Эффективность бивалентного сальмофага против сальмонеллеза энтеритидис и пуллороза-тифа кур Пименов Николай Васильевич

Содержание к диссертации

Введение

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10

2.1. Этиологические особенности сальмонеллеза кур 10

2.1.1. Характеристика возбудителя 10

2.1.2. Эпизоотологические данные 14

2.1.3. Клинические признаки 16

2.1.4. Патологоанатомические изменения 18

2.2. Специфическая профилактика сальмонеллеза кур 22

2.3. Природа бактериофагов и их использование при бактериальных инфекциях птиц 24

2.3.1. Морфология и структура бактериофагов, их классификация 25

2.3.2. Фазы «фаговой инфекции» 29

2.3.3. Применение фагов при сальмонеллезах 36

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 43

ЗЛ. Материалы и методы 43

3.2. Результаты собственных исследований 52

3.2.1. Эпизоотическая ситуация по сальмонеллезу кур 52

3.2.2. Характеристика изолятов сальмонелл 55

3.2.3. Экспериментальная инфекция сальмонеллеза цыплят 63

3.2.4. Выделение и изучение бактериофагов к Б. ег^егШсНБ 68

3.2.5. Профилактические и лечебные свойства фагового компонента бивалентного сальмофага против сальмонеллеза энтеритидис и пулло- роза-тифа кур в лабораторных условиях 75

3.2.6. Протективные свойства вакцинного компонента энтеритидис бивалентного сальмофага в лабораторных условиях 82

3.2.7. Изучение протективных свойств бивалентного сальмофага за счет вакцинного компонента пуллорум и определение оптимальной дозы его применения 83

3.2.8. Производственные испытания бивалентного сальмофага 87

4. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 96

5. ВЫВОДЫ 105

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 108

7. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 109

• Этиологические особенности сальмонеллеза кур
• Результаты собственных исследований
• Протективные свойства вакцинного компонента энтеритидис бивалентного сальмофага в лабораторных условиях

Введение к работе

Актуальность темы. Развитие производства продуктов питания, получаемых от сельскохозяйственной птицы, неизбежно связано с интенсификацией промышленного птицеводства, увеличением производственных мощностей и, как следствие, плотности посадки птицепоголовья. Увеличение в последние годы токсичности кормов при сохранении массированной стресс- нагрузки на птицу, особенно цыплят первых дней жизни, привело к повышению эпизоотологической значимости инфекций энтеробактериального происхождения, среди которых одно из важнейших мест принадлежит сальмо- неллезу. Особенность течения сальмонеллеза у молодняка кур - септицемия. Взрослая птица является скрытым бактерионосителем, что служит критерием стационарности инфекции и усложняет борьбу с ней (11,13,17,19,25,26,32,35, 38,39,43,49,54,55,58,60,76,78,84,91,93,115,121,132,151).

Птицеводческие хозяйства, сталкиваясь с проблемой сальмонеллеза кур, несут большие потери из-за смертности цыплят, снижения продуктивности и качества продукции (17,19,37,43,84,132).

Обсемененные сальмонеллами яйца и мясо кур становятся зачастую причинами пищевых токсикоинфекций человека (20,25,26,36,37,50,51, 69,75,83,117,118,126,137,142,145,147,150,152,154,159). Согласно медицинской статистике токсикоинфекции сальмонеллезной этиологии распространены почти во всех странах мира, причем за последнее двадцатилетие медицина отмечает рост сальмонеллезных заболеваний среди людей, что обусловлено, в первую очередь, ростом инфицированности домашних животных и птиц (101,132,140,162).

Так, в США в 1998 году было отмечено более 20 вспышек сальмонеллеза, особенно среди потребителей и работников баров и ресторанов (140). Б. Ьикттаа, Я. 8сЫШ1, Т. 11т1:Ша сообщали о 12 вспышках сальмонеллеза в Финляндии в 1997 году (137). В Великобритании было зарегистрировано в 1989 году 5 сальмонеллезных вспышек; обсемененные сальмонеллой яйца и тушки птицы обнаружили в магазинах, что привело к отставке министра сельского хозяйства Е. Curie. Т.К. Kolferstein и D.W. Bettcher отмечают, что за 1993 г. только в США число случаев токсикоинфицирования человека составило 224000, из них 96% - сальмонеллез, причиной которого были в 65% случаев зараженное мясо птицы и яичные продукты (140).

Не менее важная эпидемиологическая значимость сальмонеллеза кур в пищевом токсикоинфицировании человека и увеличение числа вспышек этого заболевания отмечаются в Дании, Германии, Канаде, Швейцарии, Италии, Замбии, Гане, Сенегале и многих других странах, в т.ч. и в Российской Федерации (11,13,20,25,26,36,49,51,55,96,101,115,126,140,145,150,152,156,162).

Борьба с сальмонеллезом кур заключается в проведении организационных, санитарно-гигиенических мероприятий, серологическом выявлении подозреваемых в заражении или бактерионосительстве кур, проведении терапевтических мероприятий (профилактические и лечебные обработки птиц антибиотиками и другими химиотерапевтическими препаратами) (15,16,17, 18,19,31,32,33,38,42,43,49,54,58,63,66,75,78,84,94,115,132).

К сожалению, эффективность этих мероприятий недостаточна. Перечисленные обработки не позволяют избавить птицу от сальмоносительства, не способны профилактировать и ликвидировать инфекцию, а предотвращают лишь массовое клиническое проявление заболевания среди молодняка птиц. Кроме того, применение химиотерапевтических препаратов несет ограничения на использование продукции, постоянные антибиотикообработки не оправданы с экологической точки зрения (20,33,37,60,76).

Вышесказанное свидетельствует о необходимости специфической профилактики сальмонеллеза кур. Работа над созданием вакцин проводится с 50- х гг. прошлого столетия. В разных странах были предложены живые, инакти- вированные и химические вакцины против сальмонеллеза кур, однако они не решают проблему защиты цыплят первых дней жизни и санирования птице- поголовья от бактерионосительства. Вот почему в последнее время возрос интерес к фаговым препаратам. Бактериофаги лизируют эпизоотические штаммы сальмонелл, к которым они специфичны, применение фагов снимает бактерионосительство, не имеет противопоказаний (4,15,28,45,54,60,61,77, 79,95,147,155).

В лаборатории контроля и стандартизации препаратов против сальмо- неллеза, колибактериоза и лептоспироза ВГНКИ создан препарат нового типа - сальмофаг энтеритидис, объединивший в себе высокоактивный бактериофаг, лизирующий эпизоотические штаммы S. enteritidis наиболее распространенных фаготипов, и фагоустойчивый вакцинный штамм данного серовара. Применение препарата позволяет освободить птицу от сальмонеллы за счет фагового компонента препарата, защитить иммунотолерантных цыплят первых дней жизни от инфекции, пока они не выработают собственный поствакцинальный иммунитет к сальмонеллезу, вызываемому S. enteritidis (59,61).

Препарат нового поколения - бивалентный сальмофаг, создаваемый в той же лаборатории, объединил в себе уже два фаговых компонента против S. enteritidis и S. gallinarum-pullorum, и, соответственно, два фагоустойчивых вакцинных штамма данных сероваров.

Данные 1989-2001 гг. свидетельствуют, что основными этиопатогенны- ми сероварами сальмонелл для кур являются Salmonella enteritidis (ее выделяют в 44-46% случаев из патологического материала от птицы, павшей от сальмонеллеза) и S. gallinarum-pullorum (ее доля в случаях сальмонеллеза кур 41-43%). Далее следует S. typhimurium (8-10%), S. dublin (1-2%). Роль остальных сальмонелл (Ss. virchow, infantis, hamburg, haifa, panama, kottbus, bo- vis morbificans, colindale, Chester, derby, brandenburg, newlands, tshiongeve, lindenburg, thompson, dahomey, banana, omderman, anatum, paratyphi В и других) в этиологии сальмонеллеза кур незначительна и изменчива (6,11,17,19,20, 23,35,38,54,100,105,127).

Тем самым необходимость создания бивалентного сальмофага продиктована производственной реальностью и является актуальной задачей. Применение бивалентного сальмофага позволит защитить кур и цыплят от основных возбудителей сальмонеллеза с первых дней жизни, решить проблемы сальмоносительства, вспышки сальмонеллеза при иммунизации по инфицированному фону, большого применения антибиотиков.

До настоящей работы оставались не изученными некоторые аспекты эпизоотологического процесса при сальмонеллезе кур, эффективность сальмофага в острых лабораторных опытах, производственных испытаниях, не отработана оптимальная дозировка по вакцинному компоненту 8. аШпагит- риПогит, не изучено влияние применения препарата на показания утвержденных основных диагностических серологических тестов при сальмонеллезе.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы явилось изучение эффективности бивалентного сальмофага против сальмонеллеза энте- ритидис и пуллороза-тифа кур.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи работы:

1. изучить эпизоотическую ситуацию по сальмонеллезам птиц в Российской Федерации;

2. изучить свойства изолятов сальмонелл, выделенных в различных регионах РФ (в т.ч. их серовариантную принадлежность и антибиотикочувствительность);

3. выделить и селекционировать высокоактивные бактериофаги к Б. ег^егШсИв;

изучить зависимость развития сальмонеллеза кур от производственного направления, возраста, способа инфицирования птицы;

4. изучить особенности развития септицемии при сальмонеллезе энтеритидис и пуллорозе-тифе кур;

5. изучить протективиую и лечебную эффективность экспериментальных серий бивалентного сальмофага в лабораторных условиях;

6. определить оптимальную дозу применения вакцинного штамма 8. а1Нпашш-ри11огиш при обработке цыплят бивалентным сальмофагом;

7. изучить эффективность применения экспериментальных серий препарата бивалентный сальмофаг в птицеводческих хозяйствах, неблагополучных по сальмонеллезу кур.

Научная новизна. Изучена эпизоотическая ситуация по сальмонеллезам кур в Российской Федерации. Обоснованы особенности проявления сальмо- неллеза кур от этиопатогенного серовара, зависимость инфицирующей дозы от производственного направления, возраста птицы и способа инфицирования, изучена эффективность применения нового препарата - бивалентного сальмофага против сальмонеллеза энтеритидис и пуллороза-тифа кур в лабораторных и производственных условиях, отработана доза применения его вакцинного компонента пуллорум.

Практическая ценность работы. На основании проведенных исследований рекомендован для внедрения в биологическую промышленность и ветеринарную практику «Бивалентный сальмофаг против сальмонеллеза энтеритидис и пуллороза-тифа кур» с установленной лечебной и профилактической эффективностью.

Выделены и селекционированы активные бактериофаги к Б. егЛегШсИэ, служащие резервом фагового компонента препарата бивалентный сальмофаг.

Разработаны и внедрены «Рекомендации по диагностике, профилактике и ликвидации сальмонеллеза кур» для ветеринарных специалистов птицеводства, лабораторий, институтов.

Апробация работы. Основные положения диссертации успешно доложены на Международной конференции молодых ученых «Научные основы технологии производства ветеринарных биопрепаратов» во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности (Щелково, 05.12.2002.), заседаниях кафедры клинической диагностики и болезней молодняка, методическом совещании факультета повышения квалификации, межкафедральных заседаниях МГАВМиБ имени К.И. Скрябина.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 5 научных статей и выпущены методические рекомендации, одобренные Департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ от 04.11.02 № 13-3-6/1965.

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

8. Эпизоотическая ситуация по сальмонеллезу кур в РФ.

9. Выделение и свойства этиопатогенных изолятов сальмонелл, выделение и селекция бактериофагов к Б. е^егШсИБ.

10. Особенности проявления сальмонеллеза кур.

11. Определение оптимальной дозы применения вакцинного компонента пуллорум бивалентного сальмофага.

12. Оценка протективной и лечебной эффективности бивалентного сальмофага против сальмонеллеза энтеритидис и пуллороза-тифа кур в лабораторных экспериментах и производственных испытаниях.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 125 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения и выводов. Библиографический список включает 163 публикации, из них 69 зарубежных источников. Материалы иллюстрированы 5 электронно-микроскопическими фотографиями, 22 таблицами, 3 графиками, 5 диаграммами. Работа содержит документальное приложение.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1. Этиологические особенности сальмонеллеза кур

Сальмонеллез кур - инфекционная болезнь, характеризующаяся у молодняка явлениями септицемии, поражением органов дыхания и желудочно- кишечного тракта, а у взрослых кур - хроническим течением с поражением репродуктивных органов и бактерионосительством.

2.1.1. Характеристика возбудителя Возбудитель болезни - бактерии из рода Salmonella семейства Entero- bacteriaceae. Впервые данную бактерию выделили из органов свиней американские ветеринарные врачи Salmon и Smitt в 1885 году и назвали микроб Bact. suipestifer. В 1888 г. Gartner при выяснении этиологии отравлений людей обнаружил один и тот же микроб этого рода в мясе коровы и селезенке умершего человека, и тем самым впервые обосновал бактериальную этиологию сальмонеллезных вспышек. Бактерию назвали Bact. enteritidis (93). В 1890 г. Laffler выделил от павших мышей микроб, получивший название Bact. typhimurium. В том же году Schottmuller и одновременно с ним Kurth во время массовой вспышки заболеваний, клинически сходных с брюшным тифом, выделили Bact. paratyphi и указали на идентичность палочки Гетнера с другими возбудителями пищевых токсикоинфекций. Поэтому все подобные бактерии объединили в одну группу «паратифозных» (91,93).

Международная номенклатурная комиссия в 1934 году отнесла все эти бактерии в род Salmonella. С появлением и открытием новых сальмонелл предлагались различные классификации их с учетом культуральных, ферментативных и серологических свойств. Уже тогда многими исследователями была установлена клинико-эпидемиологическая связь между возбудителями типичного паратифозного заболевания у человека (паратиф А и В) и возбудителями сальмонеллезных токсикоинфекций (93).

На сегодняшний день насчитывается более 2500 сероваров сальмонелл, которые разделены по антигенному родству на 52 серологические группы. В пределах каждого серовара сальмонеллы подразделяются на биовары, фаго- вары, кроме того, они различаются по характеру продуцируемого бактерио- цина (53,57,82,121,135,139,151).

Согласно последней номенклатуре Всемирной организации здравоохранения (1990 г.) род Salmonella состоит только из двух видов: S. enterica и S. bongori. S. enterica делится на 6 подвидов:

1. - подвид enterica (choleraesuis);

2. - подвид salamae;

3. - подвид arizonae Illa и Illd;

4. - подвид diarizonae;

5. - подвид houtenae;

6. - подвид indica (135).

Возбудители сальмонеллеза кур относятся преимущественно к подвиду enterica. Это прямые, с закругленными концами грамотрицательные палочки длиной 2-5 мкм и шириной 0,7-1,5 мкм, не кислотоустойчивые и не формирующие эндоспор и микроцист. За счет перитрихиальных жгутиков обычно подвижны, за исключением S. gallinarum-pullorum. Сальмонеллы обладают как дыхательным, так и ферментативным типами метаболизма, что их отличает от других бактерий семейства Enterobacteriacea. Важное дифференциальное значение для рода Salmonella имеют отрицательные тесты на индоло- образование, утилизацию цитрата и малоната натрия, дезаминирование фе- нилаланина, положительный тест на декарбоксилирование лизина (57,82).

В процессе роста энтеробактерии рода Salmonella не ферментируют лактозу, сахарозу, инозит, салицин, не гидролизируют мочевину и желатин, образуют сероводород, редуцируют нитраты, ферментируют маннит. Однако ферментативная активность у сальмонелл может варьировать, что послужило поводом подразделить их на подроды. Отмечено также, что культуры в R- и S-форме могут иметь различия биохимических и серологических свойств (82).

Рост культуры рода Salmonella на МПА образует прозрачные с голубоватым оттенком колонии диаметром от 2 до 5 мм. На агаре Эндо колонии сальмонелл прозрачные, бледно-розовые, на среде Левина - прозрачные с фиолетовым блеском, на агаре Плоскирева - бесцветные, непрозрачные, на висмут-сульфит агаре - черные с металлическим блеском, аналогичные черные колонии с желтоватым ободком и на сальмонеллезно-шигеллезном агаре (53,57,82).

В качестве сред накопления используют селенитовую, магниевую, среды Кауфмана, Мюллера, Киллиана. По данным ВОЗ наиболее эффективной селективной средой изоляции и обогащения сальмонелл является среда Раппо- порта-Вассилиади (151).

Сальмонеллы - аэробы и факультативные анаэробы, оптимальная температура для роста 36-37 С, pH среды 7,0-7,2 (17,38,53,57,70,82).

Антигенная структура сальмонелл, на основании которой в 1940 году предложена их классификация (Кауфман и Уайг), представлена соматическим, жгутиковым антигенами, а также Vi- и поверхностными К-антигенами.

О-антиген (соматический) - термостабильный липосахаридно-белковый комплекс. Жгутиковые Н-антигены - термолабильны, состоят из белка и делятся на 2 вида: первой фазы, обладающие специфическими свойствами, и второй фазы - неспецифическими, характерными для различных сероваров сальмонелл (8,17,53,57,82,104,139).

Для полной идентификации сальмонелл необходима их серологическая типизация по О- и Н-антигенам в реакции агглютинации с поливалентными групповыми О-сыворотками и с монорецепторными О- и Н-сыворотками.

В серогруппе А (02) представлена S. paratyphi А, в серогруппе В (04) - Ss. paratyphi В, typhimurium, abortus equi, abortus ovis, heidelberg, Stanley и другие; в серогруппе С Ss. cholerae suis, paratypti С, typhisuis, thompson, в серогруппе D - Ss. typhi, enteritidis, dublin, gallinarum-pullorum, moskow, panama и другие; в серогруппе Е - Ss. anatum, give и другие (82,92,139).

Большое количество выделяемых сероваров патогенны для различных видов животных, птиц и человека.

Антигенную структуру сальмонелл, выделенных от птицы, изучали многие авторы: Н. Werner, В. Muller (1970 г.), Сох, A. Baxton (1977 г.), С. А. Brandly (1967 г.), L. Minor (1982 г.), М.М. Ахмедов, В.И. Макарочкина, А.Г. Малявин, Е.И. Выдрина (1962 г.), A.A. Кудряков, О.П. Алексеева, Н.Г. Кожемякин (1961 г.), И.С. Загаевский (1968 г.), Э. Ридал, В. Ридал, И.В. Шур (1970 г.), Б.Ф. Бессарабов, Н.К. Сушкова (1998 г.), И.И. Бальчунас (1983 г.), К.Ж. Гаджиев, А.Г. Халимов, В.Г. Зуев, В.А. Кузьмин (1995 г.), C.B. Ленев, Ю.А. Малахов, В.В. Шорохов (1996 г.), В.А. Ведерников (1997 г.), H.A. Рад- чук, Б.Н. Натенсон, Т.М. Сидорова (1998 г.) и другие (6,7,9,10,11,13,14,19, 25,26,39,41,48,50,54,55,60,66,76,96,115,117,139,156).

Серовариантный состав сальмонелл, выделенных от птицы, в том числе от кур, как показали многочисленные исследования, весьма разнообразен, однако чаще всего изолированные культуры сальмонелл относили к Salmonella gallinarum-pullorum, Ss. enteritidis, typhimurium, heidelberg, anatum, london, haifa, moskow, newlands, virchov, dublin и значительно реже к Ss. suipes- tifer, mission, sandiega и к другим.

Центром сотрудничества для реферации и исследований по сальмонеллам ВОЗ в 1990 году предложена классификация сальмонеллезов птиц по этиологии, согласно которой различают:

1. - сальмонеллез, вызванный S. gallinarum-pullorum (ранее именовавшийся как отдельная нозологическая единица - пуллороз-тиф) и S. enteritidis, относящиеся к серогруппе D;

2. - сальмонеллез, вызванный S. typhimurium, поражающий, в основном, водоплавающую птицу;

3. - сальмонеллез птицы, вызываемый не адаптированными к птице се- роварами сальмонелл (Ss. haifa, anatum, london и другие) (19).

2.1.2. Эпизоотологические данные.

К возбудителю сальмонеллеза восприимчивы куры, а также другие виды животных и человек. Источником возбудителя инфекции являются больной молодняк птиц, взрослые куры-бактерионосители, а также индейки, цесарки (в основном, 8. gallinarum-pullorum), утки, индюки (8. еШегШсИБ, 8. 1урЫ- типит). Возможны другие виды птиц и животных как источники возбудителя инфекции. Кроме того, источником возбудителя сальмонеллеза кур являются снесенные ими яйца (латентная инфекция) (19,39,55,58,96), хотя некоторые ученые считают, что возбудитель сальмонеллеза птиц вертикальным путем не передается, а заражение инкубационных яиц возможно горизонтально при нарушениях режима инкубации, насечках, бое, микротрещинах (13).

Больная птица и бактерионосители выделяют наибольшее количество возбудителя с пометом. Факторами передачи возбудителя сальмонеллеза являются корма, вода, подстилка, кормушки, воздух, предметы ухода, почва, одежда и обувь обслуживающего персонала, а также инкубационные отходы. Первичный занос возбудителя на фермы чаще всего связан с завозом суточного молодняка, поступающего для выращивания из неблагополучных хозяйств, а также при заносе возбудителя с яйцом, необезвреженными боен- скими отходами, кормами. Повторные вспышки сальмонеллеза кур в неблагополучных по этой инфекции хозяйствах возникают при совместном содержании молодняка с более взрослой птицей - сальмонеллоносителями, пополнении стад из неблагополучных ферм, переводе птиц в инфицированные помещения или на выгулы (без надлежащей дезинфекции) (19,38,43,55,76, 84,115).

Сопутствующими факторами развития инфекции являются антисанитарные условия содержания, неполноценное и несбалансированное кормление, нарушение технологических схем кормления, скученное содержание, несоблюдение параметров оптимального микроклимата. В случае проникновения возбудителя на ферму в первую очередь заболевают слаборазвитые цыплята. Наблюдения показывают, что при появлении в хозяйстве сальмонеллеза, инфекция распространяется тем быстрее и дает больший отход, чем в менее благоприятных условиях кормления и содержания находится птица (19,38). Так, изучено, что при экспериментальном пероральном заражении молодняка птиц вирулентными культурами 8. егйегШсНз не всегда удается вызвать заболевание с типичными клиническими признаками и патологоанатомическими изменениями, если нет факторов, снижающих резистентность птицы (17,76).

Заражение кур происходит алиментарным, аэрогенным и трансовариаль- ным путями. Показано, что наиболее инвазионные сероварианты - Б. 1урЫ- типит и 8. еМегШсНз, которые могут проникать в яичник еще в процессе формирования скорлупы. Заражение цыплят сальмонеллами через респираторный тракт часто происходит на фоне вирусных инфекций: инфекционного ларинготрахеита, инфекционного бронхита и других, в том числе при иммунизации живыми вакцинными штаммами (124,125,146).

Инкубационный период болезни варьирует от нескольких до 12-14 суток и зависит от дозы попавшего возбудителя, сероварианта сальмонеллы и ее вирулентности (9,19,38,55,121,140).

При заражении восприимчивой птицы сальмонелл обнаруживали в кишечнике, нерассосавшемся желтке, печени, желчном пузыре, сердце, костном мозге, селезёнке, фабрициевой сумке, репродуктивных органах, головном мозге, а также в яйцах, снесённых больными курами (19,20,26,36,54, 55,57,76). По данным Радченко В.А. наиболее обсеменены 8. ег^егШсНБ у больных цыплят печень, селезенка, кровь из сердца, костный мозг и нерассо- савшийся желток (76). При изучении возможности овариального заражения, оказалось, что инфицированными могут быть до 6% яиц, полученных от клинически здоровой птицы (127).

Некоторые исследователи отмечают, что 8. ег^егШсНэ не является для птицы высоковирулентной, и эпизоотия развивается вяло, носит торпидный характер. Важнейшим местом накопления возбудителя является инкубатор, однако не все зараженные эмбрионы и вылупившиеся цыплята заболевают и гибнут. Цыплята, пережившие 12-дневный возраст, проявляют уже значительную устойчивость и, как правило, не болеют с выраженной клинической картиной (23,54,76).

В литературных источниках отмечают возможность регистрации как единичных случаев сальмонеллеза, так и массовых вспышек с охватом 4070% поголовья, причем последние более характерны для инфекции, вызванной S. gallinarum-pullorum. Гибель молодняка кур по разным данным составляет от 5 до 80%. У взрослых кур болезнь протекает, в основном, скрыто. Переболевшие птицы на протяжении многих месяцев, а, иногда, и пожизненно остаются бактерионосителями (11,13,17,19,20,26,36,38,55,60,76,78,93,121,140, 145,151,156).

2.1.3. Клинические признаки.

Сальмонеллезная инфекция у кур протекает остро, подостро или хронически, вызывая системные поражения в организме. Форма проявления и течение болезни зависят от пути заражения, дозы и вирулентности возбудителя, резистентности организма.

При остром течении сальмонеллёза у цыплят отмечают потерю аппетита, сонливость, малоподвижность, озноб, расстройство функции кишечника. Фекалии - водянистые, зеленоватого цвета с белыми прожилками. При поражении S. gallinarum-pullorum - диарейные массы, в основном, белого цвета. Пушок вокруг клоаки склеивается и может затруднять выход испражнений, накопление фекальных масс в клоаке, вызывая тем самым быструю гибель птицы от токсикоза (19,55,76,156).

Однако диарея - не обязательный симптом. Болезнь также характеризуется дрожью, иногда серозно-слизистым и слизисто-гнойным конъюнктивитом и ринитом, развитием синдрома пневмонии: цыплята широко расправляют крылья, перед гибелью ложатся на грудь, отмечается интенсивная одышка, взъерошенность или курчавость пушка. Пик смертности приходится в среднем на вторые - четвертые сутки с момента появления первых признаков болезни (19,36,38,58,76,96).

При подостром течении сальмонеллеза характерны неравномерное развитие молодняка, расстройство кишечника, хрипы и затруднённое дыхание, воспаление лёгких (19,76). Некоторые авторы отмечают также развитие при сальмонеллезе кур парезов и параличей ног и крыльев, а у птиц старших возрастных групп в ряде случаев - асцит (5,81).

У цыплят, выведенных из инфицированных яиц, клинические признаки болезни проявляются вскоре после вывода, а у заразившихся алиментарным и аэрогенным путями - спустя 3-5 дней (17,55). Гибель цыплят от сальмонеллеза энтеритидис своего пика достигает в возрасте 9-20 дней. В этом возрасте цыплята переболевают наиболее тяжело, болезнь имеет острое течение, летальность достигает 70% (76).

Механизм развития пуллороза тесно связан с нарушением общего адаптационного синдрома, что способствует диссеминации бактерий из первичного очага. Переход адаптивной реакции в патологию характеризует цитолиз клеток коркового вещества надпочечников и истощение (тотальную делим- фотизацию) тимуса и фабрициевой сумки (80).

Если птица не погибает на острой или подострой стадии переболевания, то болезнь принимает хроническое течение. У больных цыплят развивается истощение, отставание в росте и развитии, слабость конечностей. Заболевший молодняк сонлив, сидит в затемненных местах с втянутой головой и опущенными крыльями. Периодически возникают расстройства пищеварения, одышка (17,43,84).

По данным В.А. Радченко (1993 г.) при заражении 8. еЩегШШэ у молодых кур-несушек заболевание проявляется на пике яйценоскости в форме желточного перитонита (76). У взрослой птицы обнаруживают перигепатиты, оварииты, перитониты (5,19,76,81).

D.H. Erbeck, B.G. Mc Laughlin, S.N. Singh (1993 г.) наблюдали пуллороз кур с необычными признаками в двух близлежащих местностях на западе Кентуки США. В первом случае болезнь проявлялась внезапной гибелью большинства взрослых красных кур в возрасте от 5 месяцев до 2 лет. Исследователи, кроме S. pullorum, выявляли еще Е. coli из пораженных воздухоносных мешков. Другой случай характеризовался хроническим течением болезни с развитием истощения у взрослых кур породы плимутрок. Неподвижные пуллорные сальмонеллы были выделены в чистой культуре из сердца, яичников, костного мозга болевшей птицы (115).

Сальмонеллёз у кур протекает чаще в виде моноинфекции, реже - в ассоциации с эшерихиозом, пастереллёзом, орнитозом, аспергиллёзом, эйме- риозом и другими болезнями, что необходимо учитывать при диагностике (17,19,38,43,84,115).

2.1.4. Патологоанатомические изменения.

Гибель эмбрионов может произойти на любом этапе эмбрионального развития, но чаще с 7 по 20 дни инкубации. Основные патологические изменения у эмбрионов - отёчность аллантоисной оболочки, очаги некроза и массовые геморрагии во внутренних органах и на желточном мешке, скопление уратов. Печень увеличена в объёме, неравномерно окрашена. Желток густой, нерассосавшийся, зеленоватого цвета (17,76). В миокарде видны мелкие нек- робиотические очаги сероватого цвета (19).

У павших цыплят устанавливают характерные изменения кишечника. В просвете тонкой кишки - скопления слизи и газов. Слизистая оболочка — набухшая, гиперемированная, в отдельных участках отмечают мелкие кровоизлияния. В толстом отделе кишечника слизистая покрыта отрубевидным налётом, местами в ней находят петехии и эрозии (5,19,37,70,76).

При пуллорозе-тифе кур характерно скопление белых масс творожистой консистенции в илеоцекальном соединении кишечника, ампулообразное расширение прямой кишки, увеличение желчного пузыря, иногда с обесцвечиванием желчи (55,81). Часто у цыплят обнаруживают не рассосавшиеся желтки густой тягучей консистенции зеленоватого цвета (43,58,96).

Селезенка увеличена, набухшая, на разрезе можно установить повышенное кровенаполнение пульпы. Печень коричневато-бурого цвета, с зеленоватым оттенком. Под капсулой и в толще паренхимы нередко обнаруживаются мелкие очажки некроза светло-сероватого цвета с желтым оттенком, особенно при поражении 8. а11ташш-ри11огиш (5,19,55,81). Аналогичные некротические узелки отмечают в сердечной мышце и легких (58). Donghong, Э. Вохюп (1992 г.) отмечали отложение амилоида в печени цыплят, экспериментально зараженных 8. аШпашш-ри11огит (114).

Слизистая желчного пузыря набухшая, гиперемированная. При сальмонелл ёзе, вызванном 8. ег^егШсИБ желчный пузырь заполнен желчью темно- оливкого цвета с примесью фибрина и слизи (44).

При подостром и хроническом течении болезни поражается преимущественно толстый отдел кишечника, особенно отростки слепой кишки, где находят некроз слизистой с наложениями на её поверхности фибрина. В паренхиматозных органах изменения аналогичны описанным при остром течении, но выражены сильнее (5,19,81).

В грудной полости при сальмонеллезе у цыплят обнаруживают серозный выпот с примесью хлопьев фибрина. В легких - очаги уплотнения серо- красного цвета. Сердце несколько увеличено в объёме за счет расширения правого желудочка. Большинство авторов указывает на дряблость миокарда, кровенаполненность коронарных сосудов (5,44,81). При пуллорозе-тифе кур устанавливают также отёк и кровоизлияния в желточном мешке (5,19,55).

У взрослых кур обострение сальмонеллоносительства приводит к деструктивным изменениям яичных фолликулов и печени, появлению некрозо- язвенных участков и кровоизлияний на слизистой кишечника (58,80,156). Возможна, по данным Б.Ф. Бессарабова и соавт. (1983 г.), атрофия скелетной мускулатуры (17).

При гистологическом исследовании у кур отмечают изменения в тонком отделе кишечника, характерные для острого серозного или серозно- слизистого катара с участками десквамации эпителия, ворсинок и желёз. В толстом отделе - катарально-фибринозное, реже дифтеритическое воспаление с развитием некроза покровного эпителия и, частично, поверхностного слоя слизистой оболочки и ее отслоение, в результате чего в таких участках обнаруживают эрозии (5,80).

В селезёнке отмечают гиперплазию лимфоидных фолликулов белой пульпы, в почках - зернистую дистрофию эпителия извитых канальцев. В печени на фоне дистрофических изменений выражены: очаговый коагуляци- онный некроз гепатоцитов, расширение желчных капилляров и заполнение их желчью, сильная капиллярная и венозная гиперемия с множеством мелких кровоизлияний между балками, диапедез элементов крови через стенки набухших сосудов. Слизистая желчного пузыря - в состоянии катарально- фибринозного воспаления (5).

Морфологические изменения в тимусе исследователи характеризовали расширением мозговой и сужением корковой зоны, появлением телец Гасса- ля, в лёгких - картиной очаговой катаральной пневмонии, в миокарде - дистрофией и очагами коагуляционного некроза (17,81). Г.С. Качмазов и В.А. Радченко (1990 г.) при сальмонеллёзе, вызываемом 8. егйегШсИз, отмечали также серозный или серозно-фибринозный эпикардит и перикардит в стадии организации с очаговым разрастанием соединительной ткани (44).

При возникновении сальмонеллеза в хозяйстве проводят комплекс про- тивоэпизоотических и ветеринарно-санитарных мероприятий, уделяя особое внимание изоляции и дезифекции. В борьбе с инфекцией руководствуются ветеринарными правилами ВП 13.4.1318-96 «Профилактика и борьба с заразными болезнями, общими для человека и животных» (75), «Инструкцией о мероприятиях по профилактике и ликвидации заболевания кур и индеек пул- лорозом-тифом» от 13.03.85 №115-6а Главного управления ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР (42), инструкциями Ветеринарного законодательства.

Принятая система мер борьбы и профилактики сальмонеллеза кур, в первую очередь, предусматривает широкое применение различных антимикробных средств и пробиотиков (15,16,17,19,33,36,38,43,49,54,58,63,66,84).

Принцип профилактики сальмонеллезной инфекции с помощью пробиотиков основан на опережающем заселении желудочно-кишечного тракта нормальной микрофлорой: молочнокислыми, бифидо-, пропионовокислыми и т.п. бактериями, стрептококками, препятствующими росту и размножению патогенной и условно-патогенной микрофлоры. На сегодняшний день про- биотикотерапия является обязательным условием поддержания нормального биоценоза кишечника птицы, находящейся в замкнутом пространстве перенасыщенных популяций птицекомплексов. Однако, в связи с возможностью аэрогенной и трансовариальной передачи возбудителя применение только пробиотиков для профилактики сальмонеллеза кур не может являться высокоэффективным.

Одним из основных способов профилактики и лечения сальмонеллеза кур на сегодняшний день остается применение препаратов с антимикробным действием: антибиотиков, сульфаниламидов, нитрофуранов и других химио- терапевтических средств. Использование этих веществ значительно увеличивает себестоимость конечных продуктов, вводит ограничения на убой, требует больших затрат времени при индивидуальной обработке и больших затрат используемых препаратов при групповом оральном или аэрозольном применении. Последнее, к тому же, отрицательно сказывается на здоровье персонала и загрязняет окружающую среду. При применении на ферме антимикробных препаратов у циркулирующих микроорганизмов развивается устойчивость по отношению к ним, что зачастую делает дорогие новые препараты бесполезными для использования. В литературе часто отмечают случаи выделения полирезистентных изолятов сальмонелл, устойчивых одновременно к нескольким антибиотикам (20,22,23,33,37,51,54,58,60,76,84,105,121,151).

Применение пробиотиков и антибактериальных средств не ликвидирует сальмонеллоносительства, таким образом, не ликвидирует инфекцию. В связи с этим в промышленных птицеводческих хозяйствах желаемого эффекта в борьбе с сальмонеллезом кур нельзя достигнуть без применения эффективных средств иммунопрофилактики, о чем и было сказано в коммюнике экспертов комитета ВОЗ по проблеме сальмонеллеза (24,60,121,151).

2.2. Специфическая профилактика сальмонеллеза

Разработка средств специфической профилактики сальмонеллеза кур проводится с начала 50-х годов. Вакцины, предложенные различными авторами, можно разделить на 3 основных типа: инактивированные, живые, химические.

Инактивированные вакцины против сальмонеллеза кур были предложены в Великобритании, Индии, Франции, Италии, Израиле, Германии, Турции, России. Это, как правило, клетки сальмонелл, инактивированные формальдегидом или тиомерсалом, сорбированные на геле гидроокиси алюминия, алюмокалиевых квасцов, полиэтиленгликоле, эмульсии минеральных масел или другом депонирующем веществе. Существенным недостатком инактивированных вакцин является необходимость внутримышечного введения для создания активного иммунитета, что весьма трудоемко и возможно только взрослой птице. Многие исследователи, испытавшие эти препараты, указывают на недостаточную стимуляцию систем, ответственных за проявление клеточного иммунитета, имеющего ведущее значение при сальмонел- лезе, что делает такие вакцины слабоиммуногенными (60,92,102,110,150).

В нашей стране предложена инактивированная формолвакцина для кур, приготовленная из 8. егйегШсИз на кафедре микробиологии и вирусологии

Санкт-Петербургской ветеринарной академии (СПГАВМ). В отличие от других инактивированных вакцин данная применяется аэрозольно. Двукратная вакцинация родительского стада способствует формированию иммунитета у кур сроком до трех месяцев, увеличивает сохранность молодняка на 2,5-3%, повышает деловой выход молодки на 4,7% (76).

Первая живая вакцина против пуллороза (сальмонеллез, вызываемый S. gallinarum-pullorum) разработана в Великобритании Gordon и соавт. из штамма 9R в 1959 году. Из-за высокой остаточной вирулентности вакцинного штамма она не нашла широкого практического применения (92,110).

В связи с эпидемиологической значимостью сальмонеллезов кур в современный период интенсивная разработка живых вакцин начата многими исследователями. В последнее десятилетие были предложены: вакцина на основе метаболического мутанта S. typhimurium фирмы TAD F ARMA (Германия), вакцина из aroA S. enteritidis мутанта (Великобритания), две живых вакцины из спектомицинзависимых мутантов S. enteritidis и S. typhimurium (Великобритания), вакцины на основе ауксотрофных мутантов сальмонелл (Германия), вакцины, основанные на штаммах с инсерционной вставкой транспозона Т10, приводящей к нарушению подвижности и фимбриообразо- вания клеток сальмонелл (Lee et. al., 1996 г.) (109,120,143). Живые вакцины против сальмонеллеза кур разрабатываются также в Японии (Nakamura V.l. et. al., 1994 г.), Канаде (Tan et. al., 1997 г.), Италии (Pascuccis I. et. al., 1995 г.) и других странах мира (102,144).

Несколькими группами исследователей в Турции (Sayim Y., 1993 г.), США (Nagaraja K.V., 1994 г.), Великобритании (Georg., 1989 г.) создаются химические вакцины на основе компонентов клеточной стенки сальмонелл (119,141). В США разрабатывается идиотипическая вакцина на основе иммунных лимфокинов (Ziprin R.L. et. al., 1997 г.) (120).

Бивалентная живая вакцина рекомбинантная сальмонеллезная для птиц из штамма S. typhimurium №274/09 предложена ВНИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи, СПНИЭиМ им. Пастера и СПГАВМ на основе вакцины против сальмонеллеза овец. В результате гибридизации ат- тенуированных штаммов 8. с1иЬ1т и Б. 1урЫтипит на последний был передан соматический антиген 09, и получен рекомбинантный штамм для принципиально новой вакцины. Изучена защитная активность вакцины в отношении сальмонелл серогрупп В и Б. Пероральное применение этой вакцины позволяет снизить гибель цыплят, выведенных из яиц от вакцинированных кур родительского стада, за 90 дней их выращивания на 25,1%. Куры-несушки формируют иммунитет при пике напряженности на 8 сутки после третьей вакцинации (54).

Однако применением перечисленных вакцинных препаратов не решены проблемы защиты иммунотолерантных новорожденных цыплят, бактерионосительства при сальмонеллезе, безвредности применения. Потому немаловажное значение в специфической профилактике сальмонеллеза кур принадлежит специфичным, безвредным и высокоактивным бактериофагам. Такие бактериофаги лизируют эпизоотические штаммы сальмонелл, к которым они специфичны, применение фагов снимает бактерионосительство, не имеет противопоказаний (22,60).

2.3. Природа бактериофагов и их использование при бактериальных инфекциях птиц.

Бактериофагами называют живые мельчайшие вирусоподобные частицы, способные изменять биологические свойства бактерий, в т.ч. такие как наследственность и изменчивость. Честь открытия этого природного феномена разделили английский бактериолог Т\уог1;, описавший в 1915 году острую инфекционную болезнь стафилококков и возможность пассирования проходившего через бактериальные фильтры инфекционного агента, и канадский ученый, работавший в институте Пастера в Париже, Г. ё'НегПе, независимо от Т\^от1 описавший в 1917 году лизис дизентерийных бактерий мельчайшим агентом. Р. сГНегПе присвоил название открытому агенту «бактериофаг», описал основные биологические свойства фагов и разработал точный метод их титрования. Автор показал, что:

1. бактериофаг является облигатным паразитом, т.к. размножается только на живых бактериях,

2. бактериофаг лучше лизирует молодые культуры, чем старые,

3. бактериофаг может лизировать бактерии в любой питательной среде и при этом он размножается за счет самих бактерий,

4. бактериофаг может вызвать лизис взвеси бактерий определенной густоты (от 50 до 500 млн. клеток), а в очень густых взвесях происходит частичный лизис или он совсем тормозится,

5. образующиеся на агаровых газонах бактерий пятна представляют собой невидимые скопления колоний бактериофага, и взятый с такого участка агар при внесении в бульонную культуру бактерий вызывает ее просветление вследствие лизиса,

6. на процесс лизиса отрицательно влияют все химические вещества и кислая реакция среды, которые вредны для бактерий,

7. могут встречаться устойчивые особи бактерии к лизису под влиянием бактериофага, способные беспрепятственно размножаться и давать вторичный рост культуры в бульоне или на агаре,

8. бактериофаг обладает определенной степенью вирулентности, которая при пассаже на высокочувствительных культурах усиливается (2).

2.3.1. Морфология и структура бактериофагов, их классификации.

Б. (1'НегИе установил корпускулярную природу бактериофагов, определил 4 фазы взаимодействия фага с бактерией: 1 - адсорбция фага на поверхности бактериальной клетки, 2 - проникновение фага в бакклетку, 3 - размножение в бактериальной клетке фагового белка, 4 - лизис бакклетки и освобождение зрелых фаговых частиц, готовых начать новый жизненный цикл (2,122).

Идеи Б. сГНегНе о типовой взаимосвязи фага с микробной клеткой заинтересовали многих ученых. В период с 1920 по 1940 гг. было проведено большое количество работ, посвященных изучению возможности применения бактериофагов с терапевтической целью. В большинстве случаев результаты оказались сомнительными, но при некоторых заболеваниях, например при холере, удалось получить терапевтический эффект. С открытием химио- терапевтических препаратов интерес к применению фагов значительно снизился, но первоначальные надежды на эффективность применения фага в медицине послужили стимулом для проведения многих ценных работ, касающихся специфичности, иммуногенности, стабильности, изменчивости и других свойств бактериофагов.

Выделенные фаги могут быть охарактеризованы по морфологии вирио- нов и негативных колоний, антигенным свойствам, спектру литического действия, чувствительности к воздействию химических веществ и физических факторов, а также по характеристикам взаимодействия в системе «фаг - бактериальная клетка» (2,21,34).

Антигенные свойства приняты в качестве основного критерия дифференциации сальмонеллезных бактериофагов (29). Однако, по данным некоторых авторов, антигенные свойства фагов не связаны с их спектром литического действия, который определяется прежде всего спецификой адсорбционных структур конкретного типа бактериофага (34,77,85).

Современная классификация фагов основана на их химической структуре - типе нуклеиновой кислоты, заключенной в белковой оболочке фага. Различают ДНК- и РНК-содержащие бактериофаги (122,130,136,161).

Вторым классификационным признаком фагов является их тип взаимодействия с микробной клеткой. Согласно этому критерию фаги делятся на вирулентные и умеренные. Заражение бактерий вирулентным фагом завершается лизисом и гибелью клетки (95,131,163).

Первые данные о строении фагов приведены в 1941 году в работе Н. Rusca, который провел электронно-микроскопические исследования дизентерийных фагов (34). Детальные микроскопические исследования в сочетании с некоторыми физико-химическими методами изучения фагов показали, что каждый фаг состоит из различных морфологических элементов, специально приспособленных для защиты ДНК или РНК фага и его внедрения в микробную клетку-мишень. Основные части булавовидных фагов называют головкой и отростком (или хвостом). Головка имеет белковую оболочку - капсид. Морфологические субъединицы капсида, различаемые в электронном микроскопе, называют капсомерами. Структурные элементы сложно устроенных фагов называют наружным чехлом, или чехлом, и внутренним стержнем, или стержнем. Концевая структура отростка фага - базальная пластинка имеет, как правило, отходящие тонкие нити. Если головки и капсиды у многих фагов по своему строению довольно сходны и обычно представляют собой многогранники (октаэдры или икосаэдры) правильной или удлиненной формы размерами от 20 до 150 нм, то в строении отростков имеются существенные различия. На основании этих различий предложен ряд морфологических классификаций фагов. Bradley (1960 г.) разграничивает фаги с сокращающимся чехлом отростка (А), фаги с длинным отростком без сокращающегося чехла (В), фаги с коротким отростком (С), фаги с крупными капсомерами и аналогом отростка (D), фаги с мелкими капсомерами и без отростка (Е), фаги нитевидной формы (F).

A.C. Тихоненко (1968 г.) предложил разделить фаги в порядке усложнения их структуры на пять основных групп (88). С эволюционной точки зрения эта классификация наиболее оправдана.

К первой группе отнесены нитевидные фаги (подобные вирусу табачной мозаики фаги fd, fl, М13 и др.) длиной 700-850 нм и шириной 4-8 нм. Эти фаги состоят из трубкообразного капсида, в котором заключена особая однотяжевая ДНК, составляющая 11,5-14% вириона.

Во второй группе объединены мелкие сферические фаги с формой икосаэдра около 20-30 нм в диаметре, содержащие также однотяжевую ДНК (S13, fZ, fr, R17, М12).

К третьей группе относятся фаги, обладающие четко выраженным хвостовым отростком небольшого размера. Эти фаги найдены у различных родов спорообразующих бактерий, у актиномицетов, хореллы и др. В их головках (40-65 нм) заключена обычная двутяжевая ДНК. По строению отростка выделяют две подгруппы этих фагов: с коротким конусовидным отростком без базальной пластинки (ТЗ, Т4, бруцеллофаги) и с коротким отростком, имеющим базальную пластинку (фаг Р22 к S. typhimurium).

Четвертую группу составляют наиболее распространенные булавовидные фаги (Tl, Т5, фаг к В. anthracis, А, и мн. др.) с длинным несокращающим- ся отростком и изометрическими головками размером от 50 до 100 нм, содержащими внутри обычную двутяжевую ДНК. Концевые структуры отростков фагов четвертой группы весьма разнообразны: в виде базальной пластинки с пятью или шестью лопастями, в виде различной длины выростов, в виде гладкого или конусовидно суженного конца с наличием одной или нескольких нитей. В эту группу входит большинство известных сальмонеллезных фагов (62).

В пятую группу по A.C. Тихоненко отнесены ДНК-содержащие бактериофаги булавовидной формы, имеющие мощный отросток сложного строения, который состоит из наружного сокращающегося чехла, внутреннего жесткого полого стержня и хорошо выраженной базальной пластинки. Последняя, в свою очередь, имеет ряд элементов типа выростов с шипами и почти у всех фагов снабжена длинными нитями. При сокращении чехол отростка расширяется и укорачивается, обнажая дистальный конец внутреннего стержня, который может проникать через клеточную стенку бактерий. К этой группе относится наиболее изученный фаг Т2 и другие Т-четные фаги (88).

2.3.2. Фазы «фаговой инфекции».

Деление фагов на вирулентные и умеренные достаточно условно. Установлено, что в зависимости от конкретной системы «фаг-хозяин» один и тот же штамм в одном случае развивается по литическому циклу, а в другом - ведет себя как типичный умеренный фаг, вызывая с различной частотой ли- зогенизацию клеток (2,34,107).

Литическое действие бактериофагов осуществляется путем инфициров- ния чувствительных бактериальных клеток зрелыми фаговыми частицами. Этот процесс получил название «фаговой инфекции». Он протекает циклически. При внутриклеточном (латентном) развитии вирулентного фага стадии разделены на:

1. морфологическое изменение ядерного аппарата инфицированной бактерии после адсорбции,

2. репродукцию ДНК и белка фага в зараженных бактериях,

3. лизис зараженных бактерий (8).

Способность бактериофага к взаимодействию с микробной клеткой специфична и ограничена только определенным видом возбудителей для данной разновидности. Необходимым условием для репродукции фаговых частиц является внутриклеточное паразитирование. Вне клетки фаги инертны и чем- то напоминают споры бактерий (35).

Первичная фаза взаимодействия бактериофага с бактерией, адсорбция, состоит из диффузии фаговых частиц в среде, их случайном столкновении с бактериями и специфическом прикреплении к поверхности бактериальной клетки (2).

На ход этого процесса влияют количественные соотношения между фагом и клеткой, физические и химические факторы среды, фагоустойчивость бактерий. Феномен бактериофагии протекает в нейтральной или слабо щелочной среде (pH 7,4-7,6). Многие исследователи отмечают, что бактериофаги не адсорбируются на чувствительных бактериальных клетках при pH ниже 5 или выше 12 (95,97,158,160,161).

М. Delbrck (1936 г.) определил адсорбцию фага как процесс его диффузии в среде и специфического закрепления. Именно от адсорбции во многом зависят биологические свойства бактериофага, определяемые трансдукцией и лизогенной конверсией. Было показано, что последняя не только конвертирует авирулентные штаммы дифтерийных бактерий в токсигенные, но также меняет и другие признаки. Так, например, профаг внедряется в генетический аппарат бактерии под влиянием носимого ею латентного фага (112,122). Но, по мнению L. Tolmach (1957 г.), адсорбция отражает лишь физико- химический механизм, и поэтому автор предложил термины «закрепление» и «связывание» (158).

Фаг фиксируется и прикрепляется к бактериальной клетке в зависимости от своей природы, антигенной структуры самой клетки, их фаз роста и размножения. Для взаимодействия с рецепторами клеточной поверхности необходимо изменение конформации фибрилл (103).

Адсорбция фага состоит из обратимой и необратимой фаз. При необратимой ферментативной фазе наблюдается закрепление фага, который не отделяется от клетки, не нейтрализуется антифаговой сывороткой. При этом его эффективность зависит от температуры, вязкости среды и других факторов (131,148,161).

Адсорбцию фага на клетке могут стимулировать катионы и органические вещества. По данным Т. Anderson, Р. Fildes, D. Kay (1957 г.), триптофан играет большую роль в адсорбции фага Е4 Е. coli, что связано с действием аминокислот на фаг (118,133,160). Индол, скатол и другие антагонисты триптофана, по данным М. Debruck (1940 г.), могут тормозить взаимодействие бактерии с фагом (111). Электростатический механизм первичного взаимодействия фага на бактерии можно моделировать на поверхности ионообмен- ника. Например, фаг Т4 прикрепляется к поверхности ионообменника только в присутствии триптофана. При начальном действии фага с катионом наблюдается выделение ДНК фага так же, как это происходит при его закреплении на поверхности клетки. Эти физико-химические представления указывают на одно из основных свойств фага - его специфичность (47,117).

По мнению L. Zelkowiz, Н. Noli (1959 г.), при прикреплении фага на бактерии большое значение имеют водорастворимые липиды клетки (163).

Бактериальная клетка несет на своей поверхности значительное количество рецепторных участков для адсорбции фагов. Возникновение фагоустой- чивых мутантов в большинстве случаев сопровождается потерей рецепторных участков фага клеточной стенкой, в результате чего бактериофаг теряет способность адсорбироваться (89).

Потеря фагорецепторов, как правило, связана с обширными изменениями клеточной поверхности, где локализованы многие структуры, детерминирующие патогенность бактерий. Вследствие этого, образующиеся фагоустой- чивые мутанты адсорбционного типа, в т.ч. и выделяемые после проведения фаготерапии, часто имеют пониженную вирулентность по сравнению с исходной структурой (65,74,155).

Другой причиной образования фагоустойчивых форм бактерий является наличие у них систем рестикции и модификации фаговых нуклеиновых кислот.

Наиболее изучено влияние систем хозяйской специфичности на фаговую инфекцию. Фаговая ДНК, инъецированная в клетку, подвергается воздействию специфических нуклеаз - рестрикции, в этом проявляется защитный механизм клетки от внедрения чужеродного генетического материала (67,89).

Немодифицированный вирус способен инфицировать лишь немногие клетки бактериальной популяции. Фактически, инфицируются клетки с ослабленной или выключенной системой рестрикции, а также обычные клетки при высокой множественности заражения (1,87).

Потомство бактериофагов, избежавших рестрикции, подвергается модификации, приобретая фенотип хозяина, характерный для данной системы хозяйской специфичности. Фаговые частицы, вышедшие из таких клеток, способны размножаться на этом новом бактериальном хозяине. В этом заключается пассивный метод преодоления системы хозяйской специфичности ДНК - адаптация фагов (68).

В ходе эволюции бактериофагов при постоянно меняющихся взаимоотношениях в системах «фаг-хозяин» у них сформировался ряд адаптивных механизмов активного противодействия нуклеазам клеток. Для активного преодоления систем хозяйской специфичности бактериальных клеток у фагов обнаружено несколько механизмов вирусспецифической защиты: 1) разрушение донора метальных групп - кофактора рестриктаз; 2) белки-ингибиторы прямого ингибирования рестриктаз; 3) элиминация сайта узнавания рестриктаз в ходе эволюции; 4) защита этого сайта с помощью особых белков; 5) неспецифические механизмы защиты - введение аномальных оснований экстра-сахаров в фаговую ДНК (1,67,68,87,134).

Наличие вирусспецифических систем защиты, в конечном итоге, и определяет возможность эффективного использования препаратов бактериофагов в лечебных и профилактических целях (90).

Адсорбция сменяется второй фазой взаимодействия фага и бактерии, а именно проникновением его в последнюю. При необратимой фиксации фага на стенке бактерии происходит расщепление периферической части его хвоста на тонкие волокна, играющие роль связывания с субстратом. При этом освобождение дистальной части хвоста фага обусловлено разрывом эфирных связей между нитями и белковым стержнем (86,95,163).

Исследования Ю.С. Тараховского и соавт. (1994 г.) выявили механизмы транспорта фаговой ДНК при инфицировании грамотрицательных бактерий. Согласно их положениям после адсорбции фага на поверхности бактериальной клетки происходит прогиб внешней мембраны и образование непосредственного контакта между внешней и внутренней мембранами бактерии. Эта стадия возможна при окружающей температуре от 0 до 6С. При 6-7С начинается слияние мембран и образование широкого межмембранного мостика, появление утечек калия и проникновение фаговой ДНК в цитоплазму клетки- мишени. При температуре окружающей среды 20С и выше диаметр межмембранного мостика существенно уменьшается, наблюдается изменение зависимости начальной скорости утечек ионов калия от температуры.

Таким образом, слияние мембран и формирование межмембранного мостика, или поры, в клеточной оболочке вызывает высвобождение калия из цитоплазмы бактериальной клетки и дессипацию электрохимического потенциала на плазматической мембране. При инфицировании в физиологических условиях этот процесс занимает несколько минут. Затем, согласно гипотезе Ю.С. Тараховского и соавт., стержень фага гидрофобно взаимодействует с мембраной, в результате образуется специфическая структура - туннель. На последних стадиях инфицирования происходит закрытие межмембранного канала и восстановление электрохимического потенциала на плазматической мембране (86).

Под влиянием сократимого белка осевая часть хвоста фага проникает по образовавшемуся туннелю, и, вслед за этим, внутрь бактерии инъецируется содержимое головки. С этого момента, как отмечают Н. Wisconti и D. Frazer (1956 г.), начинается вегетативная фаза латентного периода развития фага (161). Второй этап латентного периода характеризуется формированием зрелых частиц фага. Когда их число достигает критической величины, происходит лизис клетки, и фаги выходят в среду (48,99,105,162).

L. Fowler и D. Cohen (1945 г.) показали, что бактерии Е. coli, выращенные в питательном бульоне и инфицированные гомологичными фагами, освобождают фаг через 20-22 минуты. При выращивании в той же среде, но с ресуспендированием в синтетической смеси, они давали потомство фага через 40-70 минут.

С появлением фаговой ДНК в клетке-хозяина отмечается ряд культу- ральных изменений. Так, при заражении фагами Е. coli в них увеличивается скорость синтеза ДНК, прекращается синтез собственных белков и начинается усиленное производство фагового белка и фаговой ДНК (131).

Последняя стадия инфекционного процесса, т.е. лизис микробной клетки, сопровождается выходом многочисленного фагового потомства.

Инфекционные циклы следуют друг за другом: популяция фага линейно возрастает в каждом цикле с коэффициентом, равным величине выхода фага при лизисе клетки, до тех пор, пока не наступит лизис всех чувствительных бактерий. Инфицирование одной бактериальной клетки двумя родственными фагами приводит к размножению обоих фагов, но два чужеродных фага в одной клетке существовать не могут - размножится тот фаг, который инъецировал свою ДНК первым. Специфическое взаимодействие вирулентного фага с бактерией, которое завершается лизисом бактериальной клетки с выходом новой популяции фага, дало возможность использованию бактериофагов как диагностических, лечебных и профилактических средств (128,129,145,153, 157).

Установлено также, что и микробы и бактериофаги размножаются по времени логарифмически. Причем скорость накопления бактериофага значительно опережает скорость размножения микроба. Темп накопления остается постоянным для данного бактериофага. Скорость размножения фагов будет неизменной, их концентрация будет увеличиваться с одинаковым постоянством при любых начальных его концентрациях. Конечная популяция фага в несколько раз выше максимальной численности популяции микробов (52,142).

Феномен бактериолизиса, обусловленного фагом, изучался на самых разнообразных моделях системы фаг+бактерия. Высокая литическая активность была получена в опытах с кишечной палочкой (153), на стафилококках и сальмонеллах (145). Доказано, что лизис бактерий возможен как в жидких, так и в твердых средах. L. Crugher, М. Delbrck (1940 г.) и др. показали, что при инфицировании фагом в соотношении около 200 фагов на бактериальную клетку последняя лизируется, но размножение фага не происходит. В таких случаях бактерии набухают, приобретают специфическую форму и постепенно исчезают под действием лизоцима фаговых отростков на клеточные стенки бактерии. Так происходит другой тип литической реакции бактериофагами клетки-мишени - «лизис извне» (34,111,113).

Вместе с тем имеются работы, свидетельствующие о том, что бактериальная взвесь не всегда растворяется при очень высоких соотношениях между фагом и бактерией. Наиболее выраженную литическую активность отмечали при равных и меньших соотношениях бактериофага и бактериальной клетки-мишени (40,108).

А. Brown (1956 г.) доказал ферментативную природу лизиса бактерий: литические ферменты фагов разнообразны - от подобных лизоциму до подобных гиалуронидазе. Литические ферменты фага обусловливают растворение клеточной стенки, что обеспечивает гибель бактериальной клетки. Такая способность фагов определяет большое практическое значение их в борьбе с возбудителями различных болезней.

Установлено, что наиболее выраженная активность фага по отношению к бактериальной клетке отмечается при температуре от 22 до 37С. При такой температуре уже за 60 минут количество живых бактерий кишечной палочки уменьшается на 91%, а через 90 минут - все погибают (108). Отдельные авторы подтверждали лизис бактериальных клеток под действием фагов при низких и высоких температурах, полное прекращение лизиса бактерий при температуре 70С. Низкие температуры снижают лизирующую активность фагов, но не прекращают их деятельность полностью (86,97,99,161).

2.3.3. Применение фагов при салыионеллезах.

Учитывая высокую лизирующую активность бактериофагов, многие исследователи применяли их для типирования возбудителей болезней в очагах сложной эпидемиологической ситуации, для лечения и профилактики инфекционных болезней, к возбудителям которых были получены эти фаги.

В медицинской и ветеринарной практике применяют фаги, выделенные от переболевших сальмонеллезом животных, а также из сточных вод хозяйств, неблагополучных по этой болезни.

Бактериофаги для лечения животных, в т.ч. птиц, а также для идентификации микроорганизмов, должны иметь титр не менее 10"⁷-10"⁸, и лизировать бактериальные культуры в течение 6-10 часов. Для производства бактериофагов обычно используют по несколько типов соответствующих микроорганизмов (сальмонеллезные фаги, применяемые в лечебных целях, состоят из шести типов) (28,66,71,97,117).

Ряд авторов описали случаи успешного применения бактериофагов для эпидемиологического обследования очагов брюшного тифа и выделения источников инфекции. Кроме того, исследователями указана возможность идентифицирования возбудителя брюшного гифа с помощью бактериофагов в очаге массового заболевания детей при наличии сальмонеллоносительства у нескольких человек среди обслуживающего персонала (3,56,83,117).

Метод фаготипирования для идентификации местных случаев заболевания людей сальмонеллезами от приезжих был предложен A. Foley, G. Pet- zold, С. Fowler и соавторами (117,118,147).

Лизис фагами сальмонелл был достаточно глубоко озвучен многими учеными прошлого столетия. A. Lylinghen и др. предложили схему типирования S. typhimurium, для чего использовали фаги, изолированные из фекалий, сточных вод, изогенных штаммов сальмонелл (4,28,35,64,97,98,108,111).

Наиболее широкое признание в диагностической практике получил метод Феликса (1955), основанный на использовании фагов, с помощью которых могут быть идентифицированы 13 фаготипов S. typhimurium (116). Применяются в лабораторной практике фаготипирования возбудителя болезни и другие сальмонеллезные фаги. Известно несколько схем фаготипирования для отдельных культур рода Salmonella (Ss. typhi, paratyphi, typhimurium, dublin, enteritidis, gallinarum-pullorum и других). Еще в 1929 году McDonald и Smitt установили методом фаготипирования эпидемиологическую связь спорадических сальмонеллезов и небольших семейных вспышек с сальмонелле- зами свиней, убитых на местной бойне (154). А.Г. Бочарова (1968 г.) использовала фаги для подтверждения паратифа у телят в различных хозяйствах Челябинской области, В.И. Ширяева и Н.М. Никитюк (1969 г.) изучали с помощью сальмонеллезных бактериофагов видовую принадлежность сальмонелл, выделенных от свиней, городских голубей и обезьян. Результаты исследований названные и другие авторы предлагали для изучения источников заражения людей сальмонеллезом (47,138).

Некоторые ученые предложили использовать сальмонеллезные бактериофаги не только для идентификации культур возбудителя, но и для ускорения постановки диагноза. В ветеринарной лабораторной практике фагои- дентификация давно предложена при паратифозном аборте у кобыл и при других сальмонеллезах. Материал от абортированного плода кобылы высевают на скошенный мясо-пептонный агар в пробирке, затем на нижнюю половину поверхности среды наносят каплю специфического фага и дают ей стечь. Пробирку помещают в термостат и на второй день учитывают результаты. Если в исходном материале имеется возбудитель S. abortus equi, то в верхней части поверхности среды будет наблюдаться рост микроба, а в нижней части по ходу стекания капли фага отмечается отсутствие роста (64,77,106).

Фагодиагностика нашла применение и при санитарно- эпидемиологических (эпизоотологических) исследованиях. Бактериофаги брюшно-тифозных сальмонелл, кишечной палочки и некоторых других бактерий могут обнаруживаться в воде рек, прудов, колодцев, родников, а также сточных вод. Установление наличия фага в воде (или почве) может служить показателем ее загрязнения соответствующими бактериями. Установление титра фага в воде позволяет определить степень загрязненности соответствующими микробами (64,149).

Впервые Б. сГНегПе применил фаги с лечебной целью при кишечных инфекциях, а затем использовал их при пуллорозе-тифе кур и пастереллезе буйволов с положительными результатами. Опыт ученого был продолжен многими исследователями, которые получали противоречивые результаты фагопрофилактики и фаготерапии разнообразных бактериальных инфекций. Однако следует отметить, что длительное время применялись малоизученные фаги, не всегда однородные и в надлежащей степени стабильные, с недостаточной вирулентностью или с недостаточно широким диапазоном литическо- го действия в отношении возбудителей, циркулирующих в определенной местности. К тому же поведение фага в живом организме оказалось недостаточно изученным, что послужило стимулом исследовательской работы в этом направлении. Определенную роль в этом сыграло широкое распространение форм бактерий, устойчивых к большому числу антибактериальных средств, наличие у бактерий трансмиссивных плазмид множественной лекарственной устойчивости, а также значительное количество осложнений, связанных с применением химиотерапевтических препаратов (22,27,30,77).

Было установлено, что фаги, введенные животным перорально, подкожно, внутримышечно, внутривенно и другими путями, - полностью безвредны (исключая редкие случаи шоковых явлений на белковые субстанции бульона), быстро распространяются во всем организме, но в крови не задерживаются, адсорбируясь в лимфатических узлах, печени, селезенке и других органах и тканях. В зависимости от вида животного, способа введения, дозы фаг исчезает из организма через 2-7 суток после введения, частично разрушаясь, частично выводясь через кишечник, почки, а также со слюной. Если же одновременно с фагом вводили и соответствующие бактерии, то фаг обнаруживался в организме через 12 и более дней (95).

Бактериофаги как биопрепараты представляют собой фильтраты полностью лизированной тем или иным фагом соответствующей бульонной культуры бактерии, расфасованные во флаконы или ампулы с обозначением вида фага, его титра, срока годности, учреждения, выпустившего препарат, способа применения.

В 40-х годах XX века бактерифаг, предложенный И.Ф. Квеситадзе, был применен для лечения свыше 6 тыс. больных сальмонеллезом телят. Наилучший результат он давал в начале заболевания - телята выздоравливали на 3-5 сутки. Эффективность фаготерапии паратифа (сальмонеллеза) телят достигала в некоторых хозяйствах 90-100%. Несколько ниже была эффективность фагопрофилактики паратифа у телят при выпойке фага через каждые 9 дней (45). Сходные результаты получил С.М. Муромцев, применивший бактериофаг при лечении сальмонеллеза телят и поросят в 1947 году. Он показал, что фаги, вызывая лизис бактерий, обеспечивают полную элиминацию возбудителя и профилактируют развитие бактерионосительства, в чем их несомненное преимущество перед вакцинами и сыворотками (65).

В последующем были разработаны и нашли применение гертнер-фаг при сальмонеллезе телят, суипестиферфаг - при сальмонеллезе поросят, а с середины столетия И.П. Бирюков, Р.К. Петренко и другие предложили пул- лорум-фаги с высокой литической активностью, что предохраняло цыплят от пуллороза на 90% в лабораторных условиях, на 80% - в производственных условиях. Периодическая дача фага цыплятам и несушкам способствовала снижению бактерионосительства у последних в 3-6 раз. По данным A.B. Ро- мина (1955 г.), пуллорум-фаг с титром Ю^-10, примененный на большом поголовье птиц, обеспечил сохранность 92-96%. У фагообработанных цыплят оказались лучше выраженными агглютинирующие свойства крови, что позволило более успешно выявлять по реакции крове-капельной агглютинации бактерионосителей (77,79). Пуллорный фаг с 1961 г. был взят на вооружение ветеринарии, но со временем эффективность его применения снизилась, все больше отмечалось хозяйств с фагоустойчивыми штаммами 8. аШпагит- риПогит.

С целью повышения эффективности фагопрепаратов предпринимаются попытки их усовершенствования путем постоянного пополнения новыми высокоактивными штаммами или расами фагов, выделяемыми из различных источников или адаптируемыми к свежевыделенным культурам возбудителей, которые циркулируют в данное время в определенной местности. Для этого рекомендуется отбирать штаммы фагов с выраженной адсорбционной способностью на клетках хозяина и сочетающие минимальные значения периода внутриклеточного развития с высокой урожайностью (72,74,90). По мнению В.А. Зуева (1969 г.), для производственного штамма фага желательна способность к индукции синтеза свободного фагового лизоцима, как дополнительного фактора литической активности (40). Г.П. Кикнадзе и Т.Г. Чани- швили (1972 г.) считают, что в качестве дополнительного критерия активности лечебно-профилактических бактериофагов необходимо использовать определение частоты образования фагоустойчивых форм, что позволяет объективно судить о стабильности литической реакции фагов (46).

Клоны бактериофагов могут резко различаться стабильностью лизиса и способностью репродуцироваться на фагоустойчивых мутантах бактерий. При наличии двух и более клонов, перекрестно лизирующих бактерии, частота фагоустойчивости значительно снижается (90). В связи с этим, введение в состав препарата фагов, обладающих взаимно перекрывающимся литиче- ским спектром, резко повышает лечебную эффективность бактериофага как биопрепарата (22,89).

В настоящее время для профилактики и лечения сальмонеллеза птиц предложены бактериофаг против пуллороза-тифа кур Алма-Атинским биокомбинатом; поливалентный сальмонеллезный бактериофаг АВСРЕ Нижегородского НИИЭиМ и бактериофаг сальмонеллезный жидкий СПНПФ «Биотех», заимствованные из гуманитарной медицины. Их применение перо- ральным или аэрозольным способом обеспечивает повышение сохранности цыплят, ремонтного молодняка, делового выхода молодки (28,44,54).

Как отмечалось ранее (п. 2.2.), обеспечить защиту цыплят первых дней жизни, освободить переболевших и маточное поголовье от сальмонеллоноси- тельства призваны активные специфические бактериофаги, профилактиро- вать в дальнейшем заражение возможно использованием вакцин. Это подтолкнуло ученых к созданию нового препарата. В 1995 году научными сотрудниками Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов был предложен новый класс биологических препаратов - сальмофаги. Комплексный препарат - сальмофаг энтеритидис включает в своем составе вакцинный генетически маркированный, фагоустойчивый штамм 8. еп1егШсИ8 и специфический бактериофаг к эпизоотическим штаммам данного серовара сальмонелл. Сочетанное действие бактериофага и вакцинного штамма позволяет обеспечить и лечебный и профилактический эффект, что было изучено на лабораторных животных - белых мышах, а также цыплятах (60,61).

Штамм для изготовления фагового компонента представляет собой высокоактивный бактериофаг широкого спектра действия, лизирующий эпизоотические штаммы 8. ег^егШ&Б, выделенные в различных регионах Российской Федерации.

Одновременное введение фагоустойчивого вакцинного штамма и бактериофага, лизирующего эпизоотический штамм, исключает поствакцинальные осложнения и снимает проблему инфекции, обычно имеющую место при вакцинации по инфицированному фону (59).

Аттенуированный штамм, используемый в сальмофаге в качестве вакцинного компонента, получен путем инсерционного мутагенеза - внедрением в геном рифампицина - резистентного мутанта высоковирулентного эпизоотического штамма транспозонов Тп 7 и Тп 10, с последующей селекцией клонов, устойчивых к действию фага (61).

В дальнейшем сотрудниками ВГНКИ был разработан сальмофаг пул- лорум, объединивший в себе аттенуированный штамм 8. а11ташш-ри11ошт Т 10 и бактериофаги, высокоактивные против эпизоотических штаммов сальмонелл, вызывающих пуллороз-тиф кур и др. птиц, при этом не действующие на вакцинный штамм. Согласно литературным данным, исследовательские работы по изучению лечебных и протективных свойств сальмофага пуллорум в остром лабораторном опыте на восприимчивых объектах (цыплятах), а также производственное испытание препарата до настоящего времени не проводились.

Бивалентный сальмофаг против сальмонеллеза энтеритидис и пуллоро- за-тифа кур объединил в себе сальмофаг энтеритидис и сальмофаг пуллорум и призван обеспечить защиту цыплят от основных этиопатогенных возбудителей сальмонеллеза. Изучению защитных свойств препарата бивалентный сальмофаг и посвящена настоящая работа.

Этиологические особенности сальмонеллеза кур

Возбудитель болезни - бактерии из рода Salmonella семейства Entero- bacteriaceae. Впервые данную бактерию выделили из органов свиней американские ветеринарные врачи Salmon и Smitt в 1885 году и назвали микроб Bact. suipestifer. В 1888 г. Gartner при выяснении этиологии отравлений людей обнаружил один и тот же микроб этого рода в мясе коровы и селезенке умершего человека, и тем самым впервые обосновал бактериальную этиологию сальмонеллезных вспышек. Бактерию назвали Bact. enteritidis (93). В 1890 г. Laffler выделил от павших мышей микроб, получивший название Bact. typhimurium. В том же году Schottmuller и одновременно с ним Kurth во время массовой вспышки заболеваний, клинически сходных с брюшным тифом, выделили Bact. paratyphi и указали на идентичность палочки Гетнера с другими возбудителями пищевых токсикоинфекций. Поэтому все подобные бактерии объединили в одну группу «паратифозных» (91,93).

Международная номенклатурная комиссия в 1934 году отнесла все эти бактерии в род Salmonella. С появлением и открытием новых сальмонелл предлагались различные классификации их с учетом культуральных, ферментативных и серологических свойств. Уже тогда многими исследователями была установлена клинико-эпидемиологическая связь между возбудителями типичного паратифозного заболевания у человека (паратиф А и В) и возбудителями сальмонеллезных токсикоинфекций (93).

На сегодняшний день насчитывается более 2500 сероваров сальмонелл, которые разделены по антигенному родству на 52 серологические группы. В пределах каждого серовара сальмонеллы подразделяются на биовары, фаго- вары, кроме того, они различаются по характеру продуцируемого бактерио- цина (53,57,82,121,135,139,151).

Согласно последней номенклатуре Всемирной организации здравоохранения (1990 г.) род Salmonella состоит только из двух видов: S. enterica и S. bongori. S. enterica делится на 6 подвидов:

I - подвид enterica (choleraesuis);

II - подвид salamae;

III - подвид arizonae Illa и Illd;

IV - подвид diarizonae;

V - подвид houtenae;

VI - подвид indica (135).

Возбудители сальмонеллеза кур относятся преимущественно к подвиду enterica. Это прямые, с закругленными концами грамотрицательные палочки длиной 2-5 мкм и шириной 0,7-1,5 мкм, не кислотоустойчивые и не формирующие эндоспор и микроцист. За счет перитрихиальных жгутиков обычно подвижны, за исключением S. gallinarum-pullorum. Сальмонеллы обладают как дыхательным, так и ферментативным типами метаболизма, что их отличает от других бактерий семейства Enterobacteriacea. Важное дифференциальное значение для рода Salmonella имеют отрицательные тесты на индоло- образование, утилизацию цитрата и малоната натрия, дезаминирование фе- нилаланина, положительный тест на декарбоксилирование лизина (57,82).

В процессе роста энтеробактерии рода Salmonella не ферментируют лактозу, сахарозу, инозит, салицин, не гидролизируют мочевину и желатин, образуют сероводород, редуцируют нитраты, ферментируют маннит. Однако ферментативная активность у сальмонелл может варьировать, что послужило поводом подразделить их на подроды. Отмечено также, что культуры в R- и S-форме могут иметь различия биохимических и серологических свойств (82).

Рост культуры рода Salmonella на МПА образует прозрачные с голубоватым оттенком колонии диаметром от 2 до 5 мм. На агаре Эндо колонии сальмонелл прозрачные, бледно-розовые, на среде Левина - прозрачные с фиолетовым блеском, на агаре Плоскирева - бесцветные, непрозрачные, на висмут-сульфит агаре - черные с металлическим блеском, аналогичные черные колонии с желтоватым ободком и на сальмонеллезно-шигеллезном агаре (53,57,82).

В качестве сред накопления используют селенитовую, магниевую, среды Кауфмана, Мюллера, Киллиана. По данным ВОЗ наиболее эффективной селективной средой изоляции и обогащения сальмонелл является среда Раппо- порта-Вассилиади (151).

Сальмонеллы - аэробы и факультативные анаэробы, оптимальная температура для роста 36-37 С, pH среды 7,0-7,2 (17,38,53,57,70,82).

Антигенная структура сальмонелл, на основании которой в 1940 году предложена их классификация (Кауфман и Уайг), представлена соматическим, жгутиковым антигенами, а также Vi- и поверхностными К-антигенами.

О-антиген (соматический) - термостабильный липосахаридно-белковый комплекс. Жгутиковые Н-антигены - термолабильны, состоят из белка и делятся на 2 вида: первой фазы, обладающие специфическими свойствами, и второй фазы - неспецифическими, характерными для различных сероваров сальмонелл (8,17,53,57,82,104,139).

Для полной идентификации сальмонелл необходима их серологическая типизация по О- и Н-антигенам в реакции агглютинации с поливалентными групповыми О-сыворотками и с монорецепторными О- и Н-сыворотками.

В серогруппе А (02) представлена S. paratyphi А, в серогруппе В (04) - Ss. paratyphi В, typhimurium, abortus equi, abortus ovis, heidelberg, Stanley и другие; в серогруппе С Ss. cholerae suis, paratypti С, typhisuis, thompson, в серогруппе D - Ss. typhi, enteritidis, dublin, gallinarum-pullorum, moskow, panama и другие; в серогруппе Е - Ss. anatum, give и другие (82,92,139).

Большое количество выделяемых сероваров патогенны для различных видов животных, птиц и человека.

Антигенную структуру сальмонелл, выделенных от птицы, изучали многие авторы: Н. Werner, В. Muller (1970 г.), Сох, A. Baxton (1977 г.), С. А. Brandly (1967 г.), L. Minor (1982 г.), М.М. Ахмедов, В.И. Макарочкина, А.Г. Малявин, Е.И. Выдрина (1962 г.), A.A. Кудряков, О.П. Алексеева, Н.Г. Кожемякин (1961 г.), И.С. Загаевский (1968 г.), Э. Ридал, В. Ридал, И.В. Шур (1970 г.), Б.Ф. Бессарабов, Н.К. Сушкова (1998 г.), И.И. Бальчунас (1983 г.), К.Ж. Гаджиев, А.Г. Халимов, В.Г. Зуев, В.А. Кузьмин (1995 г.), C.B. Ленев, Ю.А. Малахов, В.В. Шорохов (1996 г.), В.А. Ведерников (1997 г.), H.A. Рад- чук, Б.Н. Натенсон, Т.М. Сидорова (1998 г.) и другие (6,7,9,10,11,13,14,19, 25,26,39,41,48,50,54,55,60,66,76,96,115,117,139,156).

Серовариантный состав сальмонелл, выделенных от птицы, в том числе от кур, как показали многочисленные исследования, весьма разнообразен, однако чаще всего изолированные культуры сальмонелл относили к Salmonella gallinarum-pullorum, Ss. enteritidis, typhimurium, heidelberg, anatum, london, haifa, moskow, newlands, virchov, dublin и значительно реже к Ss. suipes- tifer, mission, sandiega и к другим.

Центром сотрудничества для реферации и исследований по сальмонеллам ВОЗ в 1990 году предложена классификация сальмонеллезов птиц по этиологии, согласно которой различают:

1) - сальмонеллез, вызванный S. gallinarum-pullorum (ранее именовавшийся как отдельная нозологическая единица - пуллороз-тиф) и S. enteritidis, относящиеся к серогруппе D;

2) - сальмонеллез, вызванный S. typhimurium, поражающий, в основном, водоплавающую птицу;

3) - сальмонеллез птицы, вызываемый не адаптированными к птице се- роварами сальмонелл (Ss. haifa, anatum, london и другие) (19).

Результаты собственных исследований

В ходе работы нами было проведено подробное изучение свойств выделенных сальмонелл, отдельные штаммы паспортизированы. Морфологические, тинкториальные и культуральные свойства изолятов характеризовались типичными для своего рода. Все выделенные сальмонеллы - грамнегативные палочки, длиной 2-5 мкм и шириной 0,7-1,5 мкм, не кислотоустойчивые и не формирующие эндоспор, образующие на МПА с голубоватым оттенком прозрачные колонии в S-форме диаметром от 2 до 5 мм, на агаре Эндо - бледно- розовые колонии, на среде Левина - прозрачные с фиолетовым блеском, на агаре Плоскирева - бесцветные, непрозрачные, на висмут-сульфит агаре - черные с металлическим блеском, на сальмонеллезно-шигеллезном агаре - черные колонии с желтоватым ободком.

Таким образом, большинство выделенных изолятов обладают характерными биохимическими свойствами для данных серовариантов сальмонелл: 8. егЛегШсНБ - подвижностью, сероводородообразованием, редукцией нитратов, сбраживанием глюкозы, арабинозы, маннита, сорбита, дульцита, мальтозы, отсутствием индолообразования, гидролиза желатина, сбраживания сахарозы, лактозы, инозита, салицина, малоната натрия; 8. аШпагит-р1111огит - неподвижностью, сбраживанием глюкозы, маннита, редукцией нитратов, отсутствием роста на цитратном агаре Симмонса, индолообразования, гидролиза желатина, сбраживания сахарозы, лактозы, инозита, сорбита, салицина, малоната натрия.

Многие изоляты высокочувствительны к энрофлоксацину, цефалексину, чувствительны к флубактину, резистентны к бензилпенициллину, мономици- ну, эритромицину, ампициллину, тилозину (кроме S. enteritidis № 15К, 23 С), линкомицину, рифампицину, карбенициллину. Изоляты S. enteritidis № 1JI, 2Л, ЗЛ, 4M, 5Б, 6Б, 7К, 14А, 15К, 160, 21 Я, S. gallinarum-pullomm №2Т g обладали высокой чувствительностью к левомицетину, остальные - средней или низкой чувствительностью.

Изоляты S. enteritidis № 1Л, 2Л, ЗЛ, 4M, 5Б, 6Б, 7К - высокочувствительны к стрептомицину, S. enteritidis № 8Б, 10Б, 11Н, 12В, 13В - к тетрациклину, S. enteritidis № 9Б, 10Б, 11Н, 12В, 13В - к канамицину.

К белкоспире ораль высокочувствителен изолят S. enteritidis №16 О; S. enteritidis №21Я и некоторые другие - слабочувствительны, остальные - резистентны. К неомицину отмечена высокая чувствительность у S. gallinarum- pullorum №5К g, большинство остальных изолятов неомициноустойчивы или низкочувствительны.

S. enteritidis № 20Б резистентен к большинству антибиотиков, слабочувствителен к энрофлоксацину.

На основании ферментативных свойств (положительные тесты на дуль- цит, мальтозу, возможность отрицательного теста на арабинозу) (82,104) изоляты №10 g и 4Т g можно отнести к серовару S. gallinarum, 2Т g и 5К g, несмотря на отрицательный результат ферментации арабинозы, - к S. pullorum. Однако, в связи с отсутствием серологической разделимости существующими наборами сальмонеллезных агглютинирующих сывороток, а также в связи с общепринятой объединенностью данных сероваров как фактора этиопато- генеза пуллороза-тифа кур и весьма схожих свойств микроорганизмов (незначительные отличия в некоторых биохимических свойствах не являются обязательными, и, следовательно, принципиальными), в настоящей работе мы используем единое название штаммам этих серовариантов - S. gallinarum- pullorum.

Эффективность применения бивалентного сальмофага против сальмо- неллеза энтеритидис и пуллороза-тифа кур в производственных условиях изучали на условно благополучных по сальмонеллезу птицефабриках Нижегородской области АОЗТ «Балахнинская птицефабрика» и ОАО «Птицефабрика «Ворсменская».

На базе АОЗТ «Балахнинская птицефабрика» Нижегородской области мы провели производственное испытание бивалентного сальмофага против сальмонеллеза энтеритидис и пуллороза-тифа кур на цыплятах трех- и пяти- суточного возраста согласно временному наставлению.

Для проведения исследований по принципу аналогов были сформированы две группы суточных цыплят кросса «Иза браун»: опытная (зал №1) в количестве 12080 голов, обработанных сальмофагом, и контрольная (зал №2) - 11300 голов, получавших первые 10 дней жизни энрофлоксацин по схеме хозяйства. Остальные ветеринарные обработки птицы (вакцинации, витаминизация) проводились в обеих группах согласно технологической схеме птицефабрики.

Выпойку цыплят бивалентным сальмофагом проводили по 0,5 дозы на цыпленка каждого из фаговых компонентов и по 0,25 млрд. мкр. кл. вакцинного компонента 8. е егШсНв в трех- и пятисуточном возрасте. За птицей опытной и контрольной групп вели ежедневное наблюдение до 100-дневного возраста (перевода из цеха молодняка), учет сохранности, прироста массы, причин падежа, а также бактериологические исследования патологического материала от всех павших цыплят в опытной и контрольной группах.

В 55-58-дневном возрасте птицы проводили ККРНГА с пуллорным антигеном на стекле с кровью 500 цыплят из каждой группы.

Отход цыплят опытной группы за срок наблюдения составил 311 голов, из них 153 цыпленка погибли по причине травматизации (в т.ч. грызунами), 75 - от мочекислого диатеза, у 56 отмечали нерассосавшийся желток, у 11 — расклев, 13 - клоациты, только у 3 павших цыплят отметили картину энтеро- бактериальной септицемии, а при бактериологическом исследовании у них выделили Е. coli. Бактерии рода Salmonella из трупов цыплят опытной группы не выделялись, т.о. заболеваемости и смертности от сальмонеллеза в группе птицы, обработанной бивалентным сальмофагом против сальмонеллеза энтеритидис и пуллороза-тифа кур, не было. Причины гибели цыплят опытной группы представлены на диаграмме 2.

Отход цыплят в контрольной группе за период наблюдения составил 561 голов, из которых 129 пали по причине травматизации, 91 - от мочекислого диатеза, 80 - с нерассосавшимся желтком, 29 - с расклевом, 26 - с клоацита- ми, у 206 трупов наблюдались поражения желудочно-кишечного тракта, печени, респираторных органов. При бактериологическом исследовании патологического материала у 162 цыплят была выделена S. enteritidis, из остальных 44 трупов цыплят с признаками септицемии выделили Е. coli (см. диаграмму 3).

Наибольший отход птицы отмечали на 7-13 сутки жизни преимущественно по причине травматизма и ранений цыплят крысами, а также по причине мочекислого диатеза и нерассосавшегося желтка. Заболеваемость саль- монеллезом в контрольной группе наблюдали с 11-дневного возраста птицы, случаи заболевания с выраженными признаками отмечали до 48 дня жизни, при этом наибольшая смертность от сальмонеллеза приходилась на 14-24- суточный возраст цыплят.

Проведенная ККРНГА среди птицы опытной группы положительно или сомнительно реагирующих не выявила. Среди молодняка кур контрольной группы из 500 проб в ККРНГА с пуллорным антигеном 12 были сомнительными. При бактериологическом исследовании из селезенки и репродуктивных органов убитой птицы, реагировавшей сомнительно в ККРНГА, была выделена 8. ег егШсНэ.

Исследование динамики роста средней живой массы птицы в опытной и контрольной группах (по групповому взвешиванию 80-90 цыплят в трех контрольных клетках каждого цеха (опытной и контрольной группы)) выявило более высокие приросты массы у цыплят в опытной группе, которые отмечали уже в 20-дневном возрасте, но более четко устанавливали к концу срока наблюдения ( см. таблицу 21).

Похожие диссертации на Эффективность бивалентного сальмофага против сальмонеллеза энтеритидис и пуллороза-тифа кур

Эффективность ассоциированной инактивированной вакцины против сальмонеллеза, пастереллеза и актинобациллезной плевропневмонии свиней в производственных условияхЗаболоцкая, Татьяна Витальевна



Патогенная и условно-патогенная микрофлора кишечника кур и эффективность нетрадиционных средств антибактериального действия Артемьева Татьяна Николаевна

Иммунобиологические свойства вакцинного штамма "СГ" и эффективность специфической профилактики инфекционной бурсальной болезни курГодизов, Петр Харитонович

Противоэпизоотическая эффективность мероприятий против мыта лошадей в коневодческих хозяйствах различного типаБайдаров, Абибулла Хайруллаевич



Разработка и оценка эффективности вакцины против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота на основе антигенов бактерий Moraxella bovis и герпесвируса типа 1Дуплева Лилия Шамилевна



Разработка технологии изготовления и оценка эффективности ассоциированной вакцины против гемофилезного полисерозита, отечной болезни и эшерихиоза поросят-отъемышейФокин Александр Александрович

Эпиэоотологическая эффективность гипериммунной сыворотки против эпизоотических штаммов пастерелл серовариантов А и Д, при остром респираторном синдроме телятВоадимиров, Владимир Александрович



Эффективность вакцинации телят против лептоспироза, трихофитии, паратифа в разных экологических зонах Среднего УралаКорсакова Евгения Николаевна

Эффективность одновременной вакцинации птицы против инфекционного ларинготрахеита (ИЛТ) и инфекционной бурсальной болезни (ИББ), против ньюкаслской болезни (НБ) и инфекционного ларинготрахеитаБелкина, Ирина Вадимовна



Эффективность конъюнктивального метода иммунизации баранов против инфекционного эпидидимита с использованием вакцины из штамма B. Abortus 19Бондарева Ольга Викторовна