Содержание к диссертации
Введение
1. Перспективы и современные подходы к разработке биопрепаратов на основе живых микроорганизмов 9
1.1. Взаимосвязь нормальной микрофлоры и антиинфекционной резистентности организма 9
1.2. Пробиотики: оценка возможности использования живых микроорганизмов для создания лечебно - профилактических препаратов . 20
1.3. Представители бактерий рода Bacillus как арсенал для конструирования эффективных биопрепаратов 35
1.4. Эффективность применения пробиотиков в медицине и сельском хозяйстве: состояние и перспективы 43
2. Материалы и методы 57
3. Результаты исследований 63
3.1. Конструирование генетически модифицированного штамма Bacillus licheniformis 2336/рВМВ для разработки нового пробиотического препарата 63
3.2. Создание консорциума генетически модифицированных штаммов Bacillus для препарата су бал ин-форте 75
3.3. Технология получения препарата субалин-форте 84
3.4. Эффективность пробиотика субалин-форте в птицеводстве... 95
Обсуждение результатов 105
Выводы 115
Список литературы 116
Приложения 138
- Пробиотики: оценка возможности использования живых микроорганизмов для создания лечебно - профилактических препаратов
- Эффективность применения пробиотиков в медицине и сельском хозяйстве: состояние и перспективы
- Конструирование генетически модифицированного штамма Bacillus licheniformis 2336/рВМВ для разработки нового пробиотического препарата
- Создание консорциума генетически модифицированных штаммов Bacillus для препарата су бал ин-форте
Пробиотики: оценка возможности использования живых микроорганизмов для создания лечебно - профилактических препаратов
В последние годы в терапии и профилактике инфекционных заболеваний и стресса широко используются пробиотики - препараты, в состав которых входят живые микроорганизмы - естественные обитатели кишечного тракта теплокровных или сапрофиты, обитающие во внешней среде. Они могут служить альтернативой антибиотикам, в отличие от которых совершенно безвредны, экологически чисты и не имеют противопоказаний для применения. Наше время по праву называют «наступающей эпохой пробиотиков». И действительно, бурное развитие исследований по разработке новых биопрепаратов и дальнейшему изучению механизма их лечебно-профилактического действия, дает основания утверждать, что в XXI веке пробиотики в значительной степени потеснят на рынке традиционные и небезопасные для организма препараты, особенно те из них, которые применяются с профилактической целью. Повышенный интерес к пробиотикам вызван, с одной стороны, ростом контингента лиц, требующих коррекции аутофлоры и, с другой стороны, - прогрессом в изучении роли микрофлоры человека в поддержании его здоровья /Янковский Д.С. и др., 2004/ В настоящее время биопрепараты на основе живых микробных культур широко применяются в медицине и ветеринарии для коррекции микрофлоры ЖКТ /Toumot J., 1989; Isolauri Е. et al., 1994; Salminen S. et al., 1996; Biourge V. et al., 1998; Cavazzoni V. et al., 1998; Rowland I., 1999; Hoa N.T. et al., 2000; Rolfe R.D., 2000; Dalmin G. et al., 2001; Nikoskelainen S. et al., 2001; Jadamus A. et al., 2002; Alexopoulos C. et al., 2004/.
Основоположником концепции пробиотиков является И .И. Мечников, который еще в 1903 году предложил практическое использование микробных культур-антагонистов для борьбы с болезнетворными бактериями. Т. Riise (Дания) в 1981 г. термином «пробиотик» обозначил «...увеличение полезных микроорганизмов в пищеварительном тракте животного-хозяина путем введения больших количеств желательных бактерий для переустановления и поддержания идеальной ситуации в кишечнике». M.Vanbelle et al. (1990) определили понятие «пробиотик» как антоним антибиотиков, т.е. «промотор жизни». Elmer GW. (2001) охарактеризовал их как «живые лекарства».
В современном понимании пробиотики представляют собой препараты живых микроорганизмов, которые являются компонентами нормальной флоры человека, или микроорганизмы, не характерные для нормальной флоры, но способные вытеснять патогенную флору из просвета кишечника. Входящие в состав пробиотиков бактерии создают барьер для патогенных микроорганизмов путем синтеза антибактериальных субстанций и выработки молочной и уксусной кислоты. Показано многогранное и разностороннее положительное действие пробиотиков на организм животного-хозяина, которое опосредуется через регулирование кишечного микробного баланса (образование антибактериальных веществ и ингибирование кишечных патогенов, конкуренция за питательные вещества и места адгезии), изменение микробного метаболизма, стимуляцию иммунной системы, противораковое и антихолестеринемическое действие /Simmering R, Blaut М, 2001; Янковский Д. С. и др., 2004; Гатауллин А.Г. и др., 2004/. Фундаментальные исследования современной биологической и медицинской науки позволили разработать и внедрить в практику многие пробиотики, основу которых составляют живые микробные культуры. В отличие от антибиотиков, они не оказывают отрицательного воздействия на нормальную микрофлору, поэтому широко применяются для профилактики и лечения дисбактериозов. В то же время эти биопрепараты характеризуются выраженным клиническим эффектом при лечении (долечивании) ряда острых кишечных инфекций. Важной особенностью пробиотиков является их способность повышать противоинфекционную устойчивость организма, оказывать в ряде случаев противоаллергенное действие, регулировать и стимулировать пищеварение /Saavedra JM., 1999, 2001; Elmer GW., 2001/. Ouwehand AC et al. (2003) подчеркивают, что положительное действие пробиотиков на организм должно быть научно обоснованным в клинических испытаниях на людях, проведенных независимыми группами исследователей, с опубликованием полученных результатов.
Концепция терапии пробиотиками (терапевтическое применение потенциально благоприятных микроорганизмов) базируется на том, что микрофлора ЖКТ является важным компонентом слизистой кишечника /Сергеев В.А., и др. 1988; Панин А.Н. и др., 1998; Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 1997, 2000; Salminen S. et al., 1998/.
Пробиотики, или "friendly bacteria", становятся все более доступными для населения в качестве пищевых добавок или используются для пероральной бактериотерапии и бактериопрофилактики заболеваний ЖКТ человека. Часто эти нарушения, многие из которых приводят к развитию диареи, являются результатом использования антибиотиков, индуцирующих дисбаланс нормальной микрофлоры. Использование пробиотиков является как средством восстановления нормальной микрофлоры кишечника, так и альтернативой в отношении использования антибиотиков для конкурентной элиминации патогенных микроорганизмов /Tournot J., 1989; Saavedra JM., 1995; Якушенко M.H. и др., 1997; Marteau P. et al., 2002/. Наиболее широко в качестве пробиотиков используются молочнокислые бактерии (лактобактерии, энтерококки, стрептококки и бифидобактерии, пропионовокислые бактерии, аэрококки) /Fuller R., 1991; Воробьев А.А. и др., 1997; Сидоров М.А. и др., 2000/.
Бактерии родов Lactobacillus , Bifidobacterium устойчивы к кислоте и ферментам желудка, к желчным кислотам, обладают адгезивными свойствами к слизистой кишечника и колонизируют ЖКТ. Zhou JS. et al. (2001) было показано, что представители вышеуказанных родов, рассматриваемые как потенциальные пробиотики, не нарушали структуры и функций муцина ЖКТ. Молочнокислые бактерии ингибируют рост кишечных патогенов, включая Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Clostridium perfringens и Clostridium difficile, и широко используются как для человека, так и животных /Haller D. et al., 2001; Marsalkova S, et al., 2004/. В настоящее время в медицине успешно применяют лактобактерии, бифидумбактерин, колибактерин, бификол, ацилакт и другие препараты.
Эффективность применения пробиотиков в медицине и сельском хозяйстве: состояние и перспективы
Бактерии рода Bacillus являются важным арсеналом совершенствования биопрепаратов. Благодаря своим высоким адаптивным возможностям, они широко распространены в природе и, в частности, в тех объектах, с которыми человек контактирует наиболее тесно (пищевые продукты, вода, воздух и т.д.) /Осипова И.Г. и др., 1998/, Именно поэтому бациллы постоянно и в значительных количествах поступают в организм человека и, поскольку являются устойчивыми к литическим и пищеварительным ферментам, сохраняют жизнеспособность на всем протяжении ЖКТ. Следовательно, аэробные спорообразующие бактерии рода Bacillus являются одним из важных и неотъемлемых компонентов экзогенной микрофлоры. Благодаря синтезу широкого спектра биологически активных веществ (витаминов, ферментов, пептидных антибиотиков и т.п.), они способны элиминировать бактериальные патогены из организма, нормализовать полезную микрофлору, стимулировать локальный иммунитет /Isolauri Е., 2001/.
Среди различных представителей экзогенной микрофлоры бациллы характеризуются рядом преимуществ, которые позволяют считать их наиболее эффективными в качестве новых биопрепаратов /Смирнов В.В. и др., 1993; MazzaP., 1994; Green D.H. etal., 1999/: 1) эти бактерии (кроме В. anthracis и В. cereus), как правило, являются безвредными для макроорганизма даже в концентрациях, значительно превышающих рекомендуемые для применения; 2) при пероральном применении бациллы существенно повышают неспецифическую резистентность макроорганизма; 3) антагонистическая активность их ярко выражена и проявляется к более широкому спектру патогенных и условнопатогенных микроорганизмов, чем у других представителей экзогенной и эндогенной микрофлоры; 4) бациллы характеризуются высокой ферментативной активностью, позволяющей им существенно регулировать и стимулировать пищеварение, оказывать противоаллергенное и антитоксическое действие; 5) эти микроорганизмы технологичны в производстве, стабильны при хранении /Ferreira L.C.S. et al., 2005/; 6) они экологически безопасны, имеют статус GRAS /Амбулос Н. и др., 1992;СорокуловаИ.Б., 1996, 1998/. Наиболее перспективными, хотя и технологически более сложными, могут быть пробиотические препараты, которые состоят из бактерий различных видов (микробный консорциум), находящихся в синтрофных взаимоотношениях. При этом, однако, не исключается использование отдельных видов бактерий, обладающих необходимыми свойствами или улучшенных генно-инженерными методами. Примером такого рода комплексного препарата может служить биоспорин, в состав которого входят не один, а два штамма - В. subtilis и В. licheniformis. Они дополняют друг друга по спектру антагонистической активности, продукции ферментов и аминокислот и, что очень важно, не подавляют при этом резидентные микроорганизмы. Бациллы, входящие в биоспорин, активно угнетают патогенные микроорганизмы /Смирнов В.В. и др., 1993/. Другим примером эффективного использования штаммов В. subtilis и В. licheniformis в составе пробиотического препарата может служить Биоплюс 2Б. Задача ученых, разработавших этот препарат, состояла в поиске штаммов суперпродуцентов широкого спектра ферментов, улучшающих пищеварение и повышающих экономические показатели при выращивании птицы, свиней и крупного рогатого скота /Башкиров О.Г., 2001/.
Эффективным сочетанием является совмещение в одном препарате бактерий родов Bacillus и Lactobacillus. Обусловлено это тем, что эти микроорганизмы взаимотолерантны и в то же время существенно различаются по механизмам воздействия на разные звенья патологического процесса. Так, лечебно-профилактический эффект, оказываемый молочнокислыми бактериями, в значительной мере связан с их выраженной адгезивной активностью, которая обеспечивает формирование полноценной защитной биопленки слизистых кишечника, а также с высокой активностью кислотообразования, что создает неблагоприятные условия для жизнедеятельности многих патогенных микроорганизмов /Сорокулова И.Б., 1996/.
Известно, что на основе аэробных спорообразующих бактерий можно получать штаммы с заданными свойствами, поскольку эти бактерии являются удобной и хорошо изученной системой для клонирования чужеродных про- и эукариотических генов /Щелкунов С. Н., 1986; Клонирование ДНК. Методы, 1988; Амбулос Н. и др., 1992/. Следовательно, на основе бацилл методами генной инженерии можно конструировать новые штаммы, которые наряду с сохранением высокой исходной антибактериальной активности, обладали бы и антивирусными свойствами за счет введенной генетической информации.
Среди существующих в настоящее время пробиотиков нет высокоэффективных средств, характеризующихся выраженной антивирусной активностью. В то же время известно, что заболевания вирусной и вирусно-бактериальной этиологии составляют значительную часть инфекционной патологии человека и животных. Если для лечения бактериальных инфекций существует широкий арсенал лекарственных средств, то для вирусных болезней набор таких препаратов весьма ограничен. Поскольку известно, что вирусные инфекции, как правило, осложняются бактериальными и наоборот, представляется весьма актуальной проблема разработки средств, характеризующихся одновременно антибактериальными и антивирусными свойствами. Перспективными для этой цели также являются пробиотики из бацилл /Сорокулова И.Б., 1996; Белявская В.А. и др., 2002/.
Существуют различные подходы к разработке способов повышения эффективности пробиотиков.
С целью повышения эффективности пробиотики используют в сочетании с различными иммуностимуляторами, антивирусными веществами и цитокинами, среди которых наиболее широко представлены препараты интерферона (ИФН). Применение препаратов рекомбинантных интерферонов человека является одним из основных современных подходов к терапии различных заболеваний, В медицинской практике широкое применение нашли генно-инженерные препараты, такие как реаферон, роферон, берофор, интрон-А и др. /Ершов Ф.И., 1996, 2003/. Накоплен значительный клинический материал, подтверждающий терапевтическую эффективность инъекционных форм интерферонов. Вместе с тем у препаратов этой группы отмечают целый ряд недостатков: результат их действия зависит от формы инфекции, состояния организма, индивидуальной переносимости препарата. Известно, что инъекция интерферонов часто вызывают нежелательные побочные реакции (гипертермию, головную и мышечную боль, тошноту, рвоту); в ряде случаев образуются антитела, нейтрализующие интерферон, что резко снижает терапевтическую эффективность и может приводить к аллергическим реакциям; использование инъекционных форм сопряжено с повышенным риском передачи вирусов гепатита и ВИЧ: инъекционные формы интерферонов относительно дороги, поэтому в реальной клинической практике эти препараты имеют ограниченное применение.
Конструирование генетически модифицированного штамма Bacillus licheniformis 2336/рВМВ для разработки нового пробиотического препарата
Определение уровня синтеза интерферона клетками трансформированных бацилл проводили двумя методами: по ингибированию цитопатического действия вируса энцефаломиокардита (ЕМК) с использованием культуры клеток диплоидных фибробластов человека (ДФЧ-ДК-58) и иммуноферментным анализом (ИФА) с использованием коммерческих наборов «ProCon IF2 plus», (г. Санкт-Петербург). Образцы лизатов культуральной жидкости для определения внеклеточного интерферона готовили по схемам, разработанным с учетом известных методик по изучению продукции интерферона и других рекомбинантных белков клетками бацилл /Palva L et al.s 1983/. Определение антивирусной активности интерферона по ингибированию цитопатического действия вируса проводили на монослое клеточной культуры. Суспензию клеточной культуры доводили до концентрации 2x10 кл/мл ростовой средой. В каждую лунку вносили по 100 мкл суспензии клеток и инкубировали в СОг - термостате до формирования монослоя клеток. Затем ростовую среду удаляли и в первую лунку вносили 20 мкл титруемого образца и 180 мкл поддерживающей среды. После осторожного перемешивания 100 мкл из первой лунки переносили во вторую, смешивали со 100 мкл поддерживающей среды и т.д. Клетки выдерживали при 37С в течение 24 ч. В каждую лунку с обработанным монослоем вносили 100 ТЦПД (тканевых цитопатических доз, вызывающих поражение в половине проб вируса) и выдерживали при 37 С в течение 24-48 ч. Через 24 ч. Проводили первый учет результатов, через 48 ч. — второй. Расчет титра интерферона производили с поправкой на результаты стандартного препарата - реаферона.
Стабильность плазм ид в клетках бацилл изучали в экспериментах in vitro (при пассировании на культуральных средах) и in vivo (путем пассирования через организм мышей) и оценивали по доле клеток, сохранивших исходную плазмиду. После пассажей проводили рассев культуры для получения изолированных клонов на агаризованнои среде без антибиотиков, У 100-200 случайно отобранных клонов определяли сохранность фенотипа, детерминируемого наличием плазмиды (Km1, INF+), для чего с помощью стерильной микробиологической иглы их переносили на агаризованную питательную среду с добавлением антибиотика. После культивирования в течение 24 ч определяли соотношение клонов, сохранивших и утративших устойчивость к антибиотику. Сохранность встройки гена интерферона (структурную стабильность) определяли рестрикционным (по появлению рестрикционного PstI -EcoRI фрагмента длиной 700 н.п.), гибридизационным и ПЦР анализами. Для определения структурной стабильности плазмиды после культивирования, пассирования в условиях in vitro и in vivo проводили гибридизанионный анализ на сохранность гена интерферона. В качестве гибридизируемого меченного фрагмента был взят Slal - Hindlll фрагмент ДНК плазмиды рВМВ105, содержащий часть гена интерферона. Вся процедура гибридизации была стандартной /Маниатис Т. и др., 1984/. Стабильность рекомбинантных плазмид в трансформированных штаммах оценивали при пассировании на жидкой питательной среде LB без антибиотика. Для этого 5 мкл ночной культуры исследуемых штаммов вносили в 5 мл свежей питательной среды и оставляли при 37С в термостате до утра. Одно суточное выращивание (пассаж) соответствует примерно 12-14 клеточным генерациям /Denich К. et al., 1993/. Операцию повторяли десятикратно. Через I, 3, 5, 10 пассажей проводили высевы культуры на твердую питательную среду и определяли процентное количество бактерий, сохранивших плазмиду. Изучение антагонистических свойств у рекомбинантного штамма проводили методами отстроченного антогонизма - радиальных и перпендикулярных штрихов, и агаровых блочков /Егоров Н.С, 1979/. Для культивирования штамма-антагониста были использованы следующие среды: среда Громыко, сусло-агар и картофельный агар.
Патогенносте вирулентность и токсичность сконструированного штамма B.subtilis 2336/рВМВ105 изучали по методу Биргер М.О. (1982) на белых мышах при внутрибрюшинном, подкожном и пероральном введении 24 часовой культуры, выращенной на МПА или агаризованной среде Гаузе 2 с канамицином (10-20 мкг/мл). Токсичность (безвредность, согласно ТУ 9383-021-00479979-01) препарата субалин-форте определяли на самцах беспородных белых мышей, массой 18-20 г. Сформировали опытную и контрольную группы по 5 животных в каждой, содержащихся на стандартном рационе в условиях вивария. Опытная группа дополнительно к основному рациону получала препарат из расчета 1 доза на мышь в течение 10 дней. Ежедневно проводили взвешивание животных и по соотношению прироста живой массы в опытной и контрольной группах судили о безвредности препарата.
Антивирусную активность рекомбинантного штамма изучали совместно с лабораторией Игнатьева Г.М. (ГНЦ ВБ «Вектор», пгт. Кольцово) на модельной инфекции герпеса 2-го типа. Были использованы самцы морских свинок, массой 200-220 г. Животные были получены из питомника ГНЦ ВБ «Вектор» и содержались в стандартных условиях вивария на сбалансированной диете. Заражение вирусным материалом проводили согласно описанной ранее методике /Маренникова С.С. и др., 1986/. Были сформированы две опытных (по 10 животных) и одна контрольная (5 животных) группы. Первая опытная группа получала суспензию живых клеток рекомбинантного штамма B.licheniformis 2336/рВМВ105 в количестве по (1,0±0,5)х109 кое/мл с дополнительными аппликациями на пораженные участки в той же дозе. Вторая группа получала только аппликации. Третья группа не получала никакого лечения. Внутри каждой из опытных групп половина (5 животных) морских свинок получала суспензию рекомбинантного штамма, другая половина - культуру штамма-реципиента. Лечебный эффект оценивался по разности баллов с результатами третьей (контрольной) группы /Даниленко Е.Д. и др., 1998/.
Исследование эффективности субалина-форте в птицеводстве исследовали на цыплятах-бройлерах кросса «Сибиряк». Выращивание цыплят с суточного до 42-дневного возраста осуществлялось в клеточных батареях типа БКМ-ЗБ. Технологические параметры выращивания бройлеров по плотности посадки, фронту кормления и поения, температурному и световому режимам соответствовали нормам, принятым в хозяйстве. В схему кормления были включены антибиотики. Пробиотики давали с водой. Предварительно готовили препарат: 5 г сухого концентрата, содержащего (8,5±1,5) х 101 к.о.е./г растворяли в 500 мл питьевой воды, тщательно перемешивая. Полученную гомогенную суспензию выливали в специальный бак, емкостью 80 л. Таким образом, на каждого цыпленка в среднем приходилось 0,02 дозы препарата (1 доза составляет 5,0 х 109 к.о.е.), что соответствует 5 х 107 к.о.е. на голову. При проведении второго курса подачи препарата дозу увеличивали в два раза. Клетки батареи БКМ-ЗМ оборудованы ниппельными поилками. На время выпаивания пробиотиков бак подключали к системе поилок. Цыплята выпивали воду в течение 2-3 часов, после чего поилки подключали к системе водоснабжения. Препараты давали двумя курсами по 5 дней: первый курс проводили в первую неделю жизни, второй - с 28-30 дня жизни цыплят.
Создание консорциума генетически модифицированных штаммов Bacillus для препарата су бал ин-форте
Популяция клеток рекомбинантного штамма B.licheniformis 2336/рВМВ105, как видно из таблицы 3, отличается значительной неоднородностью по уровню синтеза интерферона, вплоть до полного его отсутствия, несмотря на наличие плазмиды.
Исследование стабильности плазмиды. Стабильность плазмид в трансформированном штамме является основным условием оценки перспективности его использования в качестве вектора доставки терапевтических белков в составе препаратов /Carrier MJ. et aL, 1992/. Это продиктовано спецификой действия таких штаммов, жизнедеятельность которых осуществляется в неконтролируемых (неселективных) условиях организма теплокровных. По этой же причине затруднено использование индуцибельных промоторов.
Для того чтобы оценить насколько стабильно будет осуществляться поддержание плазмиды в штамме при прохождении клеток по ЖКТ в составе препарата, необходимо исследовать ее как в условиях вегетативного роста, так и спорообразования.
Для изучения стабильности плазмиды в штамме B.licheniformis 2336/рВМВ105 проводили пассирование клеток штамма на питательных средах, пригодных для спорообразования (картофельный агар) /Смирнов В.В. и др., 1993/. Максимальное время культивирования вегетативных клеток составило не более 18 ч. каждого пассажа. В этих условиях спорообразования клеток не происходит. Уровень стабильности оценивали по доле клонов, сохранивших устойчивость к канамицину. Наличие плазмиды в резистентных к антибиотику клонах подтверждали электрофорезом и с помощью рестрикционного анализа. Присутствие плазмиды с молекулярной массой 5,6 кЬ и фрагмента рестрикции EcoRl-PstI (700 н.п.) свидетельствовали о репликации и структурной стабильности плазмиды рВМВ105 в клетках трансформированного штамма. При пассировании вегетативных клеток (рисунок 3) стабильность плазмиды оставалась высокой: до 80% клеток сохраняли плазмиду после 10 пассажей (около 120 генераций), о чем свидетельствовала сохранность у них KmR+ фенотипа. Но при пассировании в дифференцирующих условиях (после прохождения стадии споруляции, что достигалось увеличением времени культивирования до 36-42 часов), стабильность плазмиды резко падала. Менее 10% клеток сохраняли исходный KmR+ фенотип. Клетки, сохранившие плазмиду, имели низкую жизнеспособность на среде с антибиотиком: предельная концентрация канамицина для них составила не более 10 мкг/мл. Данные о неоднородности популяции B.licheniformis 2336 по ряду полезных признаков (стабильность плазмиды, экспрессия гена интерферона, жизнеспособность клеток), свидетельствовали о необходимости стабилизации клеточного состава трансформированного штамма по этим селективным признакам для создания на его основе лечебно-профилактического препарата.
Для стабилизации штамма В. licheniformis 2336/рВМВ105 использовали комплекс факторов: пассирование клеток при повышенной температуре 39С с последующим посевом на твердую агаризованную среду, содержащую предельную концентрацию канамицина (50 мкг/мл) и лиофильную сублимацию культуры для отсева ослабленных клеток и спор. Таким образом был получен селекционный вариант трансформированного штамма, в котором произошла стабилизация популяции по полезным селективным признакам (таблица 4). 71 Как видно из таблицы 4, популяция селекционного варианта трансформированного штамма является более стабильной и однородной по жизнеспособности и устойчивости к максимальной концентрации канамицина. Была также проверена стабильность плазмиды при пассировании культуры селекционного варианта. Стабильность плазмиды достигала 70%, т.е. число клонов, не утративших плазмиду при длительном пассировании, увеличилось на порядок по сравнению с исходным вариантом. На основе селекционного варианта штамма B.licheniformis 2336/рВМВ105 была проведена наработка стандартных препаратов лиофильно высушенной культуры для дальнейшего изучения специфической активности, обусловленной экспрессией гена интерферона в условиях интродукции в организм теплокровных.
Исследование антагонистических свойств трансформированного штамма B.licheniformis. Одним из требований, предъявляемых к штаммам для пробиотических препаратов, является антагонистическая активность по отношению к патогенным и условнопатогенным микроорганизмам, обусловленная способностью продуцировать антибиотические и другие биологически активные вещества антимикробного действия /Бондаренко В.М., Горская Е.М., 1992; Nemcova R„ 1997; Gibson G.R., Fuller R., 2000/. Поэтому после трансформации плазмидой рВМВЮЗ реципиентного штамма B.licheniformis 2336 необходимо было проверить сохранность антагонистических свойств у рекомбинантного штамма.
В экспериментах in vitro было показано, что штамм B.licheniformis 2336/рВМВ105 обладает выраженной специфической активностью в отношении ряда тест-культур патогенных и условнопатогенных штаммов (таблица 5).
Из данных таблицы 5 видно, что рекомбинантный штамм B.licheniformis 2336/рВМВ105 сохранил антагонистические свойства исходного реципиентного штамма по отношению к патогенным и условнопатогенным культурам, но они менее выражены, чем у штамма B.subtilis 2335, составляющего основу препарата субалин. Антивирусная активность. Для оценки антивирусной активности была использована модельная инфекция герпеса II типа, чувствительная к воздействию ИФН-а /Исаков В.А. и др., 1993/. Дозы и способы введения вирусного материала были разработаны ранее при изучении антивирусной активности препарата субалин /Чудновская Н.В. и др., 1995/. Результаты по терапевтическому эффекту трансформированного штамма B.licheniformis 2336/рВМВ105 на течение герпетической инфекции представлены в таблице 6. Эффективность терапевтического эффекта оценивали в баллах, которые отражали степень выраженности патологических изменений /Даниленко Е.Д. и др., 1998/. Экспериментальная модель полового герпеса на морских свинках позволяет проводить клиническую оценку эффективности терапии путем визуального наблюдения за развитием патологической симптоматики, не требует дополнительных вирусологических и гистологических исследований /Маренникова С.С. и др., 1986/.
