Содержание к диссертации
Введение
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1. Характеристика возбудителя ринотрахеита кошек 10
2. Особенности патогенеза и эпизоотологии ринотрахеита кошек . 11
3. Основные клинические формы проявления ринотрахеита у кошек 18
4. Методы диагностики ринотрахеита кошек 19
5. Особенности лечения ринотрахеита кошек 22
6. Особенности иммунитета и применения вакцин с целью профилактики ринотрахеита кошек 24
7. Меры профилактики и борьбы с ринотрахеитом кошек 30
8. Заключение по обзору литературы 32
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 35
1. Материалы и методы 35
2. Результаты исследований 39
2.1. Распространение и особенности клинического проявления ринотрахеита кошек в г. Новосибирске 39
2.2. Выделение вируса ринотрахеита кошек в культуре клеток при патологии воспроизводительной функции 56
2.3. Противовирусная активность препаратов в отношении вируса ринотрахеита кошек в опытах in vitro 61
2.3.1. Определение минимальной цитотоксической и максимальной нетоксичной для культуры клеток FS дозы препаратов 64
2.3.2. Определение противовирусной активности препаратов в отношении вируса ринотрахеита кошек in vitro 67
2.4. Противовирусная активность препаратов в отношении вируса ринотрахеита кошек в опытах m vivo 68
ВЫВОДЫ 95
ПРАКТИЧЕСІСИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 97
ЛИТЕРАТУРА 98
ПРИЛОЖЕНИЯ 126
- Характеристика возбудителя ринотрахеита кошек
- Основные клинические формы проявления ринотрахеита у кошек
- Материалы и методы
Введение к работе
Актуальность темы. Ринотрахеит кошек - широко распространенное инфекционное заболевание вирусной этиологии. Возбудитель болезни, FeHV-1, относится к подсемейству Alphaherpesvirinae, роду Varicellovirns, вызывает у взросльсс животных преимущ,ественно поражения органов респираторного тракта и глаз (J.F. Evermann et al., 1993; M.J. Daniels et al., 1999; L. Munson et al., 2003; A.J. Davison et al., 2005).
Важным биологическим свойством вируса является формирование состояния латенции, при котором переболевшие животные, остаются пожизненными вирусоносителями. В некоторых питомниках по выращиванию кошек до 97% животных могут иметь специфические антитела к FeHV-1, что свидетельствует об энзоотическом, характере инфекции. При таком типе течения болезнь сопровождается периодическими рецидивами с выделением вируса во внешнюю среду. Однако у неимунных животных ринотрахеит протекает значительно тяжелее с вовлечением» в инфекционный процесс до 100% животных (М.Р. Nasisse et al., 1998).
При энзоотическом течении, а также при систематической профилактической вакцинации животных, болезнь проявляется в виде слабого респираторного синдрома, а также в виде субклинической или инаппарантной инфекции.
Впервые болезнь описана в США как «синдром поражения верхних дыхательных путей» у котят (R.A. Grandell, F.D. Maurer, 1958). В России выделение вируса с установлением его этиологической роли было осуществлено Э.И. Элизбарашвили и соавт. (1995), затем в Сибири во время вспышки заболевания в питомнике домашних кошек (Т.И. Глотова, 2000).
В последние годы возрос интерес к разведению высокопородных, племенных животных, сопровождающийся их постоянным экспортом и импортом, что значительно усугубляет эпизоотическую ситуацию по инфекционным, болезням.
Распространению возбудителя инфекции среди популяции домашних кошек способствуют концентрация животных в питомниках по их разведению, перегруппировки, выставки, вязки и другие мероприятия, сопровождаюш;иеся стрессами, при которых происходит реактивация вируса из латентного состояния, сопровождаюш,аяся его репликацией и экскрецией во внешнюю среду с носовыми, глазными и вагинальными выделениями, а также слюной животных.
При данной патологии большую роль играет специфическая профилактика, поскольку иммунизированные животные легче переносят инфекцию, однако она не предотврапдает латентного состояния^вируса.
Количество экспериментальных работ, посвященных изучению клинико-эпизоотологических аспектов ринотрахеита кошек в различных климатогеографических регионах России, ограничено. Недостаточное внимание уделяется изучению роли вируса в-патологии органов воспроизводства, а также - противовирусной активности различных препаратов.
Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение клинико-эпизоотологических аспектов ринотрахеита кошек в зависимости от способа содержания животных, определение роли возбудителя в патологии органов воспроизводства, а также изучение противовирусной активности различных препаратов.
Для достижения указа1Шой цели были поставлены следуюпще задачи:
1. Изучить особенности эпизоотической ситуации и клинического проявления ринотрахеита кошек при групповом и индивидуальном содержании, а также - при острой и латентной (рецидивирующей) формах проявления инфекции.
2. Определить роль вируса в патологии органов воспроизводства кошек.
3. Изучить противовирусную активность препаратов ридостин, гамапрен, ацикловир и иодантипирин в отношении вируса ринотрахеита кошек in vitro и in vivo.
Научная новизна работы.
1. Доказано широкое распространение ринотрахеита среди популяции кошек г. Новосибирска при индивидуальном и групповом содержании.
Подтверждено наличие как острой, так и латентной формы инфекции. Частота возникновения и тяжесть клинического проявления болезни коррелируют с концентрацией животных, а также с наличием сопутствующих инфекций (калицивироз, хламидиоз). Болезнь протекает чаще с поражением глаз и респираторных органов.
2. Выделение изолята «Сима» из содержимого матки кошки с преждевременными родами, подтвержденное высоким уровнем сероконверсии к нему, предполагает участие вируса в этиологии патологии воспроизводительной функции данного вида животных.
3. Показана противовирусная активность препаратов ридостин, гамапрен, ацикловир и иодантипирин в отношении вируса ринотрахеита кошек in vitro и in vivo.
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты исследований представляют теоретическую и практическую ценность, так как дают возможность расширить научные знания относительно роли вируса ринотрахеита кошек в возникновении массовых заболеваний у кошек, сопровождающихся поражениями органов респираторного тракта, глаз и органов воспроизводства. Они могут быть использованы при дальнейшем изучении эпизоотологии вирусных инфекций у кошек с целью совершенствования лечебно-профилактических мероприятий.
Результаты исследований открывают возможность повышения уровня эффективности лечебно-профилактических мероприятий при ринотрахеите кошек за счет использования препаратов, обладающих противовирусной активностью в отношении FeHV-1.
Разработаны рекомендации «Стратегия и принципы применения противовирусных препаратов при вирусных болезнях продуктивных и мелких домашних животных», рассмотренных и утвержденных подсекцией секции инфекционной патологии отделения ветеринарной медицины Роесельхозакадемии «Проблемы инфекционной патологии животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» (протокол № 3 от 30.10.07).
Апробация полученных результатов. Материалы исследований доложены на первом съезде ветеринарных фармакологов России (Воронеж, 2007), на ПГ Международной научно-практической конференции (Павлодар, 2007), на III конференции молодых ученых СО РАСХН (Краснообск, 2008), на Международной конференции (Астана, 2008).
Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ в сборниках научных трудов, журнале «Сибирский вестник сельскохозяйственной науки»'И*других изданиях.
Внедрение результатов исследования. Результаты научных исследований использованы при составлении рекомендаций «Стратегия и принципы применения противовирусных препаратов при вирусных болезнях продуктивных и мелких домашних животных», рассмотренных и утвержденных Ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ СО Россельхозакадемии (протокол № 3 от 30.10.07) и подсекцией секции инфекционной патологии отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии «Проблемы инфекционной патологии животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» (протокол № 3 от 30.10.07).
Материалы по изучению противовирусной активности препаратов в отношении FeHV-1 применяются специалистами ветеринарных клиник I г. Новосибирска и г, Омска при лечении различных клинических форм ринотрахеита кошек, а также в учебном процессе в ФГОУ ВПО «НовосибирI ский Государственный аграрный университет» и ФГОУ ВПО «Уральская государственная академия ветеринарной медицины».
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 131 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка литературы, приложений, иллюстрирована 13 рисунками и 20 таблицами. Список литературы представлен 215 источниками, в том числе 161 зарубежным.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Особенности распространения и клинического проявления ринотрахеита кошек при индивидуальном и групповом содержании, острой и латентной формах инфекции.
2. Материалы, определяющие этиологическую роль вируса ринотрахеита кошек в патологии воспроизводительной функции.
3. Результаты изучения противовирусной активности препаратов ридостин, гамапрен, ацикловир и йодантипирин в отношении вируса ринотрахеита кошек in vitro и in vivo.
Характеристика возбудителя ринотрахеита кошек
Герпесвирус кошек (FHV-1; кошачий вирус герпеса 1, FeHV-І) — от носится к подсемейству Alphaherpesvirinae, роду Varicellovirus с[71]. В ес тественных условиях к вирусу восприимчивы многочисленные виды до машних и других членов семейства Felidae [70,79,110,147,157,159,177,181,196]. Вирус проявляет близкое генетическое и антигенное родство с вирусами герпеса -1 собак (CHV-1) и тюленей (PhV-І). Перекрестные иммунные реакции установлены между вирусами ринотрахеита кошек и тюленей [102-104,127,141-143,209, 210]. Позже был изолирован от щенков вирус герпеса, подобный FeHV-І, но отличный от CHV-1. Его роль в этиологии болезни не установлена [78, 123]. Все изоляты FeHV-І проявляют близкое родство между собой. Большинство из них способны вызывать относительно однородные признаки болезни, хотя некоторые обладают повышенной или пониженной вирулентностью [93, 98]. В антигенном отношении все изоляты относятся к одному серотипу, а по результатам рестрикционного анализа тотальной ДНК они также проявляют относительную однородность [97, 108]. Лишь некоторые незначительные генетические различия установлены в области рестрикционного фрагмента Мій 1, переарранжировки в области гена гли-копротеина С (gC), а также различия в сайте Sal 1 UL 17-региона гена-гомолога вируса простого герпеса человека [99,100,115,132]. Несмотря на это, в настоящее время нет данных об изучении роли отдельных изолятов вируса в возникновении болезни. Подобно другим вирусам герпеса, FeHV-І содержит двуспиральную ДНК и имеет липидно гликопротеидную оболочку. Вирус относительно не устойчив во внешней среде, высоко чувствителен к воздействию дезинфи- цирующих средств [76,173]. Сохраняется в течение 18 часов во влажной среде, меньше в сухих условиях и в виде аэрозоли [74,161]. Инфицирование животных в естественных условиях происходит через слизистые носа, ротовой полости и конъюнктивы, хотя при проведении экспериментальных исследований подтверждены и другие пути инфицирования. Например, интравагинальное введение вируса беременным кошкам приводило к возникновению вагинитов и внутриутробному инфицированию плодов [59], а внутривенное - к внутриутробному инфицированию и абортам [114]. Однако, в отличие от некоторых других альфагерпес-вирусов, для FeHV-І инфекции в естественных условиях не является характерным возникновение абортов и репродуктивных болезней [109]. Установлено, что при острой форме после экспериментального заражения вирус реплицируется, в основном, на слизистой носовой перегородки, носовых раковин, носоглотки, и миндалин; других тканей, включая конъюнктиву, челюстные лимфатические узлы и верхние отделы трахеи [86, 112;149]. По данным некоторых исследователей вирус выявляют на слизистой носа и ротовой полости в первые 24 часа после инфекции. Он сохраняется там до 3 недель, хотя ДНК вируса выявляется методом ГГЦР еще дольше [197,202]. Виремия бывает редко, так как подобно некоторым другим респираторным герпесвирусам, его репликация может ограничиваться зонами, имеющими пониженную температуру тела, например, органами респираторного тракта. Однако есть сообщения о кратковременной виремии [112], связанной с размножением вируса в лейкоцитах периферической крови [190]. У истощенных животных и новорожденных котят может развиться генерализованная формы инфекции [175,178,195]. Инфекция респираторных органов сопровождается много очаговым некрозом эпителия с нейтрофильной инфильтрацией и выделением фибрина [68, 69, 93, 112, 164]. Вирус вызывает остеолитические изменения в костной ткани носовых ходов. Предрасположенность вируса к размножению в регионах скелетного роста, включая носовые перегородки, была подтверждена экспериментальным внутривенным инфицированием молодых котят [113]. По литературным данным первичное поражение легких вирусом происходит крайне редко [130]. Результаты экспериментальных исследований- доказывают, что вирус вызывает поражения самостоятельно без присутствия бактерий [112]. Вторичная бактериальная инфекция усиливает действие вируса, способствует его проникновению в более глубокие отделы-респираторногоьтракта, приводя к развитию пневмоний, или?хронического ринита, синусита, или конъюнктивита [93]. Роль FeHV-І в развитии хронического риносинусита не выяснена окончательно. Недавние исследования по выявлению ДНК вируса методом ПЦР у экспериментально инфицированных животных не определили каких-либо закономерностей [117]. Однако установлено, что слизистая носа является наиболее ранним сайтом репликации вируса во время реактивации из латентного состояния [86], и транскрипция FeHV-1 связывается с усилением транскрипции гена цитокинов в слизистой оболочке носа, что подтверждает роль этого вируса в развитии воспаления в носовых ходах [118].
Основные клинические формы проявления ринотрахеита у кошек
Установлено, что FeHV-І инфекция чаще всего сопровождается поражением верхних отделов респираторного тракта. Инкубационный период обычно составляет от 2 до 6 дней, но может быть дольше, клинические проявления болезни зависят от вирулентности вируса [87].
Независимо от условий содержания животных, основной группой, подверженной болезни, является молодняк — котята 1-6 месячного возраста, у которых заболевания протекает в острой форме [52].
При экспериментальных и спонтанных инфекциях чаще всего у животных отмечают: чихание, отсутствие аппетита, и повышение температуры, сопровождаемое развитием серозного конъюнктивита и истечениями из носа [69, 93, 112]. При развитии конъюнктивитов иногда отмечают гиперемиею, отек, обильные выделения из глаз и носа, которые постепенно-становятся слизисто-гнойными, загрязняют шерстный покров, образуют корочки возле носа. В неблагоприятных случаях развивается диспное и сильный кашель. В некоторых случаях образуются язвы в ротовой полости [93] и пневмония [130, 175, 178, 195]. Поражения нервной системы отмечаются крайне редко [85].
У кошек, инфицированных FeHV-І, аборты связаны не с прямым воздействием вируса, а с токсическим эффектом [114]. Исследования, проведенные во время естественной вспышки болезни у кошек, свободных от специфических патогенов, показали отсутствие абортов, даже у беременных кошек с тяжелыми признаками болезни [109].
О роли вируса FeHV-І в развитии конъюнктивитов и, в редких случаях язвенного кератита, было известно давно. [58], но возможность выявления вируса при помощи метода ПНР привела к увеличенному распознаванию этой роли в период острых вспышек заболевания и при хронических повреждениях глаз [151,180,181, 184,198]. Значение данного вируса в возникновении поражений глаз, сопровождающихся поражениями роговицы, эозинофильным кератитом, увеитами и кератоконъюнктивитами менее понятно и требует проведения дальнейших более детальных исследований [134, 153,180, 184,198].
В литературе встречаются сообщения о роли вируса ринотрахеита кошек в возникновении поражений кожи. Ранее сообщалось о язвенном дерматите, вызванном FeHV-І, у кошек и гепардов [80,119,121]. Так же описаны язвенный лицевой и носовой дерматиты и синдром стоматита, сопровождающегося эозинофильной инфильтрацией, у кошек [105, 106] и гепардов [147]. Holland и др. (2006) сообщают о роли вируса FeHV-І и значении ПЦР в диагностике герпетических дерматитов [111].
В последние годы удалось установить роль FeHV-І в возникновении хронических гингивостоматитов у естественно восприимчивых животных [129]. Однако у этих же животных одновременно с вирусом ринотрахеита выявляли наличие калицивируса (FCV). Ранее сообщалось о более частом выявлении FCV, чем FeHV-І у естественно восприимчивых кошек с подобным синдромом [122,166,189,192,201].
В связи с тем, что вирус может размножаться в эпителии слизистой носа в течение острого периода болезни и на ранних стадиях реактивации из латентного состояния, роль вируса в этиологии хронических ринитов также не исключается. Однако в недавних работах не обнаружили различий в частоте выявления вируса у больных и клинически здоровых животных [117].
Материалы и методы
Работа выполнена в 2005 - 2008 гг. в лаборатории биотехнологии-диагностический центр ГНУ ИЭВСиДВ СО Россельхозакадемии.
Распространение, особенности клинического проявления ринотра-хеита кошек изучали путем осмотра животных, поступающих в ветеринарные клиники «ДокторВет», «Евровет» и ГНУ ИЭВСиДВ СО Россельхозакадемии, а так же - находящихся в условиях частных питомников по разведению кошек.
Эпизоотологическое обследование частных питомников проводили по методик СИ. Джупины (1991). Лабораторные диагностические исследования проводили в лаборатории биотехнологии — диагностический центр ГНУ ИЭВСиДВ СО Россельхозакадемии.
Вирусы и культуры клеток. Выделение вируса ринотрахеита кошек проводили в первично трипсинизированнои культуре клеток почки эмбриона котенка.
В опытах использовали вирус ринотрахеита кошек (штамм Гранд). Инфекционную активность вируса определяли в чувствительной перевиваемой линии культур клеток селезенки котенка (FS). В качестве ростовой среды использовали питательную среду Игла MEM с однократным и двойным набором аминокислот, витаминов, 5-10% сыворотки плодов коровы «HyClone» (серия 5037, кат. № SH30088.03), 0,06% L-глутамина, 100 мкг/мл канамицина. Клетки культивировали при 37С и 5% СОг. В качестве поддерживающей среды использовали ту же среду без, или с 2% сыворотки.
Препараты. Ридостин (серии 61006, ЗАО «Вектор-Медика»), Гама-прен (серия № 006, ООО «ГамаВетФарм»), Йодантипирин (серия 030307, ООО "Наука, Техника, Медицина"), Ацикловир (серия 391108, ООО «Озон»). Определение токсичности и противовирусной активности препаратов проводили в соответствии с «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ».
Титрование вируса проводили микрометодом в 96-луночных культуральных планшетах (Costar) с культурой клеток FS (селезенка-кошки) с использованием не менее 4 параллельных рядов. Инфекционный титр вируса выражали в ТЦД5 0/мл (50%-я тканевая цитопатическая доза). Исследования по применению препаратов Гамапрен, Йодантипирин, Ацикловир, Ридостин для лечения и профилактики ринотрахеита кошек проводили на базе ветеринарной клиники «ДокторВет» и частных питомников, специализирующихся на выращивании и разведении кошек различных пород.
За опытными и контрольными животными вели клинические наблюдения, биохимические исследования крови, ежедневный отбор проб биоматериала для проведения вирусологических и серологических исследований. Наличие специфических вируснейтрализующих антител в сыворотках крови кошек определяли в реакции нейтрализации.
Постановку реакции нейтрализации проводили с постоянной дозой вируса (100 ТЦД 50/мл) и двукратными разведениями сыворотки крови, микрометодом в культуральных 96-луночных планшетах по методу М.
Mochizuki,. Konishi S., 1977. Учет реакции проводили на 3-сутки послеза-ражения монослоя культур клеток.
Менее 1 ТЦД50 на клетку. Через 1,5 ч: после этого культуру клеток отмывали питательной средой и вносили препараты в эффективных дозах или питательную среду (контроль). Через 72 ч. культивирования вируса в таких биосистемах титровали культуральную жидкость. Противовирусный эффект рассчитывали по соотношениям инфекционных активностей вируса в опытных ш контрольных образцах;. В; каждомs опыте проводили; дополнительный контроль на токсичность испытуемой дозышрепаратовг
Клинические симптомы ринотрахеита регистрировали ежедневно? перед: проведением; лечения и прослеживали в течение всего периода болезни животных. Критерием противовирусной активности препаратов являлось сокращение длительности проявления клинических признаков (снижение температуры тела,, восстановление аппетита, отсутствие истечений из носа и, глаз, кашля и чихания) и сроков выделения вируса с носовыми секретами.
Результаты клинического обследования животных подтверждали данными анализа проб биоматериала, отобранных от животных, методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Учитывали наличие болезней, протекающих у кошек со сходной симптоматикой, -калицивироз и хламидиоз. Для проведения дифференциальной диагностики использовали коммерческие тест-системы: «Калици-вир», «Риновир» и «ХЛА-КОМ», разработанные ФГУ «ВГНКИ» совместно с Центральным научно-исследовательским институтом эпидемиологии.
В сыворотке крови определяли активность ферментов печеночного происхождения - трансаминаз и щелочной фосфатазы. Для этого использовали реактивы фирмы Biocon (производитель Германия). Определяли: активность щелочной фосфатазы при помощи Fluitest alp и длине волны Hg 405 нм (400-420 нм), аланинамино-трансаминазы - Fluitest ast gpt-alt и Hg 340 нм, аспартат аминотрансаминазы - Fluitest ast got-asat и Hg 340 нм, на программируемом Фотометре 4040 (производитель Robert riele GmbH&Co KG, Германия).
