Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы
1.1. Систематика семейства Enterobacteriaceae 6
1.2. Факторы патогенности и генетический контроль синтеза энтеротоксинов 7
1.3. Классификация и молекулярная организация энтеротоксинов 9
1.4. Механизм действия энтеротоксинов 13
1.5. Методы детекции токсигенной микрофлоры 14
1.5.1. Методы биологического тестирования энтеротоксинов 14
1.5.2. Иммунологические методы детекции энтеротоксинов 17
1.5.3. ДНК-ДНК гибридизация 20
1.5.3.1. Принцип метода гибридизации. Методы гибридизации 21
1.5.3.2. Гибридизационные ДНК-зонды 23
1.5.3.3. Введение метки в нуклеиновые кислоты 28
1.5.3.4. Способы введения метки в ДНК-зонды 32
1.5.4. Полимеразная цепная реакция 34
1.5.4.1. Принцип метода ПЦР 34
1.5.4.2. Этапы полимеразной цепной реакции 36
1.5.4.3. Компоненты реакционной смеси ПЦР 37
1.5.4.4. Условия проведения ПЦР .; 39
1.5.4.5. Детекция результатов ПЦР 41
1.5.4.6. Интерпретация результатов ПЦР 42
1.5.4.7. Способы повышения чувствительности ПЦР 43
1.5.4.8. Достоинства метода ПЦР 47
1.5.4.9. Практическое применение ПЦР при диагностике токсикоинфекций 48 Собственные исследования
2. Материалы и методы 51
2.1. Оборудование 51
2.2. Использованные реактивы 51
2.3. Буферные растворы 51
2.4. Штаммы и плазмиды 52
2.5. Питательные среды 52
2.6. Определение биохимических свойств культур 53
2.7. Получение биомассы 53
2.8. Выделение плазмидной ДНК 53
2.9. Очистка плазмидной ДНК 54
2.10. Электрофорез ДНК 54
2.11. Расщепление плазмидной ДНК эндонуклеазами рестрикции 54
2.12. Извлечение ДНК из легкоплавкой агарозы 55
2.13. Вьщеление ДНК из агарозных гелей с использованием сорбента GlassMilk . 56
2.14. Генетическая трансформация E.coli 56
2.15. Введение биотиновой метки в препараты ДНК 57
2.16. ДНК-ДНК гибридизация с биотинилированными зондами 58
2.17. Детекция результатов гибридизации 58
2.18. Полимеразная цепная реакция 59
2.19. Подбор оптимальных условий проведения ПЦР 59
3. Результаты исследований .- 61
3.1. Вьщеление штаммов энтеробактерий, контамиїшруїощих кормосмеси для норок 61
3.2. Изучение биохимических свойств штаммов и их идентификация 63
3.3. Определение патогенности изолированных штаммов 69
3.3.1. Биологические методы тестирования 69
3.3.1.1. Изучение патогенных свойств подкожным введением 69
3.3.1.2. Определение наличия токсинообразования 69
3.3.1.2.1. Определение наличия термостабилыюго токсина ST 69
3.3.1.2.2. Определение наличия термолабилыюго энтеротоксина LT 71
3.3.2. Молекулярно-генетические методы тестирования 73
3.3.2.1. Конструирование диагностических ДНК-зондов 73
3.3.2.1.1. Получение зондов на гены отдельных субъединиц термолабильного токсина 73
3.3.2.1.2. Биотинилирование зондов и определение включения метки 77
3.3.2.1.3. Получение зонда на ПОЛНИ размерный LT-оперон 80
3.3.2.2. Анализ штаммов на наличие генов токсинообразования 84
3.3.2.2.1. Оптимизация условий гибридизации 84
3.3.2.2.2. Изучение распространения генов токсинообразования методом ДНК-ДНК гибридизации 86
3.3.2.2.3. Определение генов шига-подобных токсинов SLTI и SLTII методом гибридизации с радиоактивным зондом 89
3.3.2.3. Разработка метода полимеразной цепной реакции для детекции генов токсинообразования у энтеробактерий 91
3.3.2.3.1. Анализ первичных последовательностей и подбор праймеров 91
3.3.2.3.2. Оптимизация условий проведения полимеразной цепной реакции 92
3.3.2.3.3. Изучение распространения генов токсинообразования методом ПЦР 93
4. Обсуждение результатов 102
5. Выводы 116
6. Сведения о практическом использовании результатов 117
7. Список литературы 118
'8. Приложения 138
- Полимеразная цепная реакция
- Расщепление плазмидной ДНК эндонуклеазами рестрикции
- Конструирование диагностических ДНК-зондов
Введение к работе
Актуальность работы. Диарейные заболевания относятся к числу наиболее распространённых среди людей и животных и создают одну из серьёзнейших проблем современной медицины и ветеринарии. Возбудителями диареи могут быть различные микроорганизмы, но чаще всего заболевание вызывается токсигенными энтеробактериями. Заражение происходит перорально. Факторами передачи бактерий являются инфицированные продукты и вода [Бондаренко, 1987; Guth, Pickett, 1986]. Наиболее восприимчивыми к токсикоинфекциям являются дети младшего возраста и молодняк сельскохозяйственных животных. Диарейные заболевания распространены и в клеточном звероводстве, являясь основной причиной повышенного отхода молодняка пушных зверей и ослабления иммунной системы организма.
Проблема острых кишечных инфекций до настоящего времени остаётся одной из важнейших в инфекционной патологии пушных зверей. Отмечается возрастающий удельный вес заболеваний, вызываемых бактериями сем. Enterobacteriaceae, относящихся к группе условно-патогенных микроорганизмов [Бондаренко, 2002; Зенин-Бермес, 1985; Канарейкина и др.,1981]. Детекция энтеробактерий, продуцирующих термолабильный и термостабильные энтеротоксины, ответственных за диарейный компонент при острых кишечных инфекциях, является одной из важнейших задач, направленных на повышение эффективности диагностики диарейных заболеваний.
Термолабильный (LT) и термостабильные (ST) энтеротоксины, синтез которых кодируется плазмидами [Dallas et al., 1980; So et al., 1980; Moseley et al., 1983], поражают органы пищеварения, выделения и активизируют других возбудителей диарей. Способность продуцировать энтеротоксины передаётся представителям других родов энтеробактерий. Поэтому важным этапом борьбы с энтеротоксигенными бактериями является разработка эффективных методов обнаружения как токсигенных микроорганизмов, так и продуцируемых ими токсинов.
Для обнаружения токсигенной микрофлоры используют два принципиальных подхода: либо поиск самого токсина, либо поиск генетических детерминант, ответственных за его продукцию бактериальной клеткой. Стандартный биологический метод, используемый для детекции энтеротоксигенных штаммов, позволяет определить биологически активный токсин. В последнее время широкое распространение получили молекулярно-генетические методы, позволяющие обнаружить генетические детерминанты, отвечающие за продукцию токсинообразования [Moseley et al.,1982; Кафтырева и др., 2004]. Такими методами являются ДНК-ДНК гибридизация и полимеразная цепная реакция (ПЦР).
Всё это делает актуальным как изучение распространения энтеротоксигенных штаммов в патологическом материале, кормосмесях для пушных зверей, объектах окружающей среды, так и разработку методов их обнаружения.
Цель исследования. Целью данного исследования является изучение распространения генов токсинообразования в популяциях энтеробактерий, изолированных из кормов и патологического материала, полученного от пушных зверей зверохозяйств, изучение частоты встречаемости различных типов энтеротоксинов и проведение сравнительного анализа эффективности методов индикации токсигенной микрофлоры.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Выделить из кормов пушных зверей и патологического материала бактерии, принадлежащие к сем. Enterobacteriaceae, и провести их идентифицикацию.
Провести тестирование энтеробактерий на способность к токсинообразованию с использованием биологического метода.
3. Сконструировать биотинилированные зонды на основе фрагментов генов
токсинообразования LT, STa и STb для детекции потенциальных возбудителей
токсикоинфекций, подобрать оптимальные условия гибридизации и провести скрининг
штаммов лабораторной коллекции на наличие генов токсинообразования методом дот-
блот гибридизации.
Подобрать нуклеотидные праймеры для детекции генов токсинообразования LT, STa и STb методом полимеразной цепной реакции, подобрать оптимальные условия проведения ПЦР и проанализировать коллекцию штаммов, изолированных из кормов и патологического материала, на наличие генов токсинообразования методом ПЦР.
Провести сравнительный анализ эффективности методов индикации токсигенной микрофлоры.
Научная новизна исследования состоит в том, что:
впервые изучен с качественной и количественной сторон видовой состав энтеробактерий, изолированных из кормов пушных зверей, и определена частота встречаемости представителей сем. Enterobacteriaceae;
впервые исследована репрезентативная коллекция штаммов, выделенных из кормов и патологического материала, на наличие энтеротоксинов;
впервые установлены типы токсинов, встречаемые в кормах и патологическом материале, с привлечением самых современных молекулярно-генетических методов.
5 Практическая ценность работы.
Практическая ценность состоит в том, что определён видовой состав микрофлоры, обсеменяющей кормосмеси пушных зверей, разработаны методы ДНК-гибридизации на основе сконструированных нами генно-инженерным путём нерадиоактивных зондов для определения генов токсинообразования. При разработке ПЦР-метода для детекции энтеротоксигенных штаммов, нами подобраны праймеры, позволяющие амплифицировать фрагменты ДНК, соответствующие LT, STa, STb токсинам энтеробактерий.
Основные положения, выносимые на защиту
- изучение видового состава энтеробактерий, обсеменяющих кормосмеси пушных
зверей,
разработка молекулярно-генетических методов детекции энтеротоксигенных штаммов на основе ДНК-гибридизации и полимеразной цепной реакции,
скрининг коллекции энтеробактерий молекулярно-генетическими методами и проведение сравнительного анализа эффективности методов детекции токсигенной микрофлоры.
Полимеразная цепная реакция
Молекулу-свидетеля можно включить в зонд двумя способами, а) Метод нуклеотидного замещения (пик-трансляция) осуществляется при участии двух ферментов: панкреатической дезоксирибонуклеазы (ДНКазы I) и ДНК-полимеразы I E.coli (ДНК pol I) [Rigby et al., 1977]. ДНКаза I вносит случайные однонитевые разрывы (nick) в обе цепи двухцепочечной молекулы. Далее с 5 -стороны от точки разрыва происходит последовательное отщепление пуклеотидов за счёт 5 -»3 - экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы I и одновременно за счёт 5 - 3 полимеразной активности этого же фермента - присоединение нуклеотидов к свободному З -гидроксилыюму концу. В итоге точка разрыва перемещается вдоль молекулы ДНК. Эта процедура пригодна для меток как радиоактивных, так и нерадиоактивных молекул-свидетелей - биотина и дигоксигенина. Метод ник-трансляции эффективен в случае линейной и кольцевой двухцепочечной ДНК и непригоден для мечения одноцепочечной ДНК. Этот метод позволяет получать меченые фрагменты длиной 200-500 нуклеотидов, оптимальной для гибридизации на фильтрах. Эффективность включения метки должна превышать 60%. Этот метод чаще всего применяется для выявления ДНК, поскольку соответствующие зонды легко получать и с ними легко работать.
б) Метод случайного праймировапия (рассеянной затравки) предполагает использование гексануклеотидов со случайной последовательностью, полученных либо при расщеплении ДНК тимуса телёнка ДНКазой I, либо синтетическим путём. Короткие нуклеотидные праймеры отжигаются с разными участками матрицы и с помощью ДНК-полимеразы осуществляется синтез новой цепи.
В основе метода рассеянной затравки, как и метода ник-трансляции, лежит синтез новой цепи, комплементарной матрице. Для копирования одноцепочечных РНК-матриц используют РНК-зависимую ДНК-полимеразу (обратную транскриптазу), а одноцепочечных ДНК - фрагмент Кленова - ДНК-полимеразы I E.coli. Впервые процедуру получения меченых фрагментов ДНК методом рассеянной затравки с использованием фрагмента Кленова описали Файнберг и Фогельштейн [1983].
Такие метки как биотин и дигоксигенин включаются в новосинтезированную ДНК через каждые 20-25 нуклеотидов и чувствительность их детекции может быть очень высокой. Размер меченых фрагментов составляет 200-2000 п.н. Биотинилированные зонды, полученные методом случайного праймирования проявляются в блот-гибридизации в два раза специфичней, чем зонды, меченые ник-трансляцией [Bialkowska-Hobrzanska, 1987].
Время гибридизации зависит от скорости процесса и полноты гибридизации, которой необходимо достичь. Скорость, в свою очередь, зависит от концентрации зонда и последовательности - мишени. Процесс гибридизации гибридизации занимает от двух до 40 часов, но обычно гибридизацию проводят в течение ночи. Оптимальное время подбирается опытным путём.
Специфичность метода гибридизации зависит как от условий гибридизации, так и от последующего отмывания препарата. Одним из достоинств метода гибридизации является возможность проводить реакцию в жёстком или мягком режиме, что позволяет выявлять последовательности-мишени, обладающие разной степенью гомологии с используемым зондом. Этот момент очень важен для диагностики инфекций, вызываемых бактериями близких видов. Коптроли гибридизации необходимы для того, чтобы убедиться в специфичности наблюдаемого сигнала. Во всех случаях необходимо ставить как положительные, так и отрицательные контроли. В специфичности зонда позволяет убедиться гибридизация с культурой, содержащей искомую последовательность. С помощью отрицательного контроля можно исключить неспецифическую гибридизацию, гибридизацию с гомологичными, но не идентичными последовательностями.
Среди методов детекции энтеротоксигенных штаммов гибридизация ДНК-зондами отмечена как наиболее перспективная в массовом тестировании и единственно способная обнаружить сцепленные estA-eltB гены обоих токсинов [Domaradskaia et al., 1992].
Молекулярно-генетические технологии постепенно занимают соответствующее им место в лабораторной диагностике, эффективно сочетаясь и дополняя традиционную диагностику. За последнее время в России и за рубежом накоплен положительный опыт генодиагностики на основе полимеразной цепной реакции, что повлекло появление большого количества работ, характеризующих полимеразную цепную реакцию (ПЦР) как высокочувствительный и быстрый метод обнаружения микроорганизмов.
Расщепление плазмидной ДНК эндонуклеазами рестрикции
Для определения биохимических свойств культур микроорганизмов использовали следующие среды: среда для определения уреазы, среда для определения триптофан-дезаминазы и индола, среда для определения лизинкарбоксилазы, среда Фогеса-Проскауэра, среда для выявления сероводорода, среды для определения ферментации лактозы, сахарозы, сорбита, маннита, арабинозы, среда Хью-Лейфсона [Hugh R Leifson Е., 1953], цитратный агар Симонса, среда с малонатом натрия, среда с ацетатом натрия, трёхсахарный агар Олькеницкого с мочевиной, среда Кларка [Clark W., Lubs Н.], среда с фенилаланином; тест-реактивы: для реакции с метиловым красным, реактив Ковача, реактив на триптофан-дезаминазу, на ацетоин, на цитохромоксидазу, на бета-лактамазу. Для интерпретации результатов использовали определитель бактерий Bergey Manual of systematic Bacteriology (1984).Штаммы поддерживали в столбиках с полужидким 0,7#ым агаром под стерильным вазелиновым маслом. Для получения биомассы перед культивированием штаммы высевали на чашку со средой LA, содержащей необходимый антибиотик, термостатировали при 37С в течение 18 часов, после чего высевали в пробирки с жидкой питательной средой LB объёмом 5 мл с добавлением антибиотика в необходимой концентрации и инкубировали при 37С на шейкере при 180 об/мин. в течение ночи. Полученной таким образом затравочной культурой инокулировали жидкую питательную среду LB большего объёма (200 мл). Отношение затравочной культуры к объёму питательной среды составляло 1:100. Культивирование вели в условиях активной аэрации на вращающейся платформе (180 об/ мин) при 37С в течение 18 часов до достижения культурой ранней стационарной фазы роста. После наращивания необходимого количества биомассы следовала процедура выделения плазмидной ДНК.
Для выделения плазмидной ДНК из клеток бактерий применяли метод щелочной денатурации. Выросшие клетки отделяли центрифугированием с охлаждением при 10 тыс.об./мин в течение 10 мин. Осадок промывали 0,15 М NaCl с последующим центрифугированием при тех же условиях. После ресуспендирования осадка в буфере STET, клетки разрушали 0,3 М раствором гидроокиси натрия, инкубировав на водяной бане при температуре 70С в течение 15 мин, добавляли ЮМ ацетат аммония до концентрации 2М и энергично встряхивали. ДНК, перешедшую в раствор, отделяли от клеточного дебриса центрифугированием.
ДНК осаждали равным объёмом изопропанола, смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. После 10-минутного центрифугирования при 14 тыс.об/мин., надосадочную жидкость удаляли, а осадок осушали. Для удаления изопропанола осадок плазмидной ДНК дважды промывали 70%-ным этанолом с непродолжительным центрифугированием на максимальных оборотах. Осадок растворяли в буфере с низкой ионной силой (ТЕ) или в ДИСТ.Н20. Результат выделения ДНК контролировали постановкой электрофореза.
Для удаления из препаратов РНК, полученную плазмидную ДНК обрабатывали ферментом РНКаза при 37 С в течение 30 мин., предварительно подвергнув РНКазу 10-минутному кипячению для инактивации ДНКазы. Конечная концентрация была равна 50-100 мкл /мл. РНКазу удаляли обработкой равными объёмами смеси хлороформа и изо-амилового спирта в соотношении 24:1, смесь подвергали лёгкому встряхиванию во избежании механических разрывов и центрифугировали при 14 тыс.об/мин.в течение 5 минут. Далее осторожно отбирали верхнюю водную фракцию в чистую пробирку, ДНК осаждали равным объёмом изопропанола, отделяли центрифугированием при 14 тыс.об/мин. 10 минут и дважды промывали 70%-ным этанолом.
Электрофорез ДНК проводили в 1, 1,5 или 0,7%-ном агарозном геле с бромистым этидием в концентрации 0,5 мкг/мл в трис-боратном буфере с рН 8,0. Использовали горизонтальные блоки агарозы размером 12x18 и 20x17 см. Напряжение электрического поля составляло 150 В, время разделения 1-2 часа.
В работе использовали рестриктирующие эндонуклеазы EcoRI, Hindlll и Pstl. Количество фермента, необходимого для полного расщепления данной ДНК подбирали экспериментально в зависимости от его активности. Для расщепления 1у ДНК требовалось 10 ед. эндонуклеазы EcoR I, a Hindlll - 5 ед. В качестве буфера для указанных рестриктаз служил (10 х) буфер R + с BSA. Объём реакционной смеси составлял 50 мкл. Процедура приготовления реакционной смеси состояла в следующем: в пробирках "Eppendorf к раствору плазмидной ДНК добавляли рассчитанное количество диет, воды, перемешивали встряхиванием, добавляли буфер в количестве 1/10 от объёма реакционной смеси и рестрицирующие эндонуклеазы, которые добавляли последними. После непродолжительного встряхивания пробирки помещали на несколько секунд в центрифугу для осаждения со стенок пробирок раствора. Инкубацию реакционной смеси проводили на водяной бане при температуре 37С в течение 1 часа.
Контролем рестрикции служили пробы, в которые вносили все компоненты реакционной смеси без добавления ферментов. Реакцию останавливали добавлением буфера для нанесения пробы в гель или замораживанием и анализировали рестрикцию ДНК посредством электрофореза или замораживанием проб - в случае дальнейшего использования продуктов гидролиза.
Конструирование диагностических ДНК-зондов
Клонирование генетических детерминант патогенности является первым этапом на пути создания диагностикума. Как правило, содержание в клетке какого-либо фрагмента ДНК, например, отдельного гена, очень незначительно. Поэтому для проведения экспериментов с фрагментами ДНК их необходимо многократно копировать (клонировать).
В качестве донорских ДНК использовали токсигенные штаммы, выделенные от пушных зверей. При клонировании LT-B фрагмента использовали плазмиды, являющиеся производными плазмиды pLT-B, полученными в лаборатории в ходе работ: плазмиды pLT-Bl, pLT-B22, pLT-ВЗІ, несущие EcoRI-Hindlll фрагменты гена субъединицы-В термолабильного энтеротоксина в pBR322; плазмиду pLT-B10, несущую EcoRI-Hindlll фрагмент субъединицы В гена термолабильного энтеротоксина BpUC18.
Для клонирования фрагментов чужеродной ДНК использовали в качестве вектора плазмиду pBR322 (4,6 т.п.н.), которая может автономно реплицироваться в E.coli, обладает ослабленной регуляцией репликации и несёт гены устойчивости к ампициллину и тетрациклину, по которым можно выявлять трансформантов и поддерживать плазмиду в бактериальной клетке. Полная нуклеотидная последовательность плазмиды известна, она содержит единичные удобные сайты для используемых в работе рестрицирующих ферментов EcoRI, Hindlll, Pstl. Плазмидную ДНК выделяли как указано в разделе "Материалы и методы."
Молекулярное клонирование EcoRI-HindIII-рестрикционных фрагментов ДНК в составе векторной плазмиды pBR322 проводили по общепринятым методикам [Maniatis, 1984].
Схема конструирования зондов приведена на рис.1.
Сначала клонируемый фрагмент вырезали из исходных ДНК с помощью эндонуклеазы рестрикции EcoRI и Hindlll. Кольцевую плазмиду pBR322 линеализировали с помощью тех же рестрикционных ферментов (EcoRI и Hindlll) и затем смешивали с ДНК вставки в соотношении 1 : 4.
Фрагмент и вектор, имея одинаковые липкие концы, гибридизовались таким образом, что клонируемые фрагменты оказывались интегрированными в структуру вектора. Затем концы линейной молекулы ковалентно сшивали с помощью ДНК-лигазы Т4 с образованием новой рекомбинантной плазмиды. После трансформации клеток реципиентного штамма E.coli С600 лигазными смесями на поверхности селективной среды вырастали устойчивые к ампициллину (Арг) трансформанты, поскольку рестриктазы EcoRI и Hindlll не затрагивают область устойчивости к ампициллину в плазмиде pBR322.
В результате этих экспериментов было селекционировано 4 разновидности рекомбинантных штаммов, несущих плазмидную ДНК со встроенным геном рецепторной В -субъединицы (размером 0,6 kb) термолабильного энтеротоксина эшерихий и характеризующихся устойчивостью к ампициллину (pLT-B-1, pLT-B-10, pLT-B-22, рЬТ-В-31).Свой выбор для дальнейшей работы мы остановили на плазмиде pLT-B-ЗІ, размером в 0,6 kb.
Для подтверждения того, что рекомбинантная плазмида pLT-B содержит EcoRI-Hindlll фрагмент исходной плазмиды, ДНК рекомбинантной плазмиды была выделена из клеток и подвергнута рестрикционному анализу с помощью рестриктаз EcoRI и Hindlll. Результаты этого анализа показали, что плазмида pLT-B-ЗІ действительно состоит из векторной плазмиды pBR322 и EcoRI-Hindlll фрагмента исходной плазмиды. На электрофореграмме (фото 1) видны 2 полосы: LT-B-фрагмент, размером 600 п.н. и более тяжёлый фрагмент, являющийся векторной частью плазмиды, размером 4600 п.н. Следовательно, генетический регион, детерминирующий продукцию субъединицы В локализуется в EcoRI-Hindin фрагменте плазмиды штамма №31.
Для наработки плазмид, содержащих LT-B вставку, с целью последующего конструирования ДНК-зонда, проведено культивирование штамма, полученного путём введения в геном рекомбинантной плазмиды, в питательной среде LB с ампициллином в конечной концентрации 100мкг/мл. Засев флаконов затравочной культурой проводили в соотношении 1:100 и выращивали при 37С при активной аэрации (180 об/мин.) в течение 18 часов. Выделение плазмидной ДНК pLT-B-ЗІ щелочным методом с последующей очисткой от РНК и многократной обработкой смесью хлороформ-изоамиловый спирт проводили согласно описанным методикам. Полученную плазмидную ДНК, в количестве 20 мкг в одной реакции подвергали гидролизу рестрицирующими эндонуклеазами EcoRI и Hindlll в течение 1 часа при 37С.
Электрофоретическое разделение реакционной смеси проводили в 1% агарозном геле в трис-боратном буфере. Лёгкий фрагмент, соответствующий гену В-субьединицы термолабилыюго эптеротоксина размером 600 пар пуклеотидов, располагался в зоне краски. Острым скальпелем вырезали ячейку в агарозе перед необходимым фрагментом, заполняли его легкоплавкой агарозой и, контролируя вхождение фрагмента в легкоплавкую агарозу трансиллюминатором, проводили электрофорез.
Далее фрагмент с геном LT-B вырезали из геля, элюировали и проводили очистку и осаждение. Контроль чистоты выделенной ДНК, а также определение концентрации осуществляли посредством электрофореза (фото 2). В качестве маркеров при определении размеров плазмидных фрагментов использовали Hindlll рестрикты ДНК фага X, последний из которых даёт лёгкий фрагмент в 564 п.н., соответствующий нашему LT-B фрагменту, а также ЕсоІЗОІ и Mlul рестрикты ДНК фага X, два из которых (923 и 458) интересовали нас, поскольку в этом интервале находится LT-B фрагмент, размером 600 п.н.
