, фос-фатидилинозитол, маннозиды в составе большой части фосфолипидов. Представительство таксона подтверждается и серологическими методами. Большинство исследователей, работавших иммунодиффузионной техникой, обнаруживали общие антигены у коринебактерии, микобактерии, нокардии и ро-дококков, что имеет большое значение при аллергодиагностике туберкулёза [69, 104, 105, 125, 128, 155, 156, 484, 488, 490]. Из исследований очевидно, что родококки, в противоположность коринебактериям, содержат фосфати-дилэтанолами и имеют ДНК с большим содержанием ГЦ [231, 230]. Кроме того, у родококков обнаружена туберкулостеариновая кислота, которой нет у коринебактерий. Наиболее четко различаются эти актиномицетные таксоны по составу миколовых кислот, выявляемых методом газожидкостной хроматографии; это отражено в работах Т.В. Коронелли, А.Л. Лазовской, К.Н. Слининой, З.Г. Воробьёвой [147, 148, 150, 171, 173]. В роду Rhodococcus насчитывается более 20 видов, однако значимы для патологии млекопитающих виды R.equi и R.bronchialis. R.equi вызывает родококкоз у лошадей, свиней и крупного рогатого скота. Родококкоз впервые обнаружили у лошадей, выделенные при этом заболевании штаммы получили название R.equi. Почти вся известная литература по родококкозу у животных основана на заболевании жеребят [74, 171, 173, 352, 373, 422, 431]. R.bronchialis является причиной легочных заболеваний у людей, особенно при наличии иммунодефицитов различного происхождения.
R.equi и R.bronchialis установлены как хорошие четкие виды на базе химических, иммунобиологических, фенотипических и серологических исследований. Облигатные аэробы, морфология клеток - палочки и кокки. Оптимум роста - 28-30С, колонии в S-форме, белые, бледно-розовые, оранжевые, с неровными краями. Родококки используют для своего питания широкий спектр соединений в качестве источников углерода и азота. Миколовые кислоты содержат 34-38 атомов углерода, имеют от 0 до 4 двойных связей, при пиролизе образуют эфиры миколовых кислот — 12:0, 14:0, 16:0. Состав ДНК-66-72% ГЦ [147, 148, 150, 171, 174, 185, 195].
Материалы и методы исследований
Работа выполнена в 1995-2008 гг. в рамках федеральной программы фундаментальных прикладных исследований в отделе инфекционных и инвазионных болезней сельскохозяйственных животны ГНУ Научно-исследовательского ветеринарного института Нечернозёмной зоны РФ Российской акдемии сельскохозяйственных наук, в хозяйствах Нижегородкой, Рязанской, Орловской областей, в ГУЗ НО областном и городском туберкулёзных диспансерах г. Нижнего Новгорода, в Центральном научно-исследовательском и проектном институте лесохимической промышленности (ЦНИЛХИ).
Патологический материал получали от животных из ОАО «Ильиногор-ское», совхоза «Горьковский» и «Дзержинский» Нижегородской области, из 8 хозяйств Рязанской области, Орловской области из ОАО «Знаменский» и Республики Саха (Якутия).
Патологоанатомические исследования проводили в хозяйствах при убое и падеже животных. Отбирали образцы материала (лимфоузлы, кусочки органов: лёгких, печени, сердца, почек, стенок кишечника, мышцы шейные и ягодичные, а также пробы кормов из различных серий, для бактериологических исследований, посевов и заражения лабораторных животных.
Патологический материал и образцы кормов для посева обрабатывали по методике А.П. Аликаевой - 5-6% раствором серной кислоты, высевали на плотные питательные среды Левенштейна-Иенсена и Финн-2, выращивали при температуре 25, 37, 42, 52С. Из выросших через 3-45 дней колоний S- и R- формы делали мазки и окрашивали по Цилю-Нильсену и по Бою, а по мере необходимости по Грамму и Романовскому-Гимза (Рекомендации, Омск, 1988; справочник, Москва «Колос». 1981). M. smegmatis № 7 (ГИСК имени Л.Тарасевича) Nocardia asteroides (ГИСК имени Л. Тарасевича) М. fortuitum (ГИСК имени Л. Тарасевича) М. flavescens - свежевыделенные штамм (п=2) М. intracellular — свежевыделенные штаммы (п=2) Rhodococcus equi - свежевыделенные штаммы (п= 18) Corynebacterium pseudotuberculosis - свежевыделенные штаммы (n = 4)
В экспериментах использовали так же штаммы микроорганизмов, полученные из ГИСК имени Л.Тарасевича (Москва): Proteus mirabilis №237, Proteus vulgaris №177, Shigella flexneri № 170, № 337, Shigella sonnae № 5063, № 2802, Salmonella typhimurium № 111, Escherichia coli M-17, Pseudomonas aeruginosa № 28, Enterobacter faecalis № 4, а также штаммы, полученные нами при посевах патологического материала от свиней свинокомплекса ОАО «Ильиногорское»: Escherichia coli (n=41), E.vulgaris (n=2), Salmonella sp.p. (n=5), Staphylococcus aureus (n=3).
Исследование осуществляли на мышах беспородных (обоего пола) массой 19-20 г (п=50), морских свинках (обоего пола) массой 250-300 г (п=15), кроликах (обоего пола) массой 2,0-2,5 кг (п=6), поросятах новорожденных -350-500 г (п=6).
Лабораторных животных- кроликов, морских свинок и белых мышей, а так же трёхдневных поросят заражали как непосредственно патологическим материалом от животных, так и бактериальной массой культур, выросших на средах. Все опытные культуры для заражения животных брали после 3-5-го пассажа с плотных яичных сред. Токсичность родококков и коринебактерий изучали на новорожденных поросятах, заражая их интраназально в дозе 0,3 мл суспензии, содержащей 500 млн. микробных тел в 1 мл. При выполнении экспериментов на животных руководствовались «Правилами гуманного обращения с лабораторными животными» [2003]. Культурально-биохимические и хемотаксономические исследования
Исследовали скорость роста штаммов свежевыделенных микобактерий, родококков и коринебактерий, оптимальный рост при различных температурах: 25, 37, 42, 45, 52С. Рост на различных дифференциальных средах: на плотной яичной среде с салицилатом Na, с 5% хлористым натрием, с NaNCte, с теллуритом калия.
