Содержание к диссертации
Введение
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
Pseudomonas aeruginosa (синегнойная палочка), как этиологический фактор при болезнях животных и человека
1 Биологическая характеристика культур Pseudomonas aeruginosa 7
2. Синегнойная палочка в организме животных и человека 9
Влияние микробной контаминации спермы на воспроизводительную функцию животных
1. Роль Pseudomonas aeruginosa в нарушении воспроизводительной функции у животных
2. Видовой состав микрофлоры из репродуктивных органов самцов и самок сельскохозяйственных животных
3. Роль физиологического состояния организма животных и уеловий внешней среды в микробной контаминации спермы
Генетические особенности наследственной устойчивости организма животных к болезням
Чувствительность Pseudomonas aeruginosa к антимикробным препаратам
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 24
Материалы и методы исследований 24
Особенности контаминация спермы быков Pseudomonas aeruginosa в условиях племпредприятий Ленинградской области 27
Биологические свойства выделенных культур Pseudomonas aeruginosa
2.3.1. Морфологические и культурально-биохимические свойства культур Pseudomonas aeruginosa ,
2.3.2. Типирование выделенных культур Pseudomonas aeruginosa... 34
2.4. Показатели воспроизводительной функции крупного рогатого скота при использовании спермы контаминированной и свободной от Pseudomonas aeruginosa...
2.4.1. Влияние синегнойной палочки на оплодотворяемость и получение приплода в хозяйствах Ленинградской области
2.4.2. Биологические показатели спермы быков-производителей, контаминированной Pseudomonas aeruginosa
2.5. Уровень микробной контаминации спермы у быков-производителей на племпредприятиях Ленинградской области .
2.6. Зависимость микробной контаминации спермы от состояния организма, возраста животных и времени года и других условий .
2.7. Значение генетических факторов в устойчивости к псевдомонозу у крупного рогатого скота
2.7.1. Связь породной и линейной принадлежности у быков-производителей с псевдомононосительством 60
2.8. Иммунологическое сходство между выделенными штаммами Pseudomonas aeruginosa и антигенами групп крови у крупного рогатого скота
2.9. Чувствительность выделенной микрофлоры спермы к антимикробным препаратам
3. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 74
ВЫВОДЫ 81
РЕКОМЕНДАЦИИ ПРОИЗВОДСТВУ 83
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 84
ПРИЛОЖЕНИЯ 107
- Биологическая характеристика культур Pseudomonas aeruginosa
- Особенности контаминация спермы быков Pseudomonas aeruginosa в условиях племпредприятий Ленинградской области
- Связь породной и линейной принадлежности у быков-производителей с псевдомононосительством
Введение к работе
Актуальность темы: Одним из важнейших факторов повышения продуктивности сельскохозяйственных животных является совершенствование племенного дела, главная задача которого это реализация крупномасштабной генотип ичес кой селекции на основе использования спермы быков-улучшателей, оцененных по качеству потомства.
Последние годы в патологии воспроизводительных органов животных отмечают возрастание роли некоторых видов условно-патогенных микроорганизмов, втом числе синегнойной палочки {Pseudomonas aeruginosa). Широкое распространение псевдомононосительства среди быков-производителей и соответственно возможно частая контаминация этим возбудителем спермопродукции, наносит большой экономический ущерб не только племенному делу, но и всему животноводству за счет выбраковки спермопродукции и вынужденного убоя ценных быков-производителей с высоким генетическим потенциалом.
Особенно это становится актуальным в настоящее время, когда поголовье крупного рогатого скота значительно сократилось и как следствие уменьшилось количество быков проверяемых по качеству потомства, при этом цена за единицу спермопродукции соответственно возросла.
Несмотря на то, что изучению псевдомонозов у животных уделяется большое внимание, многие вопросы, касающиеся биологии возбудителя, влияние его на организм животного, меры борьбы и профилактики, являются полемическими или не изучены. Все это и определило направление и цели наших исследований.
Цель исследований: Целью наших исследований было установить факторы, влияющие на санитарное качество спермопродукции, определить микробные показатели спермы быков-производителей и определить степень влияния спермы контаминированной условно-патогенными микроорганизмами
5 на результативность искусственного осеменения.
Для разрешения указанной цели были поставлены следующие задачи:
Изучить особенности псевдомононосительства у быков-производителей и возможность его влияния на воспроизводство крупного рогатого скота.
Определить условия и факторы, влияющие на уровень микробной контаминации спермы.
Установить роль иммуногенетических показателей организма животного в микробной контаминации спермы.
Разработать рекомендации по санитарным показателям спермы и использованию санирующих препаратов в средах для разбавления спермы.
Научная новизна: В настоящей работе впервые с использованием математических методов, были определены степени влияния различных условий и факторов на уровень контаминации спермы микроорганизмами. Установлена зависимость уровня осеменяемости животных и получения приплода в хозяйствах Ленинградской области от спермы контаминированной синегнойной палочкой. Достоверно установлено наличие антигенного сходства между эритроцитарными антигенами групп крови крупного рогатого скота и соматическими антигенами штаммов синегнойной палочки.
Практическая ценность работы: Апробирован математический метод коэффициентов корреляционного отношения (коэффициент Пирсона) при анализе микробных показателей спермы. Доказана необходимость пересмотра составов сред используемых для разбавления спермы без санирующих препаратов.
Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:
Микробный состав спермы быков-производителей на племпредприятиях Ленинградской области.
Влияние различных факторов на уровень контаминации спермы микроорганизмами.
Показатели результативности исскуственного осеменения в хозяйствах Ленинградской области при использовании спермы контаминированной синегнойной палочкой.
Физиологические концентрации микроорганизмов в сперме, как постоянно существующей микрофлоры в мочеполовых путях у быков-производителей.
Пути реализации: Материалы диссертационной работы и результаты исследований могут быть использованы при разработке санитарных норм для спермопродукции сельскохозяйственных животных, а так же возможности их использования их при подборе сред для разбавления спермы при заморозки.
Апробация работы: Материалы диссертационной работы включены в учебный процесс переподготовки и повышения квалификации специалистов зоотехнической и ветеринарной службы в ФГОУ « Академии менендж: мента и агробизнеса Нечерноземной зоны Российской Федерации», в ФГОУ В ПО «Санкт-Петербургской Государственной Академии ветеринарной медицины», применяются в технологической лаборатории ФГУП «Невское» в процессе заморозки спермопродукции.
Основные положения диссертации опубликованы в трех научных статьях и доложены на научной конференции прфессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов СПбГАВМ (2005 г.)
Внедрение: На основании результатов исследований изданы «Рекомендации по использованию сред для разбавления спермы быков-производителей без санирующих препаратов» (2004 г.), которые утверждены отделом ветеринарии агропромышленного комитета Ленинградской области для практического применения в ФГУП «Невское» при технологическом процессе разбавления и заморозки спермы быков-производителей, используемой для исскуственного осеменения коров и телок на сельскохозяйственных предприятиях Ленинградской области.
Структура и объем диссертации: Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения,
7 выводов, практических предложений, списка использованной литературы и приложений.
Диссертация изложена на Шстраницах машинописного (компьютерного) текста, иллюстрирована 5 рисунками и 26 таблицами.
Список использованной литературы включает 184 источника отечественных авторов и 32 иностранных.
Биологическая характеристика культур Pseudomonas aeruginosa
Возбудитель синегнойной инфекции палочка сине-зеленого гноя Bacillus pyocyaneus впервые была обнаружена в 1862 году Lucke и выделена в чистом виде Gessord.C в 1882 году. Позднее микроб получил название Pseudomonas aeruginosa и Bacillis aeniginosum (11). В определителе бактерий Берги (85) этот микроорганизм отнесен к роду Psedoumonas, входящего в семейство Pseudomonadaceae, класса Bubecteriales.
По морфологии это прямая или слегка искривленная палочка, размером 0,5 - 11,5 - 3 мкм., покрытая тонкой слизистой оболочкой (окраска по Гансу), хорошо окрашивается анилиновыми красками, грамотрицательная, подвижная. Микроб является строгим аэробом, однако в анаэробных условиях в присутствии нитратов он способен к росту за счет восстановления последних (85 ,170,172).
В мазке палочки располагаются одиночно, парами или короткими цепочками. Имеют полярный жгутик и различное число пилей от 2 до 10 (85, 134).
Культуры синегнойной палочки растут практически на всех питательных средах в широком диапазоне температур (от 4 до 40 С). При росте на твердых питательных средах (температурный оптимум 35-37 С) образуются мелкоточечные, беловатого цвета колонии с образованием пигмента и специфического неприятного запаха триметиламина. На МГЛА может расти в S и R формах. Нередко наблюдаются слизистый рост и тонкая пленка на поверхности МПБ (92,134,170).
Из других характерных особенностей синегнойной палочки следует отметить частое проявление радужного феномена в виде блестящего металлического налета окружающего зоны лизиса при росте культур на плотных питательных средах. Радужный феномен присущ бактериям из рода Pseudomonas, только Pseudomonas aeruginosa (50).
Штаммы Pseudomonas aeruginosa обеспечивают положительную оксидазную реакцию, свертывают и пептонизируют молоко, ферментатируют углеводы, не ферментатируют глюкозу, манит и сахарозу, восстанавливают нитриты и нитраты, а в анаэробных условиях не образуют индол и сероводород.
Гемолиз на кровяном агаре зафиксирован у половины выделенных культур (32, 140,141).
Pseudomonas aeruginosa гидролизует белки до пептидов, аминокислот, метана и аммиака (55).
Характерной биологической особенностью этих микроорганизмов является их хроматогенная функция - способность выделять ряд пигментов: пиоцианин, флюоресцин, пиорубин, меланин (68, 32).
Установлено и описано свыше 250 штаммов синегнойной палочки. Эти штаммы обладают широкой вариабельностью по морфологическим вариантам и биохимическим свойствам (148, 199). По данным ряда исследователей 10% из исследуемых штаммов не образовывали пигмент, 6% образовывали коричнево-вишневый, 84% - сине-зеленый пигменты (142). Выделяют штаммы капсульные, беспигментные, безжгутиковые и образующие отличные от пиоционина пигменты (46, 148, 163). Отмечено, что Pseudomonas aeruginosa обладает способностью образовывать капсулоподобную слизь и токсины - гистотоксин А, гемолизины, лейкоцидин (160, 189). Состав слизи и синтез экзотоксинов у разных штаммов разный и происходит не одинаково (183). Однако большинство исследователей патогенные свойства Pseudomonas aeruginosa связывают со способностью таких штаммов продуцировать экзотоксин А- сходный по механизму действия с дифтерийным токсином (33, 68, 70). Экзотоксин А действует на процессы синтеза белков, энергетический обмен и иммунную систему организма. Исследователи отмечают параллелизм между тяжестью течения болезни и выделением мукоидных штаммов (35,183). Имеется много сообщений, свидетельствующих о постоянно возрастающей патогенности этого микроорганизма (49, 69, 152). По мнению этих исследователей, патогенность синегнойной палочки объясняется наличием у выделенных из клинического материала штаммов Pseudomonas aeruginosa большого количества внеклеточных ферментов и токсических субстанций, многие из которых при определенных условиях могут обусловливать их патогенность.
Особенности контаминация спермы быков Pseudomonas aeruginosa в условиях племпредприятий Ленинградской области
В изученных нами 19 культурах Pseudomonas aeruginosa представляли собой грамотрицательные, прямые палочки, располагающиеся в мазке из спермы быков-производителей одиночно и парами, а иногда цепочками, подвижные.
Бактерии Pseudomonas aeruginosa хорошо росли на обычных питательных средах (МПБ, МПА) и все были аэробами. На мясопептонном агаре синегнойная палочка образовывала мелкоточечные, слегка выпуклые с сероватым оттенком колонии с образованием пигмента от зеленовато-желтого до интенсивно зеленого цвета и специфического запаха. При росте на мясопептонном бульоне часто наблюдался слизистый рост и тонкая пленка на поверхности бульона, которая при легком встряхивании выпадала в осадок. На поверхности иногда образовывалось зеленое кольцо.
Пигментообразование отмечалось примерно через 24 -72 часа культивирования и начиналось помутнением с зеленоватым оттенком. В дальнейшем культуры приобретали последовательно зеленый, сине-зеленый и красно-бурый цвета, соответственно времени их старения к7-10-15 дню.
Большинство исследованных культур Pseudomonas aeruginosa (96%) вырабатывали сине-зеленый пигмент — пиоцианин, что было установлено пробой с хлороформом.
При росте на кровяном агаре все выделенные культуры обладали гемолитической активностью с выраженными зонами гемолиза.
У 68% изученных культур наблюдался «радужный феномен»: при росте на МПБ образовывалась блестящая пленка с металлическим оттенком, а на МПА это выражалось зонами радужного лизиса с металлическим блеском.
На среде Эндо синегнойная папочка образовывала крупные колонии с неровными краями розоватого цвета.
Биохимические свойства выделенных культур синегнойной палочки представлены в таблице 4.
Как видно из данных таблицы 4, все изученные культуры Pseudomonas aeruginosa разлагали глюкозу, галактозу, ксилозу и большинство культур арабинозу (94,8%).
Все изучаемые культуры не образовывали индола и сероводорода. Все они свертывали молоко. Активно разжижали желатину с послойным характером разжижения. Реакция на оксидазу у 100% изучаемых культур была положительная.
Гемолитическая активность отмечалась у всех исследуемых культур в виде зон просветления диаметром от 3 до 5 мм.
Таким образом, результаты исследований показали, что все изученные культуры синегнойной палочки по своим морфологическим и культурально-биохимическим признакам обладали типичными для данного вида свойствами.
Связь породной и линейной принадлежности у быков-производителей с псевдомононосительством
По материалам таблиц видно, что среди быков черно-пестрой породы частота псевдомононосительства значительно меньше, нежели среди быков айширскоЙ породы.
У первых псевдомононосительство зарегистрировано у 86 животных из 536 обследованных, что составляет 16%, а у вторых соответственно 40 из 111, что составляет 36% (Р=0,01). Сила влияния породы на псевдомононосительство составила 5,8 %, т.е. псевдомононосительство на 5,8% зависит от принадлежности животных к той или иной породе.
Наряду с породными особенностями в частоте псевдомононосительства, имеет значение и принадлежность животных к определенным линиям.
Так, например, среди черно-пестрых быков линии Нико только 5 из 56 оказались псевдомононосителями, что составило 9%, тогда как в линии Хильтес Адема из 20 быков у 6 установлено псевдомононосительство, что составляет 30%.
Аналогичная неравномерность частоты встречаемости болезни, но в меньшей степени обнаружена и в линиях айширского скота.
Сила влияния линейной принадлежности (внутри пород) на псевдомононосительство составила 3,7%, т.е. псевдомононосительство у быков-производителей зависит от линейной принадлежности животных на 3,7%.
Учитывая то, что быки-производители одной и другой породы находились на племпредприятиях в одинаковых условиях содержания и эксплуатации, мы можем считать, что выявленные различая в большей степени связаны с породной и линейной принадлежностью, а не с условиями содержания и эксплуатации на разных племпредприятиях.
Одной из этапных задач наших исследований было изучение антигенных взаимоотношений между организмом крупного рогатого скота и возбудителем псевдомоноза Pseudomonas aeruginosa.
Из литературы известно, что исследователи пытаются создать против псевдомоноза специфическую вакцину и при этом диапазон эффективности ее применения колеблется в пределах от 0 до 100%.
Кроме того, имеется целый ряд сообщений о существовании у возбудителей инфекционных и инвазионных болезней антигенных детерминант, перекрестно-реагирующих с тест-сыворотками, выявляющими антигены групп крови человека и животных, а также влияние о влиянии этого феномена на силу иммунного ответа и течение болезни.
Эти данные привели нас к мысли о необходимости изучения антигенного сходства между эритроцитарными антигенами у крупного рогатого скота и соматическими антигенами наиболее часто выделяемых штаммов Pseudomonas aeruginosa.
На первом этапе этих исследований нами была проверена частота распространения в популяции быков-производителей Ленинградской области 47 эритроцитарных антигенов. С этой целью был проведен анализ фенотипов по группам крови у 237 быков-производителей, результаты которого представлены в материалах таблицы 22.
