Содержание к диссертации
Введение
1 Общая характеристика работы
1.1 .Актуальность проблемы
2.3. Живые вакцины против пастереллеза птиц .
2.3.1. Сухая живая вакцина из пастеровского штамма. (ТУ 10-19-604-88)
2.4. Инактивированные вакцины, против пастереллеза птиц .
2.4.1.Историческая справка.
- Живые вакцины против пастереллеза птиц
- Сухая живая вакцина из пастеровского штамма. (ТУ 10-19-604-88)
- Инактивированные вакцины, против пастереллеза птиц
Введение к работе
1.1 Актуальность проблемы
Пастереллез - контагиозная инфекционная болезнь домашних и диких животных, Характеризующаяся при остром течении признаками септицемии, крупозным воспалением и отеком легких, плевритом, а при хроническом течении гнойно-некротической пневмонией, артритом, маститом, керато-конъюнктивитом, эндометритом и иногда энтеритом.
Пастереллез (холера) птиц характеризуется септицемией, поражением суставов и сережек.
Возбудитель пастереллеза относится к семейству Pasteurellaceae, роду Pasteurella. Честь открытия возбудителя принадлежит Туссену (1879) и Пастеру (1880).
Род PasteuTella делится на 6 видов: P. multocida, P. haemolytica, P. pneumo-tropica, P. urea, P. aerogenes, P. gallinarum.
P. multocida - возбудитель геморрагической септицемии животных, и так называемых "легочных пастереллезов", вторичных инфекций, осложняющих течение болезней вирусной и микоплазменной этиологии.
P. haemolytica вызывает пневмонию у крупного рогатого скота и овец и в отличие от P. multocida растет на среде Мак-Конки, не образует индол и уреазу, является.одним из возбудителей фибринозной плевропневмонии у крупного рогатого скота, овец и коз, мастита у овец, септицемии у ягнят.
»
Пастереллы других видов практически не патогенны для сельскохо-іяйственньїх животных.
Морфологические, культуральные и патогенные свойства пастерелл хо-)ошо изучены. Можно считать, что пастереллы убиквитарны и паразитируют на кивотных многих видов; взаимоотношения паразита и хозяина сглажены, о чем :видетельствует широко распространенно? бессимптомное пастереллоноси-
2 тельство, при котором возбудитель паразитирует в организме, не вызывая клинических проявлений. Однако, в ряде случаев он вызывает энзоотии, охватывающие большое число животных, особенно у кур, или выступает как возбудитель вторичной инфекции.
Вирулентность пастерелл наиболее выражена для того вида животных, от которых они выделены.
Широкая распространенность, высокая заболеваемость и смертность делают необходимым проведение рпецифической профилактики пастереллеза.
Пастер на примере P. multocida впервые обосновал возможность направленной аттенуации патогенных микробов вообще и создал живую вакцину против холеры кур.
Созданию высокоиммуногенных вакцин препятствует недостаточная изученность антигенной структуры пастерелл. В отличие от микробов других видов, четко разделенных на подвиды, серогруппы, серовары, биовары и т.д., у пастерелл до сих пор нет общепризнанной номенклатуры, основанной на антигенной структуре.
Согласно Руководства по стандартам Международного эпизоотического бюро (1996), P. multocida по Картеру имеет 5 (А, В, Д, Е, F) капсульных (К), по Намиока - 12 (1-12) и по Хедлестоуну 16 (1-16) соматических сероваров. Р. haemolytica подразделяется на 2 биотипа (А, Т) и 16 сероваров.
Серовариантную принадлежность пастерелл определяют по капсульному антигену в реакции агглютинации (РА), РИГА, РИЭФ, а по соматическому - в РА и реакции иммунофлуоресценции (РИФ) в агаровом геле.
Кроме того, серовар Д образует в растворе акрифлавина крупнохлопчатый не разбивающийся флокулят. Рост штаммов серовара А подавляется гиалурони-дазой, и после чего и они растут медленнее других.
В настоящее время применяют две системы идентификации пастерелл: На-миока-Картера и Картера-Хедлестоуна.
Для профилактики пастереллеза животных применяют 13 инактивирован-ных и две живые вакцины из штаммов АВ и К (Краснодарская НИВС).
Общими недостатками в производстве вакцин против пастереллеза являются следующие:
отсутствие стандартизованной питательной среды и отработанной технологии изготовления вакцин;
недостаточная изученность антигенной структуры эпизоотических и вакцинных штаммов;
отсутствие методов контроля, позволяющих дифференцировать достаточно иммуногениые серии вакцин от слабоиммуногенных.
Кроме того, для большинства вакцин схемы вакцинации против пастереллеза животных различных видов неудовлетворительные.
1.2. Цель исследований
Разработать бнопогические основы универсальной технологии изготовления, контроля и применения некоторых вакцин против пастереллеза животных.
1.3. Основные задачи исследований
-
Разработать уни.. реальную питательную среду для культивирования пастерелл с использованием непищевого сырья.
-
Изучить свойства штаммов пастерелл, используемых для изготовления вакцин.
-
Изучить динамику роста популяции пастерелл на предложенной среде, определить оптимальные сроки культивирования, аэрации, перемешивания, рН среды и другие технологические параметры.
-
Разрзботать способ изготовления, контроля и применения следующих вакшт:
4.1. жчео'1 против пастереллеза кур;
-
инактивированной лиофилизированной против пастереллеза крупного рогатого скота и буйволов;
-
ассоциированной против сальмонеллеза, пастереллеза и стрепто-коккоза поросят;
-
против пастереллеза и стрептококкоза нутрий;
5. Усовершенствовать способ изготовления, контроль и применение вакцин:
-
против пастереллеза птиц инактивированной сорбированной;'
-
против пастереллеза и эшерихиоза птиц;
-
против пастереллеза овец и свиней преципитированной;
-
против пастереллеза кроликов;
-
против пастереллеза норок эмульгированной;
-
против пастереллеза нутрий эмульгированной. 1.4. Научная новизна
Получен супрессорный ревертант штамма P. multocida серовара А, несущий мутации в гене супрессоре и стрептомициновом локусе и использован для иігоіов.теїшя вакцины. Обоснована возможность получения аттенуированных ппаммов других видов микробов этим же методом.
Установлены индифферентные взаимоотношения in vitro и in vivo между ангнгашш P. multocida сероваров А, В и Д, серовары S.cnoleraesuis и S гчрішшігішті. Streptococcus серогрупп С и R. На этой основе разработана технология приготовления вакцины против пастереллеза, сальмонеллеза и стрептококком.
Разработан способ изготовления сухой вакцины против пастереллеза крупного рогатого скота и буйволов с 25%-ным содержанием ГОА. а также методы контроля и применения.
Разработаны технологические условия приготовления ассоциированной вакцины против пастереллеза и стрептококкоза нутрий.
Установлена возможность добавления гидролизатов из куриных эмбрионов и кровяных сгустков в состав среды для культиъирования пастерелл.
Дана оценка активности вакцины против пастереллеза птиц из капсульного компонента по содержанию белка в активной вакцине, количество белка должно быть не менее 1,2 мг/ %.
Обоснована целесообразность использования в качестве адъюванта 6%-ной гидроокиси алюминия вместо алюмокалиевых квасцов в преципитиро-ванной вакцине против пастереллеза овец, свиней и агара - в вакцине для кроликов. Научная новизна разработок подтверждена тремя патентами: № 161420] от24.03.1989г.; № 2030915 от 31.10.1990г.; № 2103375 от 27.01.1998г.
1.5. Практическая значимость
Предложена среда для культивирования пастерелл, в которой до 65% составляет непищевое сырье.
Разработаны и применяются в практике.- живая-сухая вакцина против пастереллеза кур, ассоциированная вакцина против салъмонеллеза, пастереллеза и стрептококкоза поросят, лиофилизированная вакцина против пастереллеза крупного рогатого скота и буйволов, вакцина против пастереллеза и стрептококкоза нутрий.
' Усовершенствованы и также применяются в практике вакцины:
против пастереллеза овец и свиней, кур, кроликов, нутрий и норок. На каждый препарат разработана нормативная документация.
1.6. Апробация
, Результаты исследований по диссертационной работе доложены и одобрены на следующих конференциях:
Международной конференции по актуальным проблемам ветеринарии, г. Барнаул, 1995г.
Всероссийской конференции РАН по современным достижениям биотехнологии, г. Ставрополь, 1996г.
Научной конференции Краснодарской НИВС, 1996г.
Всероссийской научно-производственной конференции, посвященной 100-летию биологической промышленности, г. Курск, 1996г.
Международной конференции, посвященной 30-летию Прикаспийского Зонального НИВИ, г. Махачкала, 1997г.
Научных конференция}; Ставропольской ГСХА, г.Ставрополь, 1997-99гг.
Региональной конференции по актуальным проблемам ветеринарной медицины мелких домашних животных на Северном Кавказе, п. Персианов-скіїіі, 1999г.
Всероссийской конференции по современным достижениям биотехноло-1ИИ - вклад в науку и практику XXI века, г. Ставрополь, 1999г.
1.7. Основные положения, выносимые на защиту Па защиту выносятся.
способ получения и применения универсальной питательной среды для паоерел.т;
способ получения вакцины для кур из аттенуированного штамма пасте-рс.т.т.
ни oioiuciinc вакцины против пастереллеза, сальмонеллеза и стрептококком поросят (III 1С);
способ изготовления и применения лпофилизпрованной вакцины против iiaeicpc.i.iesa крупного рогатого скота и буйволов;
способ получения вакцины против пастереллеза и стрелтококкоза нутрий;
усовершенствованы технологии изготовления и контроль вакцин против: пасгере.тлеза к\р пнактпвированной сорбированной, против пастереллеза кроликов. п\ іриіі. норок.
Живые вакцины против пастереллеза птиц
Пастереллез - контагиозная инфекционная болезнь домашних и диких животных, Характеризующаяся при остром течении признаками септицемии, крупозным воспалением и отеком легких, плевритом, а при хроническом течении гнойно-некротической пневмонией, артритом, маститом, керато-конъюнктивитом, эндометритом и иногда энтеритом.
Пастереллез (холера) птиц характеризуется септицемией, поражением суставов и сережек. Возбудитель пастереллеза относится к семейству Pasteurellaceae, роду Pasteurella. Честь открытия возбудителя принадлежит Туссену (1879) и Пастеру (1880). Род Pasteurella делится на 6 видов: P. multocida, P. haemolytica, P. pneumoropica, P. urea, P. aerogenes, P. gallinarum. P. multocida - возбудитель геморрагической септицемии животных, и так называемых "легочных пастереллезов", вторичных инфекций, осложняющих течение болезней вирусной и микоплазменной этиологии.
P. haemolytica вызывает пневмонию у крупного рогатого скота и овец и в отличие от P. multocida растет на среде Мак-Конки, не образует индол и уреазу, является.одним из возбудителей фибринозной плевропневмонии у крупного рогатого скота, овец и коз. мастита у овец, септицемии у ягнят.
DumK практически не патогенны для сельскохо 2 тельство, при котором возбудитель паразитирует в организме, не вызывая клинических проявлений. Однако, в ряде случаев он вызывает энзоотии, охватывающие большое число животных, особенно у кур, или выступает как возбудитель вторичной инфекции.
Вирулентность пастерелл наиболее выражена для того вида животных, от которых они выделены. Широкая распространенность, высокая заболеваемость и смертность делают необходимым проведение специфической профилактики пастереллеза. Пастер на примере P. multocida впервые обосновал возможность направленной аттенуации патогенных микробов вообще и создал живую вакцину против холеры кур.
Созданию высокоиммуногенных вакцин препятствует недостаточная Изученность антигенной структуры пастерелл. В отличие от микробов других видов, четко разделенных на подвиды, серогруппы, серовары, биовары и т.д., у пастерелл до сих пор нет общепризнанной номенклатуры, основанной на антигенной структуре.
Согласно Руководства по стандартам Международного эпизоотического бюро (1996), P. multocida по Картеру имеет 5 (А, В, Д, Е, F) капсульных (К), по Намиока - 12 (1-12) и по Хедлестоуну 16 (1-16) соматических сероваров. Р. haemolytica подразделяется на 2 биотипа (А, Т) и 16 сероваров.
Серовариантную принадлежность пастерелл определяют по капсульному антигену в реакций агглютинации (РА), РИГА, РИЭФ, а по соматическому - в РА и реакции иммунофлуоресценции (РИФ) в агаровом геле.
Кроме того, серовар Д образует в растворе акрифлавина крупнохлопчатый не разбивающийся флокулят. Рост штаммов серовара А подавляется гиалурони-дазой, и после чего и они растут медленнее других.
В настоящее время применяют две системы идентификации пастерелл: На-миока-Картера и Картера-Хедлестоуна.
Для профилактики пастереллеза животных применяют 13 инактивирован ных и две живые вакцины из штаммов АВ и К (Краснодарская НИВС).
Общими недостатками в производстве вакцин против пастереллеза являются следующие: - отсутствие стандартизованной питательной среды и отработанной технологии изготовления вакцин; - недостаточная изученность антигенной структуры эпизоотических и вакцинных штаммов; - отсутствие методов контроля, позволяющих дифференцировать достаточно иммуногенные серии вакцин от слабоиммуногенных. Кроме того, для большинства вакцин схемы вакцинации против пастереллеза животных различных видов неудовлетворительные.
Получен еупрессорный ревертант штамма P. multocida серовара А, несущий мутации в гене супрессоре и стрептомициновом локусе и использован для изготовления вакцины. Обоснована возможность получения аттенуированных штаммов других видов микробов этим же методом.
Установлены индифферентные взаимоотношения in vitro и in vivo между антигенами P. multocida сероваров А, В и Д, серовары S.choleraesuis и Shphimunum. Streptococcus серогрупп С и R. На этой основе разработана технология приготовления вакцины против пастереллеза, сальмонеллеза и стрептококкоза.
Разработан способ изготовления сухой вакцины против пастереллеза крупного рогатого скота и буйволов с 25%-ным содержанием ГОА. а также методы контроля и применения
Разработаны технологические условия приготовления ассоциированной вакцины против пастереллеза и стрептококкоза нутрий. Установлена возможность добавления гидролизатов из куриных эмбрионов и кровяных сгустков в состав среды для культивирования пастерелл.
Дана оценка активности вакцины против пастереллеза птиц из капсульного компонента по содержанию белка в активной вакцине, количество белка должно быть яе менее ] ,2 мг/ %.
Обоснована целесообразность использования в качестве адъюванта 6%-ной гидроокиси алюминия вместо алюмокалиевых квасцов в преципитиро-ванной вакцине против пастереллеза овец, свиней и агара - в вакцине для кроликов. Научная новизна разработок подтверждена тремя патентами: № 1614201 от 24,03.1989г.; №2030915 от 31.10.1990г.; № 2103375 от 27.01.1998г.
Сухая живая вакцина из пастеровского штамма. (ТУ 10-19-604-88)
Получен еупрессорный ревертант штамма P. multocida серовара А, несущий мутации в гене супрессоре и стрептомициновом локусе и использован для изготовления вакцины. Обоснована возможность получения аттенуированных штаммов других видов микробов этим же методом.
Установлены индифферентные взаимоотношения in vitro и in vivo между антигенами P. multocida сероваров А, В и Д, серовары S.choleraesuis и Shphimunum. Streptococcus серогрупп С и R. На этой основе разработана технология приготовления вакцины против пастереллеза, сальмонеллеза и стрептококкоза.
Разработан способ изготовления сухой вакцины против пастереллеза крупного рогатого скота и буйволов с 25%-ным содержанием ГОА. а также методы контроля и применения
Разработаны технологические условия приготовления ассоциированной вакцины против пастереллеза и стрептококкоза нутрий. Установлена возможность добавления гидролизатов из куриных эмбрионов и кровяных сгустков в состав среды для культивирования пастерелл.
Дана оценка активности вакцины против пастереллеза птиц из капсульного компонента по содержанию белка в активной вакцине, количество белка должно быть яе менее ] ,2 мг/ %.
Обоснована целесообразность использования в качестве адъюванта 6%-ной гидроокиси алюминия вместо алюмокалиевых квасцов в преципитиро-ванной вакцине против пастереллеза овец, свиней и агара в вакцине для кроликов. Научная новизна разработок подтверждена тремя патентами: № 1614201 от 24,03.1989г.; №2030915 от 31.10.1990г.; № 2103375 от 27.01.1998г.
Предложена среда для культивирования пастерелл, в которой до 65% составляет непищевое сырье.
Разработаны и применяются в практике: живая "сухая вакцина против пастереллеза кур, ассоциированная вакцина против сальмонеллеза, пастереллеза и стрептококкоза поросят, лиофилизированная вакцина против пастереллеза крупного рогатого скота и буйволов, вакцина против пастереллеза и стрептококкоза нутрий.
Усовершенствованы и также применяются в практике вакцины: против пастереллеза овец и свиней, кур, кроликов, нутрий и норок. На каждый препарат разработана нормативная документация.
Результаты исследований по диссертационной работе доложены и одобрены на следующих конференциях: Международной конференции по актуальным проблемам ветеринарии, г. Барнаул, 1995г. Всероссийской конференции РАН по современным достижениям биотехнологии, г. Ставрополь, 1996г. 76
Научной конференции Краснодарской НИВС, 1996г. Всероссийской научно-производственной конференции, посвященной 100-летию биологической промышленности, г. Курск, 1996г Международной конференции; посвященной 30-летию Прикаспийского Зонального НИВИ. г. Махачкала, 1997г. Научных конференциях, Ставропольской ГСХА, г.Ставрополь, 1997-99 г.г. Региональной конференции по актуальным проблемам ветеринарной медицины мелких домашних животных на Северном Кавказе, п. Персианов-ский. 1999г. Всероссийской конференции по современным достижениям биотехнологии вклад в науку и практику XXI века, г Ставрополь, 1999г. Основные положения, выносимые на защиту На защиту выносятся: способ получения и применения универсальной питательной среды для иастерелл: способ получения вакцины для кур из апенуированного штамма пасте ред.т. іні оіовлспие вакцины против паетереллеіа. сальмонеллеза и стрептокок коза порося г ( П11С). способ илоговдения и применения диофплизированной вакцины против насіере.т.іе;а крупного рогатого скоіа и буйволов: способ получения вакцины против пастереллеза истрептококкоза нутрий; совершенствованы технологии изготовления и контроль вакцин против: пасіере.і.іеза к\р инактивированной сорбированной, против пастереллеза кроликов, пуіриіі. норок.
Инактивированные вакцины, против пастереллеза птиц
Вакцина против пастереллеза. кроликов предложена Леонтюком В.И. в 1968 г. и изготавливается из 7 штаммов пастерелл, выделенных от павших кроликов.
В качестве питательной среды использовали экстракт из тканей кроликов, павших от пастереллеза вследствие заражения вакцинными штаммами пастерелл, к которому добавляли 5-8% кроличьего хоттингеровского перевара. Каждый штамм выращивали в отдельном баллоне. Длительность иммунитета, по данным автора, составляла не менее 15 месяцев.
Затем производственные штаммы пастерелл стали выращивать в реакторах в бульоне Хоттингера, приготовленного из говяжьего мяса. Продолжительность культивирования сократили до 12-14 часов. В качестве адъю-ванта добавляли агар-агар до 0,5%-ной концентрации.
Мы проверили иммуногенность вакцины, в частности, продолжительность иммунитета и адъювантное действие агара микробиологического ГОСТ 17206-84. Оказалось, что длительность иммунитета при двукратном введении вакцины не превышает 5-6 месяцев; кроме того, 0,5%-ная концентрация агар-агара затрудняет введем ние вакцины и не обеспечивает адъювантного действия. Мы поставили задачу изучить возможность использования в качестве адъюванта гидроокись алюминия. Опыт был поставлен по той же схеме, что и при иммунизации телят. Вакцина, содержащая 30% шестипроцентного гидро-ксапа, оказалась наиболее иммуногенной. Кролики, получившие вакцину с такой концентрацией ГОА, выживали в 90-100% случаев, а из получивших вакцину с агар-агаром - 60-70%.
Мы вакцинировали кроликов двукратно с интервалом 10-12 дней внутримышечно. Каждый см вакцины содержал 5 млрд. пастерелл и 30% гидроокиси алюминия 6%-ной.
Кроликам 1,5-месячного возраста вводили 1 см3 вакцины, а с трех месяцев и старше - по 1,5 и 2 см" вакцины. Продолжительность иммунитета у вакцинированных гидроокисьалюминиевой вакциной кроликов превышала шесть месяцев. 2.9. Преципіітированная формолвакцина против пастереллеза овец и свиней. (извещение № 3 об изменении ТУ 46-21-185-84)
Вакцина представляет собой смесь эпизоотических штаммов пастерелл, выделенных от крупного рогатого скота и свиней при остром течении инфекции, инактивированную формалином и преципитированную алюмокалиевыми квасцами.
Для изготовления вакцины используют 2 штамма возбудителя пастереллеза крупного рогатого скота (штаммы №№ 796 и 116) и 2 штамма возбудителя пастереллеза свиней (№№ 877 и 656). Контрольным является штамм № 796.
Штаммы 116 и 796 должны вызывать гибель телят в возрасте 4-6 месяцев, массой 80-90 кг через 18-30 часов после внутримышечного введения 1,0-2,0 мл суточной бульонной культуры; штаммы 877 и 656 возбудителя пастереллеза свиней обусловливают гибель поросят 2-3 месяцев массой 20-25 кг через 36 часов после внутримышечного заражения 1,0-2,0 мл культуры.
LDsii для белых мышей упомянутых выше штаммов колеблется от 3 до 20 микробных клеток. При культивировании в реакторе вырастает 6-10 млрд/см3 микробных тел. Квасцы добавляют в реактор из расчета 20-25 мл 10%-ного стерилизованного автоклавированием (1 атм., 60 мин) раствора на литр культуры. После добавления квасцов начинается интенсивное выпадение хлопьев в осадок, что указывает на степень преципитации культуры. К последней добавляют формалин до 0,25-0,3о-ной концентрации. Формалинизированную культуру выдерживают сутки при постоянном перемешивании. Вакцина успешно проходит контроль на безвредность и активность.
Однако, ранее при иммунизации крупного рогатого скота в хозяйствах вакцина давала до 50 осложнений в год, которые проявлялись аллергией немедленного типа, нередко с летальным исходом.
В целях недопущения аллергических реакций сократили концентрацию пастерелл в вакцине до 4 млрд/см . Несмотря на то, что иммунизирующая доза для крупного рогатого скота была сокращена вдвое, количество осложнений оставалось на прежнем уровне.
Массовые осложнения после вакцинации вынудили прекратить применение вакцины для крупного рогатого скота.
В 1984 г. было утверждено ТУ на формолвакцину против пастерел-леза овец и свиней преципитированную. Овцы и свиньи не давали аллергических реакций и имели иммунитет достаточной напряженности.
Мы поставили задачу усовершенствовать эту вакцину путем замены алю-мокалиевых квасцов на гидрат окиси алюминия и уточнить оптимальную иммунизирующую дозу для крупного рогатого скота, свиней и овец.
Была приготовлена вакцина, содержащая в 1 см P. multocida серовара В 5 млрд., сероваровА и Д - по 2,5 млрд. микробных клеток, а вместо алюмокалие-вых квасцов ввели гидроокись алюминия в различной концентрации. Опыт поставлен на бычках 4-5 месячного возраста. Результаты опыта представлены в таблице 7.
