Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1 Биологические свойства сальмонелл 9
1.2 Сальмонеллез кур, эпизоотологические данные 15
1.3 Клинические признаки и патологоанатомические изменения у кур при сальмонеллезе 17
1.4 Бактериофаги, их выделение и биологические свойства 20
1.5 Взаимодействие фага с бактериальной клеткой 26
1.6 Практическое применение препаратов бактериофагов и критерии отбора производственных штаммов для их изготовления 34
1.7 Специфическая профилактика сальмонеллеза птиц 38
1.8 Заключение по литературному обзору 43
2. Собственные исследования 45
2.1 Материалы и методы 45
2.2 Результаты исследований 59
2.2.1 Этиологическая структура сальмонеллеза птиц в Российской Федерации 59
2.2.2 Выделение фагов Sal. typhimurium 62
2.2.3 Биологические свойства фагов Sal. typhimurium 63
2.2.3.1 Морфология негативных колоний фагов Sal. typhimurium 63
2.2.3.2 Морфология вирионов фагов Sal. typhimurium 68
2.2.3.3 Определение способности фагов Sal. typhimurium к образованию литического фермента 76
2.2.3.4 Спектр литической активности фагов 77
2.2.3.5 Адсорбционные свойства фагов Sal. typhimurium 79
2.2.3.6 Характеристика фагов Sal. typhimurium в цикле одиночного развития 80
2.2.3.7 Серологические свойства фагов 83
2.2.3.8 Изучение расселения и сроков персистирования бактериофагов в организме лабораторных животных 87
2.2.3.9 Лечебная эффективность бактериофага Sal. typhimurium на лабораторных животных 89
2.2.4 Аттенуированные фагоустойчивые штаммы Sal. typhimurium 91
2.2.4.1 Изучение расселения и сроков персистирования аттенуированных фагоустойчивых штаммов Sal.typhimurium в организме лабораторньж животных 94
2.2.5 Испытание эффективности экспериментального сальмофага в лабораторных условиях 95
Обсуждение результатов 99
Выводы 106
Практические предложения 107
Список литературы 108
Приложение 121
Введение к работе
Актуальность темы. Развитие промышленного птицеводства неизбежно сопровождается концентрацией поголовья птицы и увеличением заболеваемости инфекционными болезнями, в том числе и сальмонеллезом.
Сальмонеллез относится к числу зоонозов, чрезвычайно широко распространенных в России и других странах мира. Одним из основных резервуаров этих микробов в природе являются дикие и домашние птицы, в первую очередь, куры. По данным ветеринарной отчетности Россельхознадзора, в России за последние пять лет выявлено снижение количества неблагополучных по сальмонеллезу пунктов (график 1, табл 1). В то же время число заболевших сальмонеллезом птиц возросло с 2003 года более чем в 40 раз.
Эпизоотическая ситуация по сальмонеллезу кур в России
График 1
1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 —-количество неблагополучных пунктов
--заболело (тысяч голов)
—к- пало (тысяч голов)
Таблица 1
Изучение этиологической структуры сальмонеллеза птиц показало, что основными сероварами сальмонелл, инфицирующими птицу в Российской Федерации, являются: Sal. enteritidis, Sal. gallinarum-pullorum и Sal. typhimurium.
Помимо нанесения ущерба птицеводческой отрасли, сальмонеллез имеет большую социальную значимость. Инфицированная домашняя птица становится резервуаром и источником сальмонелл для человека. При расследовании вспышек сальмонеллеза установлено, что инфицирующая доза возбудителя может составлять от 10 до нескольких сотен клеток. Возможность заражения небольшими дозами сальмонелл привела к увеличению эпидемиологической значимости таких продуктов питания, как мясо кур и яйца в качестве факторов передачи сальмонелл.
По данным Роспотребнадзора, заболеваемость сальмонеллезами в 2006 г. стабилизировалась на уровне 31,96 на 100 тыс. населения, что на 9 % выше, чем в 2005 г. В этиологической структуре сальмонеллеза, как и в предыдущие годы, преобладают сальмонеллы группы D (83 %) и, прежде всего, Sal. enteritidis.
Ежегодно в стране регистрируется до 30 крупных вспышек сальмонеллеза пищевого характера с числом пострадавших от 500 до 1500 человек, причиной которых являются нарушения технологического процесса приготовления блюд, правил и сроков хранения продукции, мойки и дезинфекции оборудования и инвентаря в столовых и пищеблоках.
По сообщению Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека на III Международном ветеринарном конгрессе по птицеводству (А.А. Мельникова, 2007г), в структуре острых кишечных инфекций населения в Российской Федерации случаи заболевания людей сальмонеллезом (31%) занимают второе место после дизентерии (46%).
Таким образом, ситуация по сальмонеллезу в настоящее время не может считаться благополучной, что делает необходимым применение в практике ветеринарии и здравоохранения эффективных мер борьбы с заболеванием.
Профилактика и борьба с этой инфекцией у кур в промышленном птицеводстве сводятся к проведению организационных и ветеринарно-санитарных меро-
приятии, выявлению бактериологическими или серологическими методами зараженной птицы и ее ликвидации, применению антибиотиков и других химиотера-певтических препаратов [50]. Однако эффективность данных мер не обеспечивает благополучие птицеводческих хозяйств по сальмонеллезу. По мнению комитета экспертов ВОЗ, проблема не может быть решена без применения эффективных средств специфической иммунопрофилактики сальмонеллеза кур [188].
В разных странах были предложены живые, инактивированные и химические вакцины против сальмонеллеза кур [86,96,108,122,125], однако только их применение не решало проблемы защиты цыплят первых дней жизни и санирования птицепоголовья от бактерионосительства [52]. Именно по этой причине в последнее время возрастает интерес к фаговым препаратам, которые обладают лечебным эффектом и обеспечивают санирование птицепоголовия от бактерионосительства.
Одним из них является комплексный препарат «сальмофаг» против сальмонеллеза вызываемого Sal. enteritidis, который имеет в своем составе вакцинный генетически маркированный, фагоустойчивый штамм Sal. enteritidis и высокоактивные бактериофаги к эпизоотическим штаммам сальмонелл [51].
Цель и основные задачи исследования. Цель работы - селекционировать фагоустойчивые штаммы Sal. typhimurium и бактериофаги, перспективные для использования их в качестве производственных при изготовлении лечебно-профилактического препарата против сальмонеллеза кур (сальмофага).
Для достижения цели работы перед нами были поставлены следующие задачи:
Выделить и селекционировать бактериофаги Sal. typhimurium;
Изучить биологические свойства штаммов бактериофагов Sal. typhimurium: морфологию негативных колоний, морфологию вирионов, способность к образованию литического фермента (Е-признак), спектр литической активности, адсорбционные свойства, характеристики в цикле одиночного развития, серологические свойства.
7 3. Селекционировать фагоустойчивые высокоиммуногенные штаммы Sal. typhimurium.
Изучить расселение и сроки персистирования бактериофагов и фаго-устойчивых аттенуированных штаммов в организме лабораторных животных (белые мыши, цыплята).
Изучить лечебную и профилактическую эффективность фагового и вакцинного компонентов сальмофага Sal. typhimurium на лабораторных животных (белые мыши, цыплята).
Изучить лечебную и профилактическую эффективность фагового и вакцинного компонентов комплексного Сальмофага энтеритидис и тифимури-ум на лабораторных животных (белые мыши, цыплята).
Научная новизна. Выделены и селекционированы фаги Sal. typhimurium, изучены их биологические свойства (морфология негативных колоний, вирионов, способность к образованию логического фермента, спектр ли-тической активности, адсорбционные свойства, характеристики в цикле одиночного развития, серологические свойства). Определены сроки персистирования бактериофагов в организме мышей и цыплят, которые ограничены в среднем 10 сутками.
Селекционированы фагоустойчивые аттенуированные штаммы Sal. typhimurium, изучены их культуральные, морфологические, ферментативные, антигенные свойства, иммуногенность и остаточная вирулентность. Показано, что длительность персистирования аттенуированных штаммов Sal. typhimurium в организме цыплят ограничивается 15, а белых мышей — 26 днями.
В лабораторных условиях при испытании на белых мышах и цыплятах экспериментального препарата, доказано, что введение в состав коммерческого сальмофага компонентов Sal. typhimurium расширяют спектр его лечебного и профилактического действия.
Практическая значимость работы. Селекционированные фагоустойчивые аттенуированные штаммы и бактериофаги Sal. typhimurium могут быть
8 использованы как для создания сальмофага Sal. typhimurium, так и для введения в состав коммерческого препарата Сальмофага энтеритидис.
Разработан проект нормативной документации на Сальмофаг, включающий, в дополнение к Sal. enteritidis, новые фаговый и вакцинный компоненты Sal. typhimurium.
Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены и получили положительную оценку на:
Международной научной конференции «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для человека и животных» -Ульяновск, 2006 г.
Конференции молодых ученых ФГУ «ВГНКИ» «Лекарственные средства для животных и корма. Современное состояние и перспективы» - Москва, 2007 г.
Международной научно-практической конференции молодых ученых «Достижения молодых ученых в ветеринарную практику», посвященной 50-летию ФГУ «ВНИИЗЖ» - Владимир, 2008 г.
- Международной научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел», посвященной 110-летнему юбилею Всероссийского РЖИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко - Москва, 2008 г.
Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано б статей, из них две работы - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
На защиту выносятся:
Результаты изучения биологических свойств выделенных нами бактериофагов Sal. typhimurium.
Результаты изучения биологических свойств селекционированных нами фагоустойчивых аттенуированных штаммов Sal. typhimurium.
Результаты изучения профилактической и лечебной эффективности экспериментального моновалентного сальмофага против сальмонеллеза вызываемого Sal. typhimurium и бивалентного сальмофага против сальмонеллеза вызываемого Sal. enteritidis и Sal. typhimurium у цыплят в лабораторных условиях.
Биологические свойства сальмонелл
Возбудитель болезни принадлежит к роду Salmonella, семейству Enterobacteriacea. Сальмонеллы - мелкие палочки с закругленными концами от 2 до 5 ммк длиной и 0,7-1,5 ммк шириной, некислотоустойчивые и не формирующие эндоспор и микроцист [98]; за счет перитрихиальных жгутиков, как правило, подвижные.
Согласно классификации сальмонелл (1992), которая отражает последние достижения в таксономии, род Salmonella состоит из двух видов: Sal. enterica и Sal. bongori. Salmonella enterica, в свою очередь, подразделяется на 6 подвидов, которые различаются по определенным биохимическим характеристикам. Они обозначаются номерами или собственными именами - Sal. enterica (I), salamae (II), arizonae (Ilia), diarizonae (Illb), houtenae (IV), indica (VI) и bongori (V). Для сероваров Sal. bongori, символ V был сохранен, чтобы избежать недоразумений с сероваром, называющимся Sal. enterica подвид enterica. Штаммы Salmonella классифицируются на серовары на основе внешнего различия ли-пополисахаридных антигенов (О) и флагеллярных белковых антигенов (Н) в соответствии со схемой Кауфмана-Уайта; сейчас насчитывается примерно 2500 сероваров сальмонелл. Их количество постоянно увеличивается [87].
Основные возбудители сальмонеллёзов входят в состав I и II подвидов. Деление на подвиды имеет определённое эпидемиологическое значение, так как естественным резервуаром сальмонелл I подвида служат теплокровные животные, а для представителей остальных подвидов - холоднокровные животные и окружающая среда.
Культуральные свойства. Сальмонеллы являются факультативными анаэробами. Большинство сальмонелл хорошо растет на обычных питательных средах, образуя колонии диаметром 2-3 мм, однако некоторые серовары (Sal. aboitusequi, Sal.typhisuis, Sal.abortusovis) образуют более мелкие колонии диаметром около 1мм.
Оптимальная температура роста 37С, рН среды 7,0 - 7,2, однако они могут расти и при рН ниже 7,0 и выше 8,0. Хорошо растут на обычных питательных средах: МПА, МПБ, средах Эндо, Левина, Плоскирева, висмут-сульфитном агаре и др.
На мясо-пептонном бульоне через 3-4 часа роста при температуре 35-37С сальмонеллы образуют равномерное помутнение, а через 18-24 часа на дне пробирки выпадает небольшой осадок, легко разбивающийся при встряхивании в равномерную взвесь. Отдельные штаммы сальмонелл, свежевьщеленные из органов павших животных, при росте в бульоне образуют легко разбивающуюся пленку [60,98].
На питательном агаре - колонии прозрачные, нежные, голубоватые; на среде Эндо - розоватые, прозрачные; на среде Плоскирева — бесцветные, но выглядят более плотными и мутноватыми. На агаре с эозином-метиленовым синим сальмонеллы растут в віще прозрачных колоний, иногда с фиолетовым оттенком. На висмут-сульфит агаре почти все сальмонеллы образуют черные колонии с характерным металлическим блеском, при этом наблюдается прокрашивание среды под колонией в черный цвет, исключение составляют Sal. paratyphi А и некоторые другие серовары, которые на этой среде образуют светлые, нежные зеленоватые колонии.
В качестве сред накопления используют селенитовую, магниевую, среды Кауфмана, Мюллера, Киллиана. По данным ВОЗ, наиболее эффективной селективной средой для изоляции и обогащения сальмонелл является среда Раппо-порта-Вассилиади.
Сальмонеллы хорошо окрашиваются водными растворами анилиновых красок, по Граму окрашиваются отрицательно. В мазках из культур, выделенных от павших животных, возможно биполярное окрашивание микробов [6,85].
Ферментативные свойства. В современной системе идентификации сальмонелл среди других представителей семейства Enterobacteriaceae используют ряд биохимических тестов, основанных на метаболических особенностях бактерий [60,98].
Сальмонеллы не ферментируют сахарозу, не разлагают лактозу, адонит, не расщепляют салицин и мочевину, не образуют индола, образуют сероводород, реакция Фогеса-Проскауэра отрицательная, реакция с метиловым красным положительная. Глюкозу ферментируют все типы сальмонелл с образованием газа, однако встречаются штаммы Sal. typhimurium, Sal. typhisuis, Sal. abortusequi, Sal. dublin, Sal. anatum, Sal. gallinarum, разлагающие глюкозу без образования газа.
Ферментативные свойства сальмонелл разнообразны не только у представителей отдельных подвидов, но могут варьировать в пределах одного и того же серовара. Такая вариабельность в ферментации отдельных углеводов позволяет выявить в пределах отдельных сероваров стабильные биохимические варианты или биовары [87].
Такая дифференциация по биохимическим признакам целесообразна, прежде всего, в отношении наиболее широко распространенных на той или иной территории сероваров сальмонелл, к числу которых, в первую очередь, можно отнести Sal. typhimurium. Для подразделения этого серовара на биовары необходим набор тестов, по которым их удается дифференцировать. Так, известна укороченная схема, позволяющая быстро подразделить Sal. typhimurium на 4 стабильных биовара в зависимости от отношения изучаемых штаммов к рамнозе и инозиту, а также более расширенная схема определения по отношению к арабинозе, ксилозе, рамнозе, D- и і-тартратам, мукату и инозиту [87]. Также существует подразделение сальмонелл на фаговары. Оно основано на одном из самых важных свойств бактериофагов - специфичности по отношению к микробу-хозяину.
Сальмонелла в окружающей среде. Сальмонеллы способны длительно сохраняться во внешней среде, при этом при соответствующей температуре, рН и влажности они могут не только в ней переживать, но и размножаться. Так, в воде открытых пресных водоемов микроорганизмы выживают до 120 дней, в морской воде — до месяца, в водопроводной и сточной воде - месяцы. В пищевых продуктах возбудители сальмонеллеза живут и размножаются в течение длительного времени: в частности, в мясе и колбасе от 2 до 6 мес и более, в молоке, молочных продуктах, сливочном масле - 1,5-6 мес, в яйцах, сырах - год и более, в помете и фекалиях - месяцы и годы [40].
Сальмонеллы хорошо и длительно переносят низкие температуры (например, при 0-2 С - выживают в течение 5-6 мес), а при высоких - сравнительно быстро погибают (при кипячении погибают практически мгновенно, при 60-80С могут существовать в течение 2-40 мин). Для уничтожения сальмонелл внутри кусков мяса необходимо варить его в течение 2 и более часов.
Важное практическое значение имеет чувствительность сальмонелл к терапевтическим концентрациям антибактериальных препаратов.
В целом большинство свежевыделенных, особенно госпитальных штаммов сальмонелл полирезистентны к ампициллину, карбенициллину, левомице-тину, тетрациклину, доксициклину, метациклину, фуразолидону, энтеросепто-лу, интестопану, эритромицину и другим макролидам, бисептолу и другим лекарствам. Остается сравнительно достаточной чувствительность сальмонелл к терапевтическим концентрациям цефалоспоринов III поколения (клафоран, лонгацеф, цефобид и др.), аминогликозидов П-Ш поколения (гентамицин, си-зомицин, тобрамицин, амикацин, нетилмицин), фторхинолонов (офлоксацин, норфлоксацин, ципрофлоксацин, пефлоксацин), рифампицина, полимиксина, тиенама, интетрикса, нифуроксазида [45,49,77,144].
Антигенная структура. Антигенная структура сальмонелл представлена соматическим О-антигеном, жгутиковым Н-антигеном и капсульным К-антигеном.
О-антиген представляет собой комплексное соединение белков, полисахарида и липидов. Белковый компонент антигенного комплекса обусловливает его ан-тигенность и колициногенность, липидные- токсичность, а полисахарид - серологическую специфичность. Высоко полиморфный поверхностный полисахарид является частью липополисахарида (ЛПС), локализованного на внешней мембране.
Сальмонеллез кур, эпизоотологические данные
Сальмонеллез кур - инфекционная болезнь, характеризующаяся у молодняка явлениями септицемии, поражением органов дыхания и желудочно-кишечного тракта, а у взрослых птиц — хроническим течением с поражением репродуктивных органов у кур и бактерионосительством [10]. Американские исследователи разделяют сальмонеллез птиц на 3 категории. К первой категории относятся болезни птиц, вызванные неподвижными сальмонеллами - пуллороз цыплят, вызываемый Sal. pullorum и тиф взрослых птиц, вызываемый Sal. gallinarum. Вторая категория включает в себя все болезни, возбудителем которых являются подвижные серовары сальмонелл (в т.ч. и Sal. enteritidis), называя их паратифоидными инфекциями. К третьей категории они относят инфекции, вызванные подвижными представителями подвида Arizonae, специфичные для индеек [6,8,10,100,149,159,160].
К возбудителю сальмонеллеза восприимчивы куры, а также другие виды птиц, животных и человек [29]. Источником возбудителя инфекции являются больной молодняк птиц, взрослые куры-бактерионосители, а также индейки, цесарки (Sal. gallinarum-pullomm), утки, индюки (Sal. enteritidis, Sal. typhimurium) [40]. Существую также другие виды птиц и животных как источники возбудителя инфекции. Кроме того, источником возбудителя сальмонеллеза кур являются снесенные ими яйца (латентная инфекция) [6,12,17,23,29,40,85], хотя некоторые ученые считают, что возбудитель сальмонеллеза птиц вертикальным путем не передается, а заражение инкубационных яиц возможно горизонтально при нарушениях режима инкубации, насечках, бое, микротрещинах [23,85].
Больная птица и бактерионосители выделяют наибольшее количество возбудителя с пометом [23]. Факторами передачи возбудителя сальмонеллеза являются корма, вода, подстилка, кормушки, воздух, предметы ухода, почва, одежда и обувь обслуживающего персонала, а также инкубационные отходы. Первичный занос возбудителя на фермы чаще всего связан с завозом суточного молодняка, поступающего для выращивания из неблагополучных хозяйств, а также при заносе возбудителя с яйцом, необезвреженными боенскими отходами, кормами. Повторные вспышки сальмонеллеза кур в неблагополучных по этой инфекции хозяйствах возникают при совместном содержании молодняка с более взрослой птицей - сальмонеллоносителями, пополнении стад из неблагополучных ферм, переводе птиц в инфицированные помещения или на выгу-лы (без надлежащей дезинфекции) [9,12,23,85]. Сопутствующими факторами развития инфекции являются антисанитарные условия содержания, неполноценное и несбалансированное кормление, нарушение технологических схем кормления, скученное содержание, несоблюдение параметров оптимального микроклимата. В случае проникновения возбудителя на ферму в первую очередь заболевают слаборазвитые цыплята. Наблюдения показывают, что при появлении в хозяйстве сальмонеллеза инфекция распространяется тем быстрее и дает тем больший отход, чем в менее благоприятных условиях кормления и содержания находится птица [6,8,9,17,40,175].
Заражение кур происходит алиментарным, аэрогенным и трансовариаль-ным путями. Показано, что наиболее инвазионные сероварианты - Sal. typhi-murium и Sal. enteritidis, которые могут проникать в яичник еще до сформирования скорлупы. Заражение цыплят сальмонеллами через респираторный тракт часто происходит на фоне вирусных инфекций: инфекционного ларинготра-хеита, инфекционного бронхита и других, в том числе при иммунизации живыми вакцинными штаммами [150,166,172,177,178].
Джасит и Беард наблюдали, что после перорального введения одинаковой дозы Sal. typhimurium двухдневным, трехдневным и семидневным цыплятам самый высокий процент адгезии возбудителя к клеткам прямой кишки наблюдался у первых [105].
Инкубационный период болезни варьирует от 1 до 12-14 суток и зависит от дозы попавшего возбудителя, серовара сальмонеллы и его патогенности [6,8,10,12,29].
При заражении восприимчивой птицы сальмонелл обнаруживали в кишечнике, нерассосавшемся желтке, печени, желчном пузыре, сердце, красном костном мозге, селезёнке, фабрициевой сумке, репродуктивных органах, головном мозге, а также в яйцах, снесённых больными курами [23,29,41].
Материалы и методы
Штаммы бактериофагов использованные в работе:
1) Изоляты фагов Sal. typhimurium, выделенные нами из подстилочного материала и сточных вод птицефабрик;
2) Фаг Sal. enteritidis F-6.
Для работы использовали следующие штаммы:
1) Вирулентный штамм Sal. typhimurium №М-2;
2) Вирулентный штамм Sal. typhimurium 371Rif (рифампицин-устойчивый). Штамм по нашей просьбе любезно селекционирован в ГНЦ прикладной микробиологии, г. Оболенск, автор Светоч Э.А.;
3) Вирулентный штамм Sal. enteritidis S-7;
4) Аттенуированный штамм Sal. typhimurium №3, на основе которого селекционирован фагоустойчивый аттенуированный штамм Sal. typhimurium К5;
5) Фагоустойчивый аттенуированный штамм Sal. enteritidis R-6;
6) Эпизоотические и музейные штаммы Sal. typhimurium из коллекции ФГУ «ВГНКИ»;
7) Штаммы гетерологичных сероваров сальмонелл;
8) Музейные штаммы различных родов семейства Enterobacteriaceae.
Среды. Забуференная пептонная вода (Buffered Pepton Water (CM 509), среда Раппопорта-Вассилиади (Rappoport-Vassiliadis) Enrichment Broth (CM669), Висмут-сульфит-агар (Bismuth Sulphite Agar (CM201) фирмы Oxoid, среда Эндо фирмы Биотехновация, забуференный физиологический раствор, среды Гисса, трехсахарный агар, нитратный агар Симмонса, МПБ с 0,2 % KN03, среда Кларка, 1,7 %, 0,25 % и 0,07 % МПА, 40 % раствор КОН, 10 % раствор НС1, 5% спиртовой раствор а-нафтола, 1 % раствор крахмала и KJ, тест-полоски для определения индолообразования, набор реактивов для окраски по Граму.
Оборудование. Эксперименты проводили при использовании следующего оборудования: термостаты с температурой 37±1 и 42 ±1 С, водяная баня EL- 20, центрифуга «Zanetzki» модели Т-23 (ГДР), ультрацентрифуга L5-50 (Beckman, USA), ламинарный шкаф, микроскоп световой микробиологический, электронный микроскоп JEM-100S (JEOL), бытовые холодильники, фильтры стерилизующие с диаметром пор 0,22 мкм, пастеровские пипетки, мерные пипетки, бактериологические петли, спиртовая горелка, чашки Петри, пробирки бактериологические и др.
Животные. В работе использовали в качестве экспериментальных животных: белых беспородных мышей массой 14-16 (1720 голов), цыплят кросса Ломан Браун 1- 43 -дневного возраста (550 голов), кроликов массой 3,5-4,0 кг породы «Шиншилла» (21 голова).
Выделение изолятов фагов Sal. typhimurium. Выделение изолятов фагов сальмонелл проводили из сточных вод птицефабрик. В работе для выделения фагов использовали метод «обогащения», описанный Адамсом М [2].
По методу «обогащения», исследуемый материал засевали в МПБ (рН 7,2-7,4) совместно со штаммом сальмонелл, находящимся в логарифмической фазе роста, гомологичным искомому фагу. После культивирования в течение 18 часов при температуре 37 С, пробы фильтровали через фильтры с диаметром пор 0,22 мкм. Наличие фагов в пробах определяли по их литическому действию при высеве безмикробных фильтратов на чашки с МПА и в пробирки с МПБ, предварительно засеянных культурами сальмонелл 4-часового роста. Посевы совместно с контролями (рост культуры без фильтрата и фильтрат без культуры, добавленный в МПА) культивировали в течение 18-20 часов при температуре 37 С.
Изучение морфологии негативных колоний и выделение чистых линий фагов. Изучение морфологии негативных колоний фага проводили на плотных питательных средах, используя метод агаровых слоев, описанный Грациа.
Для сравнительной оценки негативных колоний использовали одну партию питательной среды, культивируя посевы в течение 18 часов при температуре 37 С. Негативные колонии сравнивали по характеру края колонии, размеру, прозрачности, наличии вторичного роста и характеру роста культуры вокруг колонии.
Чистые линии фагов получали последовательным клонированием морфологически однотипных негативных колоний.
Процесс клонирования повторяли 6-10 раз до получения однородной популяции негативных колоний.
Активность бактериофагов определяли общепринятыми способами - по количеству жизнеспособных фаговых частиц методом Грациа, и по литиче-ской активности фагов методом Аппельмана [2]. По методу Аппельмана в ряду пробирок с 4,5 мл бульона делали десятикратное разведение фага, внося в первую пробирку 0,5 мл фага. Затем в каждую пробирку вносили по 0,1 мл 18-часовой бульонной культуры соответствующего микроба. Учет реакции проводили через 3-4 и 18 часов культивирования при температуре 37 С. Титром фага считали то наибольшее разведение (последнюю пробирку), в котором фаг вызывал полный лизис гомологичного микроба при хорошем росте культуры в контроле [165].
По методу Грациа, в расплавленный и охлажденный до температуры 45 С МПА (0,7 %) вносили по 1 см десятикратных разведений фага и после добавления 0,1 см культуры индикаторных бактерий перемешивали и равномерно распределяли на слое МПА (1,2 %) в чашках Петри. После инкубации в течение 18-24 часов при температуре 37 С, определяли концентрацию жизне 48 способных фаговых частиц по количеству «стерильных пятен» на фоне сплошного роста индикаторной культуры.
Изучение морфологии вирионов фагов Sal. typhimurium. Приготовление препаратов фагов для электронного микроскопирования выполнены на базе Института генетики и селекции промышленных микроорганизмов.
Электронно-микроскопичеческие исследования фагов выполнены в Институте вирусологии имени Д.И. Ивановского совместно с сотрудником лаборатории структуры и морфогенеза вирусов Маныкиным А.А.
Выращивание, концентрирование и очистка фагов. Препараты фагов получали методом сливного лизиса на плотной питательной среде (1,7 % мя-сопептонный агар - МПА). В качестве верхнего слоя использовали 0,7 % МПА. Фаги элюировали физиологическим раствором в течение 4 ч. Для концентрирования фагов использовали метод дифференциального центрифугирования [19]. Полученный фаголизат центрифугировали на центрифуге «Zanetzki» модели Т-23 при 6000 об/мин в течение 30 мин. Супернатант отбирали и центрифугировали в угловом роторе Ti-45 при 25000 об/мин в течение 2 ч и температуре 4 С на ультрацентрифуге L5-50 (Beckman, USA). Осадок ресуспендиро-вали в фаговом буфере, содержащем 0,01 М трис-НС1, рН-7,5; 0,2 М NaCl и 0,002 М MgCl2.
