Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ... 9-45
1.1 . Иммунная система птицы. 9- 16
1.2.Влияние вакцинации на иммунобиохимические характеристики сыворотки крови птицы 16-18
1.3.Колибактериоз. Характеристика возбудителя 18-31
1.4.Специфическая профилактика колибактериоза птицы 31-45
1.4.1. Инактивация возбудителя при конструировании инактивированных вакцин 36-38
1.4.2. Применение адъювантов при конструировании инактивированных вакцин 38-45
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 46-85
2.1. Материалы и методы исследования 46-55
2.2. Результаты исследований 57-89
2.2.1. Получение биомассы Escherichia coli при конструировании вакцины 57-59
2.2.1.1. Серологическая характеристика штамма Escherichia coli. 60-61
2.2.1.2. Вирулентные свойства штамма Escherichia coli ...61
2.2.2. Инактивация клеток Escherichia coli 61-64
2.2.2.1. Влияние аминоэтилэтиленимина и формалина на морфологию бактерий Escherichia col 64-69
2.2.3. Метод изготовления моновалентной гидроокисьалюминиевой формолвакцины против колибактериоза птицы 69-71
2.2.4. Метод изготовления моновалентной инактивированной липосомальнои вакцины против колибактериоза птицы 71-73
2.2.5. Иммунобиологические свойства вакцины 74-89
2.2.5.3. Результаты сравнительной оценки инактивированной липосомальнои вакцины и гидроокись алюминиевой формолвакцины против колибактериоза птицы 74-78
2.2.5.2. Оценка иммуногенных свойств вакцины 79-83
2.2.5.3. Влияние инактивированной липосомальнои вакцины против колибактериоза птицы на уровень общего белка и белковых фракций в сыворотке крови цыплят подопытной и контрольной групп - 83-89
3. Обсуждение 89-96
4. Выводы 97-98
5. Практические предложения 98
6. Список использованных литературных источников 99-122
7. Приложение 122-132
- Иммунная система птицы.
- Получение биомассы Escherichia coli при конструировании вакцины
- Оценка иммуногенных свойств вакцины
Введение к работе
В настоящее время созданы и эффективно функционируют птицеводческие предприятия промышленного типа. Они отличаются целым рядом особенностей, важнейшей из которых является большая концентрация поголовья птицы на малых площадях. В. условиях искусственного климата птица лишена активного движения, свободного выбора корма, солнечного освещения. Поэтому любое нарушение условий содержания птицы действует как сильный стрессовый фактор, способствующий увеличению вирулентности условно-патогенной микрофлоры и, как следствие, развитию инфекционного процесса (Коровин Р.Н. и др., 1989; Виноходов В.О., 2000).
Среди болезней птиц бактериальной природы наиболее широко распространён колибактериоз, протекающий остро и хронически (Apajalahti J. et al., 2004; Nili H„ Mahjour A. A., 2005; Mojtaba Bonyadian, Hamb Allah Moshtaghi, 2007; Бакулин B.A., 2006; Виноходов В.О., Лысенко С.Н., 2006; Кузьмин В. А. и др., 2006; Борисенкова А.Н., 2007).
Согласно данным статистической отчётности Департамента ветеринарии Российской Федерации, эшерихиоз был зарегистрирован в 24 субъектах Федерации. Чаще болезнь регистрируется на территории Волго-Вятского, Центрально-Чернозёмного, Поволжского, Уральского, Западно-Сибирского и Восточно-Сибирского экономических районов. Удельный вес падежа птицы от эшерихиоза составил 71,3% из числа всех павших от заразных болезней (Ярёменко Н.А., 2002).
В комплексе мер борьбы с инфекционными заболеваниями, включающими соблюдение ветеринарно-санитарных правил, условий содержания и кормления, вакцинопрофилактика занимает ведущее место (Melamed D., Leitner G. and Heller E.D., 1991; Бурдейный B.B., 1998; Садовников H.B., 1995; Бакулин В.А., 2006; Джавадов Э.Д., 2007).
Считается, -что безопасность инактивированных вакцин достаточно гарантирована. Однако при их парентеральном применении возможно появление общей и местной воспалительной реакции на месте введения с последующим развитием локальных абсцессов и гранулем, гиперсенсибилизация организма и активация аутоиммунных процессов (Медуницин Н.В., 1999; Староверов С.А. и др., 2003; Edelman R., 1980; Vanselow В.А., 1987).
Поэтому не случаен поиск новых способов решения проблем иммунизации птиц, улучшения способа доставки антигена. Актуальной также остается разработка оптимальных лекарственных форм, позволяющих полностью снять негативные эффекты, наблюдаемые после введения препаратов.
Одним из возможных направлений решения данного вопроса является конструирование лекарственных форм вакцин на основе наночастиц, среди которых особое место занимают липосомы (Каплун А.П. и др., 1999).
Многочисленные клинические испытания липосомальных препаратов ; показали их безопасность для организма животных и человека.
Целью наших исследований являлась разработка инактивированной липосомальной вакцины против колибактериоза птицы. Задачи:
-разработать режим инактивации Escherichia coli, используя аминоэтилэтиленимин;
-изготовить экспериментальные образцы инактивированной липосомальной вакцины против колибактериоза птицы;
-сравнить биологические характеристики инактивированной липосомальной вакцины и гидроокись алюминиевой формолвакцины против колибактериоза птицы;
-определить иммунизирующую дозу, напряжённость и продолжительность иммунитета после применения вакцины на цыплятах; -определить влияние инактивированнои липосомальной вакцины против колибактериоза птицы на уровень общего белка и белковых фракций сыворотки крови иммунизированных цыплят.
Научная новизна работы. В результате проведённых исследований нами впервые:
-разработана технология изготовления инактивированной липосомальной вакцины против колибактериоза птицы;
-определены оптимальные параметры и режим инактивации Escherichia coli аминоэтилэтиленимином;
-установлена высокая антигенная и иммуногенная активность инактивированной липосомальной вакцины против колибактериоза птицы;
-определены иммунобиохимические характеристики крови цыплят при применении инактивированной липосомальной вакцины против колибактериоза птицы.
Практическая значимость работы.
На основании полученных результатов разработана нормативно-техническая документация по изготовлению и контролю инактивированнои липосомальной вакцины против колибактериоза птицы.
Апробация работы. Основные материалы исследований по диссертационной работе доложены и обсуждены на:
• Всероссийской научно-практической конференции "Ветеринарная медицина - теория, практика и обучение" (Санкт-Петербург, 2006, 2007);
• Научно-практической конференции "Болезни птиц в промышленном птицеводстве. Современное состояние проблемы и стратегия борьбы" (Санкт-Петербург, 2007);
• Международном научно-практическом конгрессе "Актуальные проблемы ветеринарной медицины" выставки "Ветеринария. Зоотехния. Комбикорма" (Санкт-Петербург, 2007). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Способ инактивации Escherichia coli аминоэтилэтиленимином.
2. Использование липосом при конструировании вакцины против колибактериоза птицы.
3. Влияние инактивированной липосомальной вакцины против колибактериоза на имму но биохимические характеристики крови цыплят.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 132 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты исследований, обсуждение, выводы, практические предложения, приложение. Список использованных литературных источников включает 224 наименования, в том числе 100 работ зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 7 рисунками и 12 таблицами. В приложении представлены копии титульных листов документов, подтверждающих результаты отдельных этапов работы, их научную новизну и практическую значимость.
Автор благодарит сотрудников кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии и кафедры биологической химии ФГОУ ВПО "Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины" за помощь в выполнении данной работы.
Иммунная система птицы
Рост и развитие птицы происходят в определённых условиях окружающей среды, при этом особую значимость приобретает резистентность организма.
Под резистентностью понимают совокупность механизмов защиты организма, включая конституционный иммунитет, устойчивость к воздействию стресс-факторов (Болотников И.А., Румянцев С.Н., 1991). Резистентность может быть естественной и приобретённой. Её механизмы можно подразделить соответственно на естественные и приобретённые, составляющие в целом клеточные и гуморальные элементы (Левин М.Я. и др., 1996; Софронов Б.Н. и др., 1997).
Понятие иммунитета сегодня рассматривается как состояние устойчивости организма к заразному началу (микробы, вирусы, простейшие, токсины) и другим генетически чужеродным соединениям (Хаитов P.M., 1988). Иммунитет поддерживает гомеостаз или генетическую индивидуальность организма, благодаря клеточным и гуморальным факторам, эволюционно сформировавшимся на данном этапе развития вида (Фёдоров Ю.Н., 1984).
Рост и иммунный ответ являются комплексными процессами, направляемыми генетическим кодом птицы. Взаимосвязи между ростом организма и иммунным ответом не являются независимыми от генетической основы организма или внешней среды (Nir J. et al., 1996). Имеет место определённая последовательность и синхронность роста, начиная с развития нервной системы, развития костной, мышечной и жировой ткани. Рост является динамичным усилием в случае, когда отложение веществ в организме превосходит их использование (Siegel Р.В., Dunnington Е.А., 1998; Соколова Л.Н. и др., 2005). Иммунный ответ можно рассматривать как меру энергии, с которой организм реагирует на чужеродный агент. Подобно росту птицы, иммунный ответ является динамичным с механизмами, вовлекающими генетические и не генетические факторы (Eerola Е. et al., 1998).
Защита организма птицы осуществляется против поступающих извне чужеродных агентов как неспецифическими (древними) механизмами (фагоцитоз), так и антигеноспецифическими факторами. Вся совокупность реакций организма, возникающая в результате взаимодействия клеток его иммунной системы с антигеном, является иммунным ответом. Иммунный ответ определяется иммунологической реактивностью, которая зависит от различных факторов, включая фактор кормления (Бочкарёв В.Н., 1992; Холод В.М., Курдеко А.П., 2005). Однако не меньшее значение иммунная система проявляется в защите организма от внутренней агрессии (Abbas А.К. et al., 1994).
К центральным органам иммунитета птицы относятся эмбриональный желточный мешок, костный мозг, тимус, фабрициева сумка (бурса). Желточный мешок является главным кроветворным органом эмбриона птицы. В течение первого триместра эмбрионального развития происходит формирование самого желточного мешка, внутри которого оказывается желточная масса, являющаяся энергетическим материалом. После 12 суток инкубации желточная масса мешка уменьшается, а перед вылуплением желточный мешок втягивается в брюшную полость с последующим полным его рассасыванием (Болотников И.А., Конопатов Ю.В., 1993).
Тимус в эмбриональный период закладывается как парный орган, который достигает своего максимального развития к 3,5 - 4 месяцам, а затем постепенно атрофируется по мере достижения полового созревания птицы (Kendall M.D., 1980).
У зародыша стволовые клетки мигрируют из желточного мешка через селезёнку в костный мозг, где они подвергаются мультипликации, образуя разнообразные клетки крови. Клетки, которые позднее станут лимфоцитами, в дальнейшем дифференцируются вне костного мозга, проходя через тимус и превращаются в Т-лимфоциты. В тимусе лимфоциты обнаруживаются спустя 10 суток инкубации и позднее. Тимус цыплят в эмбриональный и ранний постэмбриональный период лишен В-лимфоцитов, но, начиная с 9-недельного возраста, в нём обнаруживаются иммуноглобулинположительные лимфоциты, а значит, популяция тимоцитов становится гетерогенной (Potworowski Е., 1972).
Стволовые клетки, мигрирующие в фабрициеву сумку, превращаются в В-лимфоциты, и при стимуляции антигеном они начинают активно делиться, трансформируясь в плазматические клетки, выделяющих значительные количества защитных антител (Болотников И.А., 1989).
Фабрициева сумка располагается на дорсальной поверхности клоаки. Её закладка начинается из эндодермы на 5 день эмбрионального развития. Окончательно бурса формируется на 12 сутки эмбрионального развития. В . постнатальном онтогенезе бурса достигает максимального развития с 4,5 до 12 недель, а затем она подвергается инволюции.
Инволюция- фабрициевой сумки и тимуса сопряжена со снижением пролиферативных процессов, с угнетением синтеза иммуноглобулинов, поэтому рациональное и полноценное кормление в этом случае является крайне важным для поддержания нормального течения эмбриональных процессов в этих органах (Болотников И.А., Конопатов Ю.В., 1993).
Получение биомассы Escherichia coli при конструировании вакцины
Первый этап нашей работы был посвящен изучению биологических свойств контрольно-производственных штаммов кишечной палочки. Морфологические и тинкториальные свойства кишечных палочек определяли с помощью микроскопии мазков, окрашенных по Граму и электронной микроскопии. Мазки приготавливали как из первичного материала (мазки-отпечатки из органов), так и из культуры эшерихий на МПА, МПБ, среде Эндо и Левина.
Подвижность определяли методом висячей или раздавленной капли с использованием фазово-контрастного микроскопа, а также при посеве уколом в полужидкий 0,3% МПА. Выделенные культуры представляли собой грамотрицательные полиморфные палочки. В мазках-отпечатках, приготовленных из внутренних органов, костного и головного мозга павших птиц, наблюдали биполярность при окраске по Граму.
На МПБ посевы инкубировали при температуре 37С до 72 часов. Через 18-24 часа культивирования наблюдали диффузный рост с образованием аморфного осадка серо-белого цвета, легко разбивающегося при встряхивании. На поверхности бульона наблюдали наличие нежной, сетчатой плёнки или пристеночного кольца. Через 48-72 часа отмечали просветление МПБ с образованием беловатого осадка, который легко разбивался при встряхивании. На МПА через 24 часа инкубирования вырастали мелкие и средние по величине (1-4 мм в диаметре), круглые, сочные колонии, с ровными краями, приподнятые в центре. На среде Эндо наблюдали образование тёмно-вишнёвых с металлическим оттенком, плосковыпуклых, с ровными краями сочных колоний.
На среде Левина культуры образовывали колонии тёмно-фиолетового цвета, по форме, величине и другим признакам сходные с таковыми, полученными на МПА. На среде Плоскирева - колонии розовато-сиреневого цвета. На кровяном агаре наблюдали зоны гемолиза вокруг колоний эшерихий.
Показателями биохимической активности кишечной палочки являются прежде всего: ферментативная активность в отношении углеводов и многоатомных спиртов, образование индола и сероводорода, протеолитические свойства, рост на цитратно-аммонийной среде Симмонса и среде с мочевиной, а также характер реакций Фогес-Проскауэра и с метилротом.
Сахаролитическую активность выделенных культур определяли по росту на жидких средах Гиса с добавлением 0,2 - 0,3 % агар-агара. Среды Гисса содержали соответствующие углеводы и спирты: глюкозу, лактозу, сахарозу, мальтозу, маннит, инозит, сорбит, арабинозу, рамнозу, дульцит. Учёт роста и изменение среды производили через 24-48 и 72 часа. Учитывали способность ферментировать сахара по интенсивности образования кислоты и газа.
Способность к индолообразованию у изучаемых культур кишечной палочки, определяли с помощью реактива Эрлиха и эфира, а также при помощи фильтровальной бумажки, пропитанной насыщенным водным раствором щавелевой кислоты по общепринятой методике.
На железо-сахарной среде при положительной реакции на сероводород происходило окрашивание нижней части столбика среды в чёрный цвет.
Для определения протеолитических свойств эшерихий, производили посев культур по уколу в столбик желатины. Штамм E.coli ферментировал с образованием кислоты и газа: глюкозу, лактозу, манит, арабинозу, сорбит, ксилозу, образовывал индол, утилизировал ацетат, давал положительную реакцию с метиловым красным. Не ферментировал инозит и адонит, не образовывал цитрат и малонат, не имел уреазы, желатиназы, давал отрицательную реакцию Фогеса-Проскауэра.
Оценка иммуногенных свойств вакцины
Контроль иммуногенной активности инактивированной липосомальной вакцины против колибактериоза птицы проводили качественным методом на цыплятах и белых мышах. Иммунизировали цыплят 28-суточного возраста внутримышечно в грудную мышцу из расчёта 0,5 мл инактивированной липосомальной вакцины против колибактериоза птицы на цыплёнка внутримышечно с внутренней поверхности бедра в объеме 0,2 см .
Наблюдение за иммунизированными цыплятами вели также в течение 3 месяцев.
По результатам опыта вакцинированные цыплята до 75 дней после вакцинации были устойчивы к заражению патогенным штаммом, использованным для изготовления вакцины. Начиная с 85 дня после иммунизации, часть птиц начинала терять устойчивость к заражению 2DLm.
Все цыплята контрольной, не иммунизированной группы, пали при заражении 2DLm.
Коэффициент иммунологической эффективности инактивированной липосомальной вакцины против колибактериоза птицы при внутримышечном способе вакцинации цыплят в лабораторных условиях спустя 12, 30, 45,65 дней после вакцинации составлял 100 %, 75 дней - 85 % и через 90 дней 45 % (таблица 7).
Для белых мышей коэффициент иммунологической эффективности был соответственно через 12, 30, 45, 65 дней - 100 %, через 75 дней - 85 % и через 90 дней 35 %.
От всех павших после заражения патогенным штаммом животных была выделена исходная культура кишечной палочки.
Для определения индекса защиты, мышей иммунизировали в объёме по 0,2 см3 вакцины. На 21 сутки после иммунизации всех мышей заражали последовательными десятикратными разведениями штамма Escherichia coli №389 (078) в объеме 0,3 см , подкожно в область спины. Для заражения использовали пять разведений (10"5 - 10"9). Каждым разведением заражали 5 иммунизированных и 5 контрольных животных. Результаты учитывали ежедневно в течение десяти суток после заражения, отмечая количество павших мышей в каждой группе. Затем определяли значение LD5o для вакцинированных и не вакцинированных животных.
Расчет LD5o проводили по формуле Кербера в модификации Ашмарина И. П.. Антигены Escherichia coli с достаточным уровнем иммуногенности должны иметь Lg индекса защиты не менее 0,8. В таблицах 8, 9 представлены результаты оценки и примеры расчета индекса защиты.
