Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1. Ньюкаслская и инфекционная бурсальная болезни птиц 10
1.1.1. Ньюкаслская болезнь птиц 10
1.1.2. Инфекционная бурсальная болезнь 17
1.2. Иммуномодуляторы 23
1.2.1. История, терминология и классификация 23
1.2.2. Краткая характеристика и механизм действия пептидных иммуномодуляторов 25
1.2.3. Тимические иммуномодуляторы 27
1.2.4. Области перспективного использования иммуномодуляторов в ветеринарии 29
1.2.4.1. Применение тимических иммуномодуляторов в птицеводстве 32
1.3. Заключение по обзору литературы 36
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 38
2.1. Материалы и методы 38
2.2. Результаты собственных исследований 40
2.2.1. Оценка эффективности вакцин против ньюкаслской и инфекционной бурсальной болезней 40
2.2.1.1. Динамика гуморального ответа при одно- и двукратной вакцинациях против инфекционной бурсальной болезни 47
2.2.1.2. Динамика антителогенеза при одно- и двукратной вакцинации против инфекционной бурсальной болезни на фоне иммуностимуляции тимогеном 50
2.2.1.3. Определение оптимальной схемы иммунокоррекции тимогеном при вакцинации цыплят в системе «ИББ+НБ» 55
2.2.2. Результаты сочетанного применения бестима с вакциной против ньюкаслской болезни из штамма «Ла-Сота» 66
2.2.2.1. Определение оптимальных доз бестима 66
2.2.2.2. Влияние прививочного объема композиционной смеси «вакцина против ньюкаслской болезни + бестим» на эффективность иммунокоррекции 72
2.2.2.3. Определение оптимальных сроков первого входа с вакциной против ньюкаслской болезни на фоне иммуностимуляции бестимом 74
2.2.2.4. Влияние сочетанного применения бестима и вакцины против ньюкаслской болезни на показатели естественной резистентности и специфической устойчивости у цыплят 77
2.2.2.4.1. Динамика гематологических показателей 77
2.2.2.4.2. Динамика Т-лимфоцитов и их субпопуляций 82
2.2.2.4.3. Фагоцитарная активность псевдоэозинофилов 87
2.2.2.4.4. Тест восстановления нитросинего тетразолия 90
2.2.2.5. Динамика антителогенеза против ньюкаслской болезни за весь период производственного использования птицы на фоне иммуностимуляции бестимом и тимогеном 93
2.2.3. Экономическое обоснование полученных результатов 103
ОБСУЖДЕНИЕ 105
ВЫВОДЫ 117
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 119
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 120
ПРИЛОЖЕНИЕ 164
Введение к работе
Актуальность темы. Ньюкаслская и инфекционная бурсальная болезни, одни из наиболее распространенных инфекций, во многом определяют эпизоотическое и экономическое благополучие птицеводческих хозяйств промышленного типа [43,72,97].
Ведущая роль в комплексе противоэпизоотических мероприятий при них принадлежит специфической профилактике, основанной на применении живых и инактивированных вакцин [3, 13, 72, 121 122, 235, 289]. Однако вакцинация не всегда приводит к выработке напряженного иммунитета, особенно у молодняка [13,17, 26, 72, 230, 233].
В некоторых случаях иммунизация не способствует выработке полноценной защиты от возбудителей ньюкаслской и инфекционной бурсальной болезней, чаще у цыплят, что обусловлено у них высоким уровнем трансовариальных антител, воздействием разнообразных стресс-факторов и, как следствие, развитием иммунодефицитных состояний [24, 95, 121, 2Ер]авнительно новым направлением специфической профилактики инфекционных болезней является использование вакцин с иммуномодулятора-ми [54, 77, 88, 205, 221, 266, 229]. Из них наиболее перспективны синтетические дипептиды, в частности тимоген [227], обладающие двумя важными фармакологическими эффектами: эффектом малых доз и эффектом иммуно-модулирующего действия. В цикле работ, выполненных В.В. Бурдейным, В.Б. Комиссаровым, М.С. Трескиным [49, 50, 53, 139, 143, 248] показана возможность его применения в ультрамалых дозах для стимуляции антителоге-неза у 18-55-дневных цыплят против ньюкаслской болезни. Наряду с этим остался открытым вопрос о возможности использования препарата для усиления иммунного ответа при вакцинации против других болезней, в частности, против инфекционной бурсальной болезни, о существовании обратной связи влияния иммунокоррекции прививок против нее на выработку иммунитета против ньюкаслской болезни и наоборот. Актуальным является также
7 поиск и возможность внедрения в практику птицеводства других препаратов из данной группы.
В последние годы появились сообщения об успешном применении в области медицины близкого по структурной организации препарата — бестима [58,137,198]. Сведения о его применении в области ветеринарии отсутствуют.
В связи с этим разработка новых схем и средств повышения эффективности специфической профилактики ньюкаслской и инфекционной бурсаль-ной болезней птиц является актуальной проблемой и требует дальнейшего решения.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось обоснование возможности применения препаратов из группы синтетических дипеп-тидов — тимогена и бестима для повышения эффективности специфической профилактики ньюкаслской и инфекционной бурсальной болезней птиц при различных схемах их применения. В соответствии с этим в задачи исследования входило:
Определить возможность применения тимогена в малых дозах для повышения иммуногенности вакцины против инфекционной бурсальной болезни;
Определить совместимость прививок при вакцинации птиц против ньюкаслской и инфекционной бурсальной болезней на фоне иммунокоррек-ции тимогеном;
Определить возможность применения бестима в малых дозах для повышения иммуногенности вакцины против ньюкаслской болезни из штамма «Ла-Сота»;
Изучить динамику гематологических и иммунологических параметров при вакцинации цыплят против ньюкаслской болезни на фоне иммуно-стимуляции бестимом;
5. Испытать и дать сравнительную оценку схемам сочетанного применения тимогена и бестима с вакциной против ньюкаслской болезни в условиях птицеводческого хозяйства.
Научная новизна. Впервые определены схемы применения тимогена для повышения антителогенеза при вакцинации цыплят против инфекционной бурсальной болезни, способствующие повышению интенсивности выработки антител.
Выявлено, что применение тимогена на фоне вакцинации против ньюкаслской или инфекционной бурсальной болезни усиливает выработку антител против обоих вирусов.
Впервые отработаны дозы, кратность применения бестима при вакцинации птиц против ньюкаслской болезни, что способствует повышению напряженности иммунитета.
Практическая значимость работы. Разработана и внедрена схема применения тимогена в системе специфической профилактики инфекционной бурсальной болезни, позволяющая сократить число прививок птицы вакциной из штамма «БГ» с двух до одной. Определен наиболее рациональный способ повышения эффективности вакцинации цыплят против ньюкаслской и инфекционной бурсальной болезней. Разработанные схемы применения тимогена и бестима в системе специфической профилактики ньюкаслской болезни позволяют использовать препараты в зависимости от эпизоотической обстановки в хозяйствах на разных этапах производственного использования птицы. Данные, полученные при выполнении диссертационной работы, используют ветеринарные специалисты ЗАО «Галичское» по птицеводству Костромской области, в учебном процессе в ФГОУ ВПО Костромская ГСХА.
По результатам исследований составлено «Временное наставление по применению тимогена для повышения эффективности специфической профилактики инфекционной бурсальной и ньюкаслской болезней кур», рассмотренное и одобренное на секции ветеринарной медицины и зоотехнии на-
9 учно-технического совета (протокол №2 от 19.10.2006г), ученом совете вуза (протокол №8 от 20.10.2006 г) и утвержденное ректором ФГОУ ВПО Костромская КСХА 23.11.2006 г.
Апробация работы. Материалы доложены и получили положительную оценку на 56- и 57-й Международных научно-практических конференциях «Актуальные проблемы науки в агропромышленном комплексе» (г Кострома, 2005-2006 гг), Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы и перспективы развития агропромышленного комплекса» (г. Иваново, 2005), межкафедральном заседании факультета ветеринарной медицины и зоотехнии ФГОУ ВПО «Костромская ГСХА» (2006 г.).
Основные положения выносимые на защиту диссертации.
Влияние тимогена на антителогенез при различных схемах вакцинации птицы против инфекционной бурсальной болезни.
Совместимость прививок при вакцинации птиц против ньюкаслской и инфекционной бурсальной болезней на фоне иммунокоррекции тимогеном
Сочетанное применение бестима с вакциной против ньюкаслской болезни и динамика гематологических и иммунологических показателей у цыплят.
Сравнительная эффективность сочетанного применения тимогена и бестима с вакциной против ньюкаслской болезни птиц
Публикация результатов исследования. Основные положения изложены в 12 работах, в том числе 1 работа в издании, регламентированном ВАК РФ для докторских и кандидатских диссертаций.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 166 страницах компьютерного текста, включает 30 таблиц, 19 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, предложений, списка литературы и приложения. Список литературы включает 349 наименований, в том числе 286 работ отечественных и 63 иностранных авторов.
Ньюкаслская и инфекционная бурсальная болезни птиц
Ньюкаслская болезнь (псевдочума, азиатская чума, атипичная чума, болезнь Раникхтет, болезнь Филарет, авиан пневмоэнцефалит) — высококонтагиозная вирусная инфекция птиц, характеризующаяся пневмонией, энцефалитом, множественными точечными кровоизлияниями и поражением внутренних органов [26, 231, 226, 289]. Наиболее чувствительны к заражению куры всех возрастов, индейки, цесарки. Водоплавающая птицы и голуби практически не болеют или переболевают легко, но могут быть носителями вируса. Зарегистрирована на всех континентах, относится к особо опасным болезням списка «А» и наносит огромный экономический ущерб [85, 234, 310].
По данным Департамента ветеринарии и животноводства МСХ РФ за 1-е полугодие 2006 г. НБ вошла в число заразных болезней птиц, проявивших тенденцию к распространению. Ее удельный вес в показателе отхода птицы по причине инфекционной патологии за этот период составил 3,21% [209].
Возбудитель НБ является представителем семейства парамиксовирусов и относится к серотипу, обозначенному как PMV 1 (всего 9 серотипов) [233]. Выделенные штаммы вируса различаются по вирулентности, но сохраняют антигенное родство. Это в значительной степени определяет успех в серодиагностике [121] и специфической профилактики данной болезни. По вирулентности различают штаммы вирусов: велогенные (высоковирулентные), мезогенные (с остаточной вирулентностью) и лентогенные (авирулентные) [87,240], что соответствует наименованиям форм клинического проявления болезни с добавлением четвертой — бессимптомной (без клинических признаков, определяемой серологически или выделением вируса) [157]. Лентогенные и мезогенные варианты вируса НБ послужили основой для создания различных видов вакцин, перечень которых весьма широк — Н, В, F, Roacin, Бургас и др. [46,337,338]. В нашей стране используют вакцины, созданные на основе наиболее распространенных в мировой практике лентогенных штаммов «Ла-Сота», Вь а также штаммов отечественного происхождения — Бор-74 ВГНКИ и ГАМ-61 (мезогенный вариант) [40, 70, 96, 105, 181, 212]. В настоящее время из-за возможности вертикальной передачи возбудителей болезни через яйцо, наработка биомассы вакцинного вируса НБ осуществляют на SPF-RE — КЭ, свободных от патогенных микроорганизмов [329].
Вакцинация является основой противоэпизоотических мероприятий против НБ. Она базируется на использовании живых и инактивированных вакцин, каждая их которых имеет свои достоинства и недостатки.
Живые вакцины быстрее индуцируют иммунитет в сравнении с инак-тивированными, стимулируют все системы иммунитета и обеспечивают развитие у птиц местного иммунитета, относительно недороги и легко применяемы при массовых вакцинациях различными методами (интраназально, окулярно, энтерально, аэрозольно, методом спрея и др.). Вакцинные вирусы могут распространяться от птиц, которые удачно привиты, на тех, которые не иммунизированы [72,120,133, 226].
Живые вакцины готовят из лентогенных штаммов вируса (Ла Сота, В1, Бор-74, Клон 30 и др.), которые лишь при определенных условиях могут вызвать у цыплят слабое субклиническое переболевание, а также из мезогенных штаммов вируса (Н и др.), иногда способных провоцировать респираторный синдром, параличи, парезы и даже гибель цыплят до 30-60-дн возраста и снижение продуктивности взрослых птиц [26].
Степень напряженности иммунитета при их использовании прямо пропорциональна степени «вирулентности» вакцинного штамма и зависит от стандартности выпускаемых препаратов, соблюдения дозировки и техники вакцинации, возраста и физиологического состояния птицы. В ряде случаев трансовариальные антитела могут свести на нет успех первой вакцинации живыми вакцинами. При некачественно проведенной иммунизации ленто-генные, в том числе вакцинные штаммы вируса НБ способны участвовать в этиологическом комплексе, вызывающем хроническую респираторную болезнь [7, 119, 173, 285]. Даже «мягкие» штаммы, как Вь могут вызывать легкие клинические признаки и даже более серьезные, если они осложнены наличием других микроорганизмов или существуют проблемы с содержанием птицы. Поствакцинальные реакции могут зависеть от метода применения и силы иммунного ответа, и эти две величины могут иметь обратную зависимость [210, 233]. Соблюдение этих условий для эффективной иммунизации нередко нивелирует явные преимущества в материальных и трудовых затратах на проведение иммунопрофилактики традиционными приемами [95].
Иммуномодуляторы
Общим свойством ИМ является специфичность — тропность к иммунной системе и преимущественное или селективное действие на иммунную систему [179,256].
Следует отметить, что во многих публикациях к ИМ необоснованно относят различные биологические добавки - витамины, эубиотики, ферментные препараты, пищевые добавки, цитостатики, различные воздействия -ионизирующее излучение и т.д. [266]. Данные препараты не могут быть классифицированы как ИМ, так как не отвечают основному критерию принципу специфичности (тропизм к иммунной системе и в той или иной степени воздействия на нее). Их следует рассматривать как препараты неспецифического действия на иммунную систему, которые стимулируют или угнетают ее количественные или функциональные параметры.
В истории использования иммуностимулирующих препаратов выделяют два этапа [279], первый из которых характеризуется применением одновременно оказывающих действие на различные популяции Т- и В-лимфоцитов, антигенпредставляющих клеток, стимулирующих клеточный и гуморальный иммунный ответ, второй основан на поиске и создании средств, которые селективно влияли на дифференцировку и функциональную активность популяций и субпопуляций лимфоидных клеток, моноцитов/макрофагов.
Предприняты попытки разделить их по механизму действия, по природе и происхождению, по вектору (направлению) действия на иммунную систему, способам получения и т.д. [66].
P.M. Хаитов, Б.В. Пинегин [262, 263] все иммунотропные препараты делят на три основные группы: иммуномодуляторы (ИМ) — средства, восстанавливающие нарушенные функции иммунной системы; иммуностимуляторы (ИС) — средства, усиливающие иммунный ответ; иммунодепрессанты - средства, подавляющие иммунный ответ.
Предложенная классификация послужила основанием для их распределения по группам, используя в качестве критерия различные показатели: механизм действия, природу происхождения, направление действия (вектор) на иммунную систему, способ получения и др. [66].
Так, J.W. Hadden [305], Б.В. Пинегин [200] предлагают ИМ разделить на экзогенные, эндогенные, синтетические или химические чистые; В.М. Манько и соавт. [170] — только на эндогенные и экзогенные; Ф.И. Ершов [103]— на группу цитокинов, экзогенные природные, экзогенные синтетические; Ю.Н. Федоров [256, 257] — на иммуноактивные компоненты поверхностных структур патогенов, тимические гормоны, костномозговые регуляторы — миелопептиды или их аналоги, полиэлектролиты, цитокины, нуклеиновые кислоты; А.Ф. Лебедев и соавт. [160] — на тканевые препараты (белки сыворотки крови, препараты тимуса, интерфероны, липиды и др.), препараты микробного происхождения, синтетические.
Хотя механизм действия представителей вышеуказанных групп могут различаться, и зачастую не совсем понятны, в основном, они направлены на антигенпредставляющие клетки (макрофаги, дендритные клетки), распознающие (Т-лимфоциты), эффекторные (нейтрофильные фагоциты, моноциты/макрофаги, естественные киллеры, цитотоксические Т-лимфоциты, а также на активацию гуморальных факторов иммунной системы - комплемента, пропердина, лизоцима, бета-лизинов, интерферона [160,256].
Для максимального приближения обзора литературы к целям диссертации мы посчитали рациональным более подробно остановиться на характеристике пептидных ИМ, в частности тимического происхождения, и на препаратах, используемых в ветеринарии для повышения иммунного ответа на вакцинацию различного вида животных и птиц.
Материалы и методы
Работа выполнена на кафедре эпизоотологии, микробиологии и вирусологии ФГОУ ВПО Костромская ГСХА в 1999-2006 гг. Научно-производственные опыты проведены на базе ЗАО «Галичское» по птицеводству Костромской области в течение 2000-2006 гг.
В связи с многоплановостью исследований в диссертации нашли отражение результаты работ, проведенных совместно с сотрудниками кафедры эпизоотологии, микробиологии и вирусологии ФГОУ ВПО Костромская ГСХА, за что автор выражает глубокую благодарность.
Объектом исследования служили куры яичного кросса «Хайсекс белый» и «Хайсекс коричневый» с суточного возраста до конца хозяйственного использования. Птицу контрольных и опытных групп содержали в одинаковых условиях в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя кросса.
В качестве иммуномодуляторов использовали тимоген и бестим. Тимоген (а-Ь-глутамин-Ь-триптофан) — белый (с желтоватым оттенком) порошок, синтетический дипептид, состоящий из остатков аминокислот — глутамина и триптофана, по структуре и биологической активности идентичный активному центру тималина — нативного препарата тимуса. Выпускают в виде стерильного лиофилизированного порошка или пористой массы по 100 мкг в стеклянных флаконах или 0,01 % раствора во флаконах по 5, 50 и 100 см и ампулах по 1 см . Хранят по списку Б в защищенном от света месте при температуре не выше +20С. Производитель — ЗАО «Пептос» (г. Москва).
Бестим (у-О-глутамин-Ь-триптофан) — синтетический дипептид, отличающийся от тимогена пептидной связью. Синтезирован в лаборатории НИИ особо чистых биопрепаратов (Санкт-Петербург). Производитель НПФ «Вер-та». В наших опытах использован под условным названием «ИС-14».
Для изучения иммуностимулирующего действия препаратов использовали коммерческие серии вакцин против НБ из штамма «Ла-Сота» и ИББ из штамма «БГ» производства ФГУ ВНИИЗЖ (г. Владимир).
Исследования включали несколько этапов: первый — изучение влияния тимогена на иммунный ответ при специфической профилактике инфекционной бурсальной болезни, определение наиболее рационального метода специфической профилактики ИББ путем одно- или двукратной прививки, а также определение совместимости прививок при вакцинации цыплят против НБ и ИББ на фоне иммунокоррекции тимогеном; второй — изучение действия бестима при использовании в системе специфической вакцинопрофилактики НБ и влияние его на гематологические и иммунологические показатели птиц; третий — на модели НБ в сравнении с тимогеном определение: эффективности вакцинации цыплят в зависимости от прививочного объема; оптимального срока первого входа с вакциной против НБ; эффективности различных схем сочетанных обработок птицы в зависимости от кратности и доз им-муномодулятора (ИМ).
Уровень и динамику накопления специфических антител определяли в РТГА, РДП и ИФА, которые ставили в соответствии с общепринятыми методиками. Исследования проводили в производственной лаборатории ЗАО «Га-личское» по птицеводству и в ФГУ ВНИИЗЖ (г. Владимир).
Кровь для морфологических и серологических исследований получали из крыловой вены и методом тотального обескровливания (у цыплят до 18-дн возраста) в пробирки с гепарином из расчета 20-25 МЕ/смЗ. Лимфоциты выделяли путем центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографина.
Количество эритроцитов, лейкоцитов, лейкоформулу определяли общепринятыми методами [86,146,131].
Количество Т-лимфоцитов определяли методом спонтанного розеткооб-разования с эритроцитами барана по М. Jondal et al. [316, 317], теофиллинчув-ствительных и теофиллинрезистентных — по В. Shonat, Н. Toshua [344] в модификации М.С. Трескина [250].
Фагоцитарную активность (ФА) псевдоэозинофилов оценивали по их способности поглощать инертные частицы латексов размером 1,5 мкм, производства ВНИИ биологического приборостроения (г. Москва) по Р.В. Петрову и соавт. [194]. Кроме того определяли фагоцитарный индекс (ФИ), фагоцитарное число (ФЧ) и фагоцитарную емкость (ФЕ) по В.М. Митюшникову [178], кислородозависимую бактерицидную активность псевдоэозинофилов в реакции восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест) по А.Н. Маянскому, О.И. Пикуза [174], Р.В. Петрову и соавт. [194].
Подробные схемы проведения опытов изложены в каждом разделе работы при изучении конкретно поставленных задач.
В экспериментах использовано 45277 цыплят, проведено 1020 серологических исследований по определению титров антител и напряженности иммунитета, 180 по определению иммунологических и гематологических показателей. Производственный опыт по сравнительной оценке иммуностимулирующих свойств бестима и тимогена в сочетании с вакциной против НБ продолжительностью 17 мес выполнен на 24 тыс голов птицы. За указанный период проведено 2280 исследований сывороток крови в РТГА.
