Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11
1.1. Особенности возбудителей сальмонеллеза голубей 11
1.2. Эпизоотологическая характеристика сальмонеллеза голубей 17
1.3. Лечебно-профилактические мероприятия при сальмонеллезе в голубеводстве 26
1.4. Бактериофаги и их применение при сальмонеллезе птиц 36
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 49
2.1. Материалы и методы исследований 49
2.2. Результаты исследований 59
2.2.1. Эпизоотическая ситуация по сальмонеллезу голубей в Московском регионе 59
2.2.2. Клинические признаки сальмонеллеза у голубей 67
2.2.3. Патологоанатомическае изменения при сальмонеллезе голубей 69
2.2.4. Выделение изолятов бактериофагов к Salmonella typhimurium из объектов внешней среды 70
2.2.5. Характеристика бактериофагов к Salmonella typhimurium 71
2.2.5.1. Морфология негативных колоний 71
2.2.5.2. Литическая активность 73
2.2.5.3. Спектр литической активности и специфичность действия бактериофагов Phagum Salmonella typhimurium 75
2.2.5.4. Изучение морфологии вирионов выделенных фагов 79
2.2.6. Изготовление препарата Бактериофаг тифимуриум 82
2.2.7. Экспериментальная инфекция сальмонеллеза голубей 84
2.2.8. Определение профилактического действия бактериофагового препарата в остром лабораторном опыте 87
2.2.9. Определение терапевтического действия бактериофагового препарата в остром лабораторном опыте 89
2.2.10. Определение терапевтической эффективности препарата Бактериофага тифимуриум в производственных условиях 91
2.2.11. Экономическая эффективность применения Бактериофага тифимуриум против салъмонеллеза голубей 95
2.2.12. Изучение лечебного действия Бактериофага тифимуриум на других видах птиц 96
2.2.13. Исследование возможности возникновения резистентности сальмонелл к бактериофагам 99
2.2.14. Выделение и селекция резервных бактериофагов для препарата Бактериофаг тифимуриум 101
2.2.15. Биологические свойства и морфология резервных фагов 103
3. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 109
4. ВЫВОДЫ 116
5. СВЕДЕНИЯ О ПРАКТИЧЕСКОМ ИСПОЛЬЗОВАНИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ 118
6. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ 118
7. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 119
8. ПРИЛОЖНИЕ 137a
- Особенности возбудителей сальмонеллеза голубей
- Эпизоотическая ситуация по сальмонеллезу голубей в Московском регионе
- Изучение морфологии вирионов выделенных фагов
Введение к работе
Актуальность темы. В последнее время в нашей стране и зарубе-жом широкое распространение получило голубеводство.
Однако, голуби также как домашняя птица, подвержены инфекционным заболеваниям, одним из которых является сальмонеллез. Среди бактериальных инфекций голубей сальмонеллез занимает одно из ведущих мест (42, 118, 127). Гибель голубей от этой инфекции может достигать 20-25%, а молодняка - до 80%. Заболевание наносит значительный ущерб, заключающийся помимо потерь от гибели птицы в отставании в росте и развитии переболевшей птицы, снижении оплодотворяемости голубок, недополучении приплода, потери спортивных и служебных качеств голубей. При этом больные и переболевшие птицы являются возможным источником инфицирования сельскохозяйственной птицы, животных и человека (42).
По данным Департамента ветеринарии Минсельхоза РФ сальмонеллез широко распространен среди голубей практически во всех регионах страны. Особую опасность заболевание представляет в густонаселенных городах, где много мест концентрации пищевых и бытовых отходов, большая численность диких синантропных птиц (86). Синантропная птица (голуби, воробьи, вороны и другие) концентрируется вблизи мест сбора мусора, торговли продуктами питания, водоисточников, зернохранилищ, возле животноводческих и птицеводческих комплексов. При этом птица, больная сальмонеллезом, становится источником возбудителя для животных и человека. После переболевания угрозу представляет сальмонеллоно-сительство, птица распространяет возбудителя через определенные биологические связи, в том числе посредством пищевых цепей (44, 82).
По данным ВОЗ, заболеваемость людей сальмонеллезом за последнее десятилетие возросла шестикратно, а в странах СНГ - в 7 раз. Причины заболевания многие исследователи связывают с загрязнением продуктов питания животного происхождения патогенными микроорганизмами
(16, 43, 82, 99, 165, 176). Причем, по данным Центра контроля болезней в США, изделия из домашней птицы продолжают быть одним из самых важных источников вспышек сальмонеллеза у людей (177).
Основной серовариант, вызывающий эпизоотический процесс на голубятнях относится к серогруппе В - S. typhimurium (90%). Кроме того, от голубей выделяли: S. enteritidis, S. hadat, S. heidelberg, S. gallinarum и другие. Необходимо отметить, что S. enteritidis (44-46%), S. gallinarum-pullorum (41-43%), S. typhimurium (8-10%) являются основными возбудителями сальмонеллеза кур; S. typhimurium — сальмонеллеза уток, гусей (80-90%); S. enteritidis, S. typhimurium — основные сероварианты, вызывающие пищевые токсикоинфекции человека (8,42, 58, 69, 71, 94, 113, 116,152).
Таким образом, борьба с сальмонеллезом голубей актуальна с нескольких сторон:
во-первых, для обеспечения санитарного благополучия и профилактики пищевых токсикоинфекции человека, особенно в условиях густонаселенных местностей с большой концентрацией пищевых и бытовых отходов и скоплением синантропных птиц;
во-вторых, для лечения и профилактики сальмонеллеза у клубных голубей: декоративных, спортивных, служебных, разведение которых становится все более популярным и дорогостоящим;
в-третьих, для профилактики сальмонеллеза в промышленном птицеводстве и животноводстве, где синантропные птицы могут быть источником возбудителя и разносчиком инфекции для гусей, уток, кур и молодняка сельскохозяйственных животных, пушных зверей.
В основе мероприятий по борьбе с сальмонеллезом уделяется большое внимание разработке и применению химиотерапевтических препаратов. Сложность борьбы с сальмонеллезом определяется быстрым ростом резистентности сальмонелл к антибиотикам и другим химиотерапевтиче-ским препаратам. Бесконтрольное применение антибактериальных средств
способствует усугублению ситуации и селекции антибиотикоустойчивых штаммов микроорганизмов (43, 44, 60,103, 119,128, 177).
Отмечается, что за последние годы произошел серьезный дрейф штаммов в сторону развития у них множественной резистентности к антибиотикам, не активны многие антибактериальные препараты последних поколений, никогда не использовавшиеся в голубеводстве и ветеринарии в целом. По данным Гебеша В.В. (2000 г.) большинство свежевыделенных, особенно госпитальных штаммов сальмонелл полирезистентны к 810 хи-миотерапевтическим препаратам различных групп. По данным Гусева В.В. (2003 г.), в ряде голубятен обнаруживали даже 100% устойчивость бактерий ко всем применяемым антибиотикам (34, 42, 44, 60, 103,128, 160).
При контакте с дикими и домашними животными, человеком, в особенности с детьми, а также с пищевыми продуктами и открытыми водоемами возникает вероятность распространения не только самой инфекции, но и устойчивых к антибиотикам штаммов на другие восприимчивые организмы и на другие территории. В связи с этим лечение сальмонеллеза становится сложной задачей, а проблема борьбы с сальмонеллезом — еще более актуальной. Остро стоит вопрос совершенствования методов профилактики и лечения сальмонеллеза и переориентирования подходов к его искоренению от применения только химиотерапевтических средств (44, 103, 119, 145, 183).
Одним из перспективных и безопасных препаратов против сальмонеллеза является бактериофаг.
Отмечена эффективность применения подобных препаратов в промышленном птицеводстве. Сальмофаги энтеритидис и пуллорум обладают как профилактическими, так и лечебными свойствами против сальмонеллеза кур. Использование бивалентного сальмофага против сальмонелллеза энтеритидис и пуллороза-тифа кур позволяет:
обеспечить защиту от заболевания сальмонеллезом с первых дней жизни, чего нельзя достигнуть использованием вакцин;
исключает поствакцинальные осложнения;
снимает проблему инфекции, обычно имеющую место при вакцинации по инфицированному фону;
санирует птиц-бактерионосителей, чего невозможно достичь применением антибиотиков (116).
Применение специфических и литически высокоактивных бактериофагов для борьбы с сальмонеллезом голубей позволит санировать птицу от сальмонеллоносительства, обеспечить защиту от заболевания с первых дней жизни, предотвратить поствакцинальные осложнения и повысить сохранность поголовья.
Безопасность метода использования фагов (в т.ч. для молодняка с первых дней жизни), удобство применения, лечебный и профилактический эффект, высокая экономическая эффективность, возможность решения проблемы сальмонеллоносительства являются перспективным компонентом комплексной системы профилактики сальмонеллезной инфекции (70). В общем контексте многие исследователи и специалисты отводят бактериофагам важную роль в борьбе с сальмонеллезной инфекцией (32, 45, 72, 78,93,102,136,167).
Применение биопрепарата, функциональная основа которого — бактериофаг, с лечебно-профилактической целью при сальмонеллезах у птицы весьма перспективно. Поэтому исследования, посвященные выделению и изучению бактериофагов к Salmonella typhimurium, являющимся основным серовариантом, вызывающим сальмонеллез синантропных птиц и домашних голубей, а также создание бактериофагового препарата для профилактики и лечения сальмонеллеза голубей актуальны для ветеринарии и голубеводства.
Цель и задачи исследований. Целью настоящих исследований являлось выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов к Salmonella typhimurium, а также создание и определение эффективности применения фагового препарата для борьбы с сальмонелле-зом голубей.
Для осуществления данной цели были поставлены следующие задачи:
1. Изучить эпизоотическую ситуацию по сальмонеллезу голубей в Мос
ковском регионе.
Выделить и селекционировать высокоактивные бактериофаги к Salmonella typhimurium.
Изучить морфологию, литическую активность, специфичность, спектр литического действия селекционированных фагов тифимуриум.
Создать фаговый препарат, изучить его протективную и лечебную эффективность для голубей в лабораторных условиях.
Изучить эффективность применения экспериментальных серий препарата в неблагополучных по сальмонеллезу голубятнях и вольерах.
Научная новизна.
Изучена эпизоотическая ситуация по сальмонеллезу голубей в г. Москве и Подмосковье.
Выделены бактериофаги к Salmonella typhimurium, селекционированы наиболее активные из них и изучены их биологические свойства.
Создан биологический препарат Бактериофаг тифимуриум, предназначенный для лечения и профилактики сальмонеллеза голубей, изучена его протективная и лечебная эффективность в лабораторных и практических условиях.
Практическая ценность работы. Рекомендован для внедрения в биологическую промышленность и ветеринарную практику Бактериофаг тифимуриум против сальмонеллеза голубей с установленной профилактической и лечебной эффективностью.
Разработаны и внедрены «Рекомендации по диагностике, профилактике и ликвидации сальмонеллеза голубей» для ветеринарных специалистов, лабораторий, институтов, владельцев голубятен.
Выделенные бактериофаги к Salmonella typhimurium депонированы в ФГУВГНКИ.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на Открытой Всероссийской научно-практической конференции «Молодежь и наука XXI века» во ФГОУ ВПО УГСХА (г. Ульяновск, 24-26.04.2007); на Всероссийском конкурсе на лучшую научную работу среди аспирантов и молодых ученых ВУЗов МСХ РФ (г. Воронеж и г. Москва, 2007); X Всероссийской Медико-биологической конференции «Человек и его здоровье» (г. Санкт-Петербург, 20-21.04.2007), на Всероссийском конкурсе «Развитие АПК РФ» (Москва, 27-29.05.2008), межкафедральных заседаниях ФГОУ ВПО МГАВМиБ.
Публикации. По теме диссертационной работы опубликованы 6 научных статей и выпущены методические рекомендации, одобренные Департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ от 11.04.2008 № 25-25/16.
Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:
Эпизоотическая ситуация по сальмонеллезу голубей в г. Москве, Московской области.
Биологические свойства выделенных и селекционированных бактериофагов к S. typhimurium.
Протективные и лечебные свойства препарата Бактериофаг тифи-муриум против сальмонеллеза голубей.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 136 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, сведений о практическом использовании результатов иссле-
дований, рекомендаций по использованию научных выводов. Список использованной литературы включает 185 источников, из них 43 - зарубежных авторов. Работа содержит 18 таблиц, 15 рисунков, документальное приложение.
Особенности возбудителей сальмонеллеза голубей
Сальмонеллез - острое и хроническое бактериальное заболевание всех видов животных и птиц, которое регистрируется практически во всех странах мира и особенно широко среди домашней и декоративной птицы. Широкое распространение болезни обусловлено убиквитарностью возбудителя в окружающей среде и высоким сальмонеллоносительством у животных (126, 139).
Возбудитель болезни - бактерии из рода Salmonella семейства Enterobacteriaceae (123). Впервые сальмонеллы были выделены в 1885 году американскими ветеринарными врачами Salmon и Smitt, которые исследуя органы павших и больных свиней, выделили палочковидные бактерии, ошибочно названные возбудителем чумы свиней. Впоследствии эти бактерии были названы Bact. suipestifer, а в настоящее время Salmonella choleraesuis. В 1888 г. Gartner при выяснении этиологии отравлений людей обнаружил один и тот же микроб этого рода в мясе коровы и селезенке умершего человека, и, тем самым, впервые обосновал бактериальную этиологию сальмонеллез-ных вспышек у людей. Бактерию назвали Bact. enteritidis (141).
В 1890 г. Laffler выделил от павших мышей микроб, получивший название Bact. typhimurium. В том же году Schottmuller и одновременно с ним Kurth во время массовой вспышки заболеваний, клинически сходных с брюшным тифом, выделили Bact. paratyphi и указали на идентичность па лочки Гертнера с другими возбудителями пищевых токсикоинфекций. Поэтому все подобные бактерии объединили в одну группу «паратифозных» (138, 141).
Международное общество микробиологов в 1934 году вынесло решение именовать бактерии этой группы в честь первооткрывателя — сальмонеллами, а болезнь — сальмонеллезом (102,120, 141).
Международная номенклатурная комиссия в 1934 году отнесла все эти бактерии в род Salmonella. Род сальмонелл включает более 2500 серо-вариантов, которые разделены по антигенному родству на 52 серологические грзшпы. В пределах каждого серовара сальмонеллы подразделяются на биовары, фаговары, кроме того, они различаются по характеру продуцируемого бактериоцина (102,121,141,161).
Согласно последней номенклатуре ВОЗ (1990 г) род Salmonella состоит только из двух видов: S. enterica и S. bongori (161).
Возбудители сальмонеллеза голубей относятся преимущественно к подвиду enterica. Это прямые, с закругленными концами грамотрицатель-ные палочки длинной 2—5 мкм и шириной 0,7-1,5 мкм, не кислотоустойчивые, не образующие спор и капсул (некоторые виды имеют микрокапсулу), являются аэробами, но могут развиваться и в анаэробных условиях. Большинство из них подвижны, за исключением S. pullorum, S. gallinarum (67, 121,122).
Сальмонеллы обладают рядом общих свойств: морфологией, отношением к красящим веществам, культуральными и биохимическими особенностями (121,138).
Сальмонеллы обладают как дыхательным, так и ферментативным типами метаболизма, что их отличает от других бактерий семейства Enterobacteriaceae. Биохимические свойства варьируют в зависимости от вида и типа, а иногда и штамма сальмонелл (121,122). По данным Сидорова М.А., важное дифференциальное значение для рода Salmonella имеют отрицательные тесты на индолообразование, утилизацию цитрата и малоната натрия, дезаминирование фенилаланина, положительный тест на декарбоксилирование лизина (121).
В процессе роста энтеробактерии рода Salmonella не ферментируют лактозу, сахарозу, инозит, салицин, не гидролизуют мочевину и желатин, образуют сероводород, редуцируют нитраты, ферментируют манит (121, 122). Однако ферментативная активность у сальмонелл может варьировать, что послужило поводом подразделить их на подроды. Отмечено также, что культуры в R- и S-форме могут иметь различия биохимических и серологических свойств (67, 122,162).
Все сальмонеллы - факультативные анаэробы, хорошо развиваются на обычных питательных средах, оптимальная температура роста 37UC, при рН среды 7,2-7,4 (51, 74, 121,122, 162).
Рост культуры рода Salmonella на МПА образует гладкие, выпуклые, прозрачные, серо-голубоватые колонии диаметром от 2 до 5 мм, на агаре Эндо прозрачные, бледно-розовые, на среде Левина - прозрачные с фиолетовым блеском, на агаре Плоскирева - бесцветные, непрозрачные, на висмут-сульфит агаре — черные с металлическим блеском колонии, аналогичные черные колонии с желтоватым ободком и на сальмонеллезно-шигеллезном агаре (SS-агаре) (7, 67, 74,121, 122, 162).
В качестве сред накопления для сальмонелл используют магниевую, селенитовую, среды Мюллера, Киллиана, Кауфмана. По данным ВОЗ лучшей селективной средой изоляции и обогащения сальмонелл является среда Раппопорта-Вассилиади (73, 121,162).
Эпизоотическая ситуация по сальмонеллезу голубей в Московском регионе
Исследования эпизоотической ситуации и этиологической структуры сальмонеллеза голубей были продолжены нами на базе ФГОУ ВПО МГАВМиБ.
В период 2004-2008 гг. были проведены исследования поступавшего патологического материала от диких и декоративных голубей различных районов города Москвы, населенных пунктов Подмосковья (г. Одинцово, г. Домодедово, г. Мытищи, г. Подольск, г. Зеленоград, г. Ступино, п. Вос-тряково Домодедовского района, г. Люберцы, п. Поливаново Подольского района, г. Тула). Исследовали сыворотки крови, фекалии и смывы из зева от живой птицы; от трупов вынужденно убитых и павших голубей — печень, костный мозг, кровь из сердца, селезенку, головной мозг бактериологическими и серологическими методами, а также в ПЦР.
Исследования выявили, что дикие и домашние голуби в большинстве случаев больны или являются бактерионосителями (положительные результаты на сальмонелл ез получены в 97 из 123 проведенных пробах (78,9%)). Кроме того, у голубей диагностировали микоплазмоз, Ньюкасл-скую болезнь, эшерихиоз, в единичных случаях — гемофилез и орнитоз (табл. 4).
В 96% случаев (93 из 97) бактериологическими методами (посевы на МЛА, в МПБ, на агар Эндо и висмут-сульфитный агар, окраска культур по Граму, изучение биохимических свойств на средах Гисса, реакция агглютинации с О-групповыми; О- и Н-монорецепторными сальмонеллезными сыворотками, биопроба на белых мышах и голубях) от исследованных голубей выделяли изоляты сероварианта Salmonella typhimurium. В 1,6% случаев выделяли S. enteritidis, а в остальных - другие варианты сальмонелл: S. Stanley, london, heidelberg и нетипируемый изолят набором сывороток (рис. 3).
Морфологические, тинкториальные, культуральные свойства S. typhimurium были типичными для своего вида: грамотрицательные палочки, характерные по морфологии для семейства Enterobacteriaceae, вызывающие равномерное помутнение на МПБ, диффузный рост на полужидком агаре (0,25%), колонии в S-форме на МПА, ферментирующие с образованием кислоты и газа глюкозу, маннит, мальтозу, сорбит, араби-нозу, рамнозу, ксилозу, дульцит, растущие на среде Симонса, образующие сероводород, не образующие индол, не ферментирующие лактозу и сахарозу и агглютинирующиеся монорецепторными сыворотками 0-4, Н-і;1,2.
Анализ данных с целью изучения сезонности и периодичности сальмонеллеза голубей не выявил приуроченности сальмонеллеза к какому-то определенному сезону года, вспышки не имеют четкой периодичности. Сальмонеллез регистрируется у голубей в любое время вне зависимости от сезона и возникает в одной и той же голубятне через разные временные промежутки.
Изучение морфологии вирионов выделенных фагов
В качестве штаммов для опытов по заражению голубей и в качестве штамма-хозяина для изготовления препарата Бактериофаг тифимуриум использовали:
1. Штамм S. typhimurium М-2ф t - ДЕП, выделенный Пименовым Н.В. из трупа голубя в г. Москва в 2003 г., является контрольно-производственным штаммом. Обладает типичными для S. typhimurium свойствами: по морфологии - это грамотрицательные подвижные палочки, на МПБ образует равномерное помутнение, на МПА - колонии в «S»-форме, на полужидком агаре (0,25%) — диффузный рост, ферментирует с образованием кислоты и газа глюкозу, маннит, мальтозу, сорбит, арабино-зу, рамнозу, ксилозу, дульцит, растет на среде Симонса, образует сероводород, не образует индол, каталазоположителен, оксидазоотрица-телен, не ферментирует сахарозу, лактозу и агглютинируется 04, Н-і; 1,2 сальмонеллезными сыворотками. LD5o при проведении исследования на белых мышах массой 14-16 г. при подкожном инфицировании составила 4074 мкр. кл.
2. Штамм Salmonella typhimunum М-5в t — ДЕП, выделенный Пиме-новым Н.В. из трупа голубя г. Москва в 2004 г., является производственным. Обладает типичными для S. typhimurium свойствами: при окраске по Граму - грамотрицательные палочки, на МПБ образует равномерное помутнение, на МПА - колонии в «8»-форме, на полужидком агаре (0,25%) -диффузный рост, ферментирует с образованием кислоты и газа глюкозу, маннит, мальтозу, сорбит, арабинозу, рамнозу, ксилозу, дульцит, растет на среде Симонса, образует сероводород, не образует индол, каталазоположи-телен, оксидазоотрицателен, не ферментирует сахарозу, лактозу и агглютинируется 04, Н-і; 1,2 сальмонеллезными сыворотками. LD5o штамма S. typhimurium М-5в t для белых мышей массой 14-16 г. при подкожном инфицировании составляет 647 микробных клеток.
3. Штамм S. typhimurium Д-1в t - ДЕП, выделенный Пименовым Н.В. из трупа голубя г. Домодедово Московской области в 2004 г., является контрольно-производственным. Обладает типичными для S. typhimurium свойствами: по морфологии - это грамотрицательные подвижные палочки, на МПБ образует равномерное помутнение, на МПА — колонии в «S»-форме, на полужидком агаре (0,25%) - диффузный рост, ферментирует с образованием кислоты и газа глюкозу, маннит, мальтозу, сорбит, арабино- -" зу, рамнозу, ксилозу, дульцит, растет на среде Симонса, образует сероводород, не образует индол, каталазоположителен, оксидазоотрицателен, не ферментирует сахарозу, лактозу и агглютинируется 04, Н-і; 1,2 сальмонеллезными сыворотками. LD5o штамма S. typhimurium М-5в t для белых мышей 14-16 г. при подкожном заражении составляет 5495 мкр. кл.
Экспериментальную инфекцию голубей вызывали путем заражения в лабораторных условиях невакцинированных голубей породы синий 3-месячного возраста массой 110-140 г., полученных из благополучной по сальмонеллезу голубятни в Тульской области.
При этом изучали вирулентность изолятов сальмонелл путем определения LD5o при оральном заражении голубей, используя по 4 голубя на каждую дозу инфицирования. Всего было использовано по 4 группы голубей на каждый штамм S. typhimurium М-5в t, М-2ф t, Д-1в t из коллекции кафедры. Для инфицирования использовали автоматические пипетки-дозаторы.
