Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Растение-эндофит: подход к анализу системы на основе известных типов взаимоотношений -мутуализма и паразитизма 11
1.1. Типы взаимоотношений растение-микроорганизм 11
1.2 Ризосферные бактерии 12
1.3 Ризобактерии, стимулирующие рост растений 15
1.4 Мутуализм растений с филосферными микроорганизмами 17
1.5 Мутуализм между растениями и эндофитными микробами 19
1.5.1 К определению термина «эндофит» 19
1.5.2 Роль бактериальных эндофитов в повышении устойчивости растений к фитопатогенам 20
1.6 Система растение - хозяин - фитопатоген 24
1.6.1 Первичные реакции растений на внедрение патогенов 24
1.6.2 Защитные реакции растений и их основные белковые компоненты 31
Глава 2 Материалы и методы 41
2.1 Объекты исследований 41
2.1.1 Растения 41
2.1.2 Эндофитный штамм бактерии Bacillus subtilis 26Д 41
2.1.3 Антагонистическая активность эндофитной бактерии В. subtilis 26Д 42
2.2 Материал - эндофита для инокуляции растений 44
23 Фитопатогенный материал 44
2.4 Постановка опытов 44
2.4.1 Моделирование солевого стресса 44
2.4.2 Имитация водного дефицита 44
2.4.3 Инфицирование растений 45
2.5 Материалы и методы биохимических исследований 46
2.5.1 Определение активности пероксидазы 46
2.5.2 Определение активности каталазы 46
2.5.3 Метод определения активности окисления фенольных соединений на поверхности корней интактных проростков пшеницы 47
2.5.4 Метод определения активности ингибиторов протеиназ 47
2.5.5 Экстрагирование фитогормонов и лектина из одной растительной навески 48
2.5.6 Определение цитокининовой активности 49
2.5.7 Определение гемааглютинирующей активности АЗП 50
2.5.8 Метод электрофореза белков 50
2.5.9 Метод цитологических исследований 51
2.6 Статистическая обработка 51
Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение . 52
3.1 Влияние эндофита Bacillus subtilis 26Д на рост и развитие проростков пшеницы 52
3.2 Влияние В. subtilis 26Д на содержание фитогормонов в проростках 55
3.3 Антистрессовый эффект инокуляции растений эндофитом 58
3.3.1 Защитное действие В. subtilis 26Д при засолении 58
3.3.2 Защитное действие эндофитной бактерии на растения при дефиците влаги 60
3.4 Ответные реакции пшеницы на грибную инфекцию в системе растение-эндофит 61
3.4.1. Изменение гормонального статуса при патогенезе, вызванном биотрофом Т. caries 61
3.4.2. Формирование гормонального статуса пшеницы при инокуляции эндофитом и инфицировании некротрофом В. sorokiniana 65
3.4.3 Активность оксидаз в растениях пшеницы, инокулированных эндофитомЯ subtilisiejX 68
3.4.4 Активность окислительных ферментов в растениях в системе пшеница - В. subtilis 26Д - фитопатоген 79
3.4.5 Влияние эндофита на содержание лектина в проростках пшеницы 83
3.4.6 Влияние эндофита В. subtilis 26Д на содержание лектина в проростках пшеницы при заражении грибными фитопатогенами 86
3.4.7 Влияние В. subtilis 26Д на активность ингибиторов трипсина в проростках пшеницы при инфицировании грибными фитопатогенами 89
4. Цитологический анализ первичного контакта клеток корней пшеницы с эндофитом В. subtilis 26Д 92
Заключение 94
Выводы 99
Список литературы 100
- Роль бактериальных эндофитов в повышении устойчивости растений к фитопатогенам
- Защитные реакции растений и их основные белковые компоненты
- Метод определения активности окисления фенольных соединений на поверхности корней интактных проростков пшеницы
- Формирование гормонального статуса пшеницы при инокуляции эндофитом и инфицировании некротрофом В. sorokiniana
Введение к работе
Актуальность работы. Инфекционные болезни являются одной из основных причин снижения продуктивности сельскохозяйственных растений. Для предотвращения потерь урожая, вызванных грибными патогенами, семена и посевы обрабатывают фунгицидами, как правило, опасными для человека и окружающей его среды. Рост потребительского спроса на экологически чистую продукцию растениеводства, а также стоимости химических пестицидов ставят задачу поиска и создания биопрепаратов для защиты растений от болезней. Следует признать также, что для борьбы с некоторыми болезнями растений химические препараты пока еще не созданы, или являются малоэффективными [Gerhardson, 2002]. Поэтому биологический контроль за развитием болезней растений (биоконтроль) считается реальной альтернативой химической защите посевов и одним из способов сокращения использования ядохимикатов в сельском хозяйстве [Штерншис и др., 2000; Логинов и др., 2001; Логинов, Силищев, 2005; Буров, 2005; Новожилов, 2005; Павлюшин, 2005; Тютерев, 2005; Тютерев и др., 2005; De Weger et al., 1995; Gerhardson, 2002; Postma et al., 2003; Welbaum et al., 2004].
В связи с этим очевидна перспективность работ по созданию биологических средств защиты растений от болезней, в том числе на основе культур живых микроорганизмов-антагонистов, подавляющих рост и развитие фитопатогенов. Использование бактерий-антагонистов в качестве действующей основы препаратов для борьбы с грибными болезнями растений становится всё более актуальным, так как широкое применение химических пестицидов, близких друг к другу по структуре приводит к появлению резистентных к ним форм фитопатогенных грибов, что затрудняет борьбу с ними.
В настоящее время отечественными исследователями создан ряд микробных препаратов для защиты растений от болезней. Это, например, псевдобактерин (на основе Pseudomonas aureofaciens, штамм BS 1393), планриз (на основе P.fluorescens, штамм АР-33), бактофит (на основе Bacillus subtilis, штамм ИПМ 215, а также продуцируемого им антибиотика) и другие (Список..., 2005). По характерным свойствам действующих агентов эти и другие микробные средства защиты растений от болезней можно классифицировать на две группы: препараты на основе свободноживущих бактерий и на основе эндофитов. К последней группе относятся два отечественных биофунгицида - фитоспорин (основа В. subtilis, штамм 26Д) и интеграл (В. subtilis, штамм 24Д).
Согласно Chen С. с соавторами (1995), эндофиты - это микроорганизмы, живущие в растительных тканях без нанесения существенного вреда растению или получения выгоды, большей, чем от места жительства. По данным В.Д. Недорезкова (2002) более 30 видов бактерий-эндофитов, например, Aureobacterium, Brevibacterium, Burkholderia, Corynebacterium, Enterobacter, Erwinia, Micrococcus, Pseudomonas, Serratia, Xanthomonas, Yersinia и другие могут служить в качестве основы биофунгицидов. Однако практическое применение, как правило, нашли препараты на основе В. subtilis. Это объясняется рядом их полезных свойств, таких как: высокая степень антагонизма к фитопатогенам, спорообразование, термостабильность, длительность хранения препаративных форм, низкая себестоимость производства и другие [Недорезков, 2005].
В то же время, несмотря на значительный ассортимент микробных средств защиты растений от блезней до сих пор не созданы эффективные биофунгициды для защиты зерновых культур от таких вредоносных болезней как бурая ржавчина, мучнистая роса, септориоз. Более того, нет ясности в ответе на вопрос: могут ли вообще быть созданы бактериальные микробиологические препараты для борьбы с указанными болезнями
злаковых растений. Одной из основных причин, сдерживающих разработку таких микробиопрепаратов на основе эндофитов, является, на наш взгляд, отсутствие работ по изучению молекулярных механизмов взаимоотношений в системах растение-бактериальный эндофит и растение-эндофит-фитопатоген. Поэтому характеристика таких систем с целью эффективного управления взаимодействием их участников является актуальной проблемой фитоиммунологии и защиты растений от болезней.
Цель работы. Охарактеризовать ответные реакции пшеницы с участием фитогормонов и основных защитных белков на инокуляцию клетками эндофитного штамма Bacillus subtilis 26Д (основа биофунгицида фитоспорин) и определить возможные механизмы повышения ими устойчивости растений к болезням.
Задачи исследования.
Определить влияние инокуляции семян и проростков пшеницы клетками В. subtilis 26Д на рост, развитие и устойчивость растений к болезням.
Оценить роль эндофита в устойчивости пшеницы к абиотическим стрессам.
Выявить характер изменения уровня фитогормонов, некоторых активных форм кислорода, а также защитных белков в растениях пшеницы в ответ на инокуляцию клетками бактерии.
4. Провести сравнительный анализ содержания фитогормонов и
защитных растительных белков в системах растение-эндофит и растение-
эндофит - фитопатоген.
Научная новизна. Впервые показана антистрессовая активность эндофита В. subtilis 26Д по отношению к растениям пшеницы в условиях засоления среды и при имитации водного дефицита. Впервые описан гормональный баланс (содержание индолилуксусной кислоты (ИУК), абсцизовой кислоты (АБК), цитокининов (ЦК)) в системах растение-эндофит,
а также растение-эндофит-фитопатоген. Впервые показана возможность действия препаратов на основе эндофитных штаммов В. subtilis не только как биофунгицидов, но и как индукторов устойчивости растений к стрессам абиотической и биотической природы.
Практическая значимость работы. Результаты исследований служат одним из обоснований алгоритмов поиска эндофитных шаммов В. subtilis в качестве основы новых, высокоэффективных биопрепаратов для защиты растений от болезней, а также для создания многокомпонентных микробиологических средств защиты и регуляторов роста растений с фунгицидной активностью.
Апробация работы. Результаты работы докладывались на Международной научной конференции «Агроэкологическая эффективность применения средств химизации в современных технологиях возделывания сельскохозяйственных культур» (Москва, 2005), «Молодежная наука и АПК: проблемы и перспективы» (Уфа, 2005), на II Всероссийском съезде по защите растений (С.-Пб.-Пушкин, 2005), на II Международном симпозиуме «Сигнальные системы клеток растений: Роль в адаптации и иммунитете» (Казань, 2006).
Конкурсная поддержка работы. Исследования выполнялись в рамках задания 02 и задания 03 Межведомственной координационной программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития АПК РФ на 2001-2005 гг. «Развитие биотически управляемых, устойчиво развивающихся агросистем на основе интегрированной защиты сельскохозяйственных культур». Конкурсная поддержка оказана Российским фондом фундаментальных исследований по проектам №05-04-9793 5-р_агидель_а, №05-04-08156-офи_а.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения методов исследований, результатов
исследований и их обсуждения, заключения и выводов. Рукопись объемом 130 страниц включает 21 рисунок, 12 таблиц, 2 фото. Список литературы насчитывает 296 источника, в т.ч. 173 - на иностранных языках.
Благодарности. Автор сердечно благодарит научного руководителя д.б.н., проф. Хайруллина P.M., а также к.б.н. Уразбахтину Н.А., к.с.-х.н. Аюпова Д.С., зав. лабораториями ИБГ УНЦ РАН д.б.н. проф. Шакирову Ф.М и д.б.н. Максимова И.В., сотрудников ИБГ к.б.н. Сахабутдинову А.Р. и Юсупову З.Р., коллег лаборатории биотехнологии за помощь при выполнении работы.
Роль бактериальных эндофитов в повышении устойчивости растений к фитопатогенам
В настоящее время эндофиты, способные подавлять рост фитопатогенов и повышать устойчивость растений к болезням привлекают внимание отечественных [Понятаев, 1999; Нугманова и др., 2001; Менликиев и др., 2001; Недорезков, 2002; Сатубалдин, Салангинас, 2002; Пусенкова, Марданшин 2003; Недорезков, Менликиев, 2004] и зарубежных исследователей [Chen et al., 1995; Gwinn et al., 1998; Kloepper, 1999; Ryder et al., 1999; Arnold et al., 2003]. Это связано с перспективностью использования эндофитов в биологической защите растений от вредителей и болезней. По данным В.Д. Недорезкова (2005), следующие свойства эндофитов рода Bacillus и препаратов на их основе объясняют перспективность применения этой группы микроорганизмов в биоконтроле: «эндофитность способность бессимптомно заселять растительные ткани и размножаться в них; высокая антагонистическая активность по отношению к различным видам патогенов растений, животных и человека; широкое распространение в природе, обеспечивающее успех в поиске хозяйственно полезных форм; безопасность многих штаммов для животных и человека; стимуляция роста и развития растений; спорообразование, способствующее длительному хранению препаратов на основе бактерии; низкая себестоимость производства препаратов».
Начало интенсивного изучения отечественными авторами бактериальных эндофитов, как антагонистов фитопатогенов и стимуляторов роста растений, можно отнести к 70-ым годам прошлого столетия, когда группа исследователей показала заселенность внутренних тканей большинства (70-80%) здоровых растений хлопчатника, гороха, картофеля, томата, табака и других культур бактериями родов Bacillus и Pseudomonas, а также выявила, что массовое заселение растений этими бактериями происходит с фазы 4-5 настоящих листьев, и по мере заселения ими растений и распространения в эндотканях снижается пораженность растений трахеомикозными болезнями (фузариозное увядание, вертициллезный вилт) [Менликиев, Султанова, 1974; 1976; Менликиев и др., 1986; Менликиев и др., 1990; Менликиев и др., 1991]. Большинство штаммов (более 60%), выделенных из внутренних тканей растений, обладали антагонистическими свойствами по отношению к возбудителям корневой гнили и увядания. При обработке семян пшеницы и хлопчатника суспензией клеток и спор эндофитных бактерий рода Bacillus повышалась энергия прорастания и всхожесть семян, снижалась степень поражения растений различными заболеваниями. Растения, инокулированные эндофитами выделялись лучшим ростом и развитием, урожайность повышалась на 10-15% в сравнении с контрольными.
Таким образом, на основе результатов изучения свойств эндофитных бактерий в восьмидесятые годы прошлого столетия возникла идея создания биопрепаратов для защиты растений от болезней [Менликиев и др., 1987; Менликиев и др., 1990]. В отечественных и зарубежных работах имеется значительное количество потверждений мнения о полезном действии эндофитных бактерий на жизнедеятельность растений. Например, вид бактерии Alcaligenes sp. защищает растения от Verticilum dahliae [Alstrom, 2001] и Fusarium moniliform [Bacon, Hinton, 2002]; ризобактерии того же вида подавляют развитие бактериального вилта Ralstonia solanacerum, антракноза Colletotrichum gloeosporioides, гнили Rhizoctonia solani, вируса мозаики огурца (CMV) [Jetiyanon, Kloepper, 2002]. Эндофиты вида В. amyloliquefaciens снижают интенсивность поражения растений грибом Botrytis cinerea [Nejad, Johnson, 2000]. В. subtilis проявляет антагонистическую активность по отношению к Xanthomonas campestris pv. campestris [Wulff et al., 2002]; Flexibacter-Cytophaga-Bacteroides проявляет антагонистическую активность против Ervinia caratovora subsp. atroseptica [Reiter et al., 2002]; Methylobacterium radiotolerans снижает гибель растений от фузариоза F. solani f. sp. piperis [Benchimol et al., 2000]; Proteobacteria sp. используется как антогонист против Е. caratovora subsp. atroseptica [Reiter et al., 2002], P. acidovorans, P. putida, Stenotrophomonas ssp. защищает от V. dahliae [Alstrom, 2001], Pseudomonas fluorescens, P. tolaasii, P. veronii, Sphingomonas trueperi подавляет рост Achlya klebsiana, Phythim spinosum in vitro [Adhikari et al., 2001]; Serratia plymuthica подавляет развитие Phythium ultimum [Benhamou et al., 2000]. Производственные опыты отечественных исследователей [Ткаленко и др., 2005; Франк и др., 2005, Саттарова и др., 2005; Новикова, 2005; Власенко и др., 2006; Коробова, и др., 2006] показали биологическую эффективность препаратов на основе В. subtilis в защите яровой пшеницы, ячменя, огурца, моркови и ряда других культур от болезней (корневых гнилей, ржавчины, септориоза). Прибавку урожайности зерна в сравнении с контролем на посевах пшеницы и ячменя получали в 4-7 ц/га [Новикова, 2005] и 3-6 ц/га [Франк, 2005]. Л.Н. Коробова и др. (2006) показали, что биопрепарат на основе В. subtilis способен повышать урожайность пшеницы в засушливый год в сравнении с контролем на 18%, а в год с оптимальными условиями - на 43%. Всего же по данным В.Д. Недорезкова (2002) в качестве эндофитов, применение которых возможно в защите растений от болезней, а также авторами цитируемых источников указывается около 30 видов различных бактерий. Спектр сельскохозяйственных культур - объектов защиты включает из злаковых - рис, кукурузу, пшеницу. Из других наиболее часто упоминающихся - пасленовые (картофель, томаты), крестоцветные (рапс), мальвовые (хлопчатник). Несмотря на эмпирический успех отечественных исследователей в создании биофунгицидов на основе эндофитных штаммов-антогонистов бактерий рода Bacillus (фитоспорин, фитоспорин-М, интеграл), теоретические основы создания подобных препаратов, а также пути повышения эффективности их применения остаются до сих пор недостаточно разработанными. Во-первых, не изучены механизмы проникновения эндофитов в растительные ткани. Не ясно, проникают ли они, выделяя целлюлозо-, пектино- и другие гидролитические ферменты, которые разрушают клеточную стенку растений, и/или действуют опосредовано через стимуляцию синтеза растительных ферментов? Во-вторых, не известна локализация различных эндофитных бактерий в тканях растений: в межклеточном пространстве, и/или внутри клетки. Не ясно происходит ли проникновение поэтапно - вначале в межклетники, а потом во внутрь клетки?
Защитные реакции растений и их основные белковые компоненты
Токсичность растительных метаболитов для микроорганизмов и способность разрушать микробные клетки, создавать барьер на пути их распространения играют первостепенную роль в устойчивости растений к болезням. После взаимодействия вторичных мессенджеров с геномом инфицированной растительной клетки происходит изменение его активности: экспрессия некоторых генов оказывается подавленной, других, как правило, отвечающих за синтез защитных компонентов, резко активизированной. В настоящее время в растениях обнаружены многие защитные ингредиенты такие как: АФК, фитоалексины, богатые оксипролином гликопротеины, PR-белки, ферменты класса оксидаз, гидролаз, ингибиторные белки, лектины и другие [Дьяков и др., 2001; Валуева, Мосолов, 2002; Максимов, Черепанова, 2006].
При проникновении микроорганизма в растение образуются АФК, которые могут вызывать окислительный взрыв. Избыток АФК может пагубно отразиться и на самом растении. Ключевую роль в таких ситуациях отводят таким ферментам, как пероксидаза, каталаза и другим.
Пероксидаза. Пероксидаза (ПО) способна окислять различные фенольные соединения с участием Н202 или органических перекисей [Максимов, Черепанова, 2006]. При этом образуются АФК и радикалы окисляемых соединений, способные к полимеризации. ПО является многофункциональным ферментом. Каталитические свойства ПО могут иметь противоположные направления: фермент способен участвовать как в продуции АФК, так и в редукции их [Минибаева, Гордон, 2003]. Так, показано, что усиление продукции супероксид-аниона наблюдается в результате активации ПО салициловой кислотой [Kawano et al., 1998]. В растениях латука выявлено накопление Н202 с участием растительной пероксидазы при инфицировании бактериями P. syringae pv phaseolicola [Bestwick et al., 1997]. Обнаружено участие апопластной ПО хлопчатника в продукции супероксид-аниона при заражении растений Xanthomonas campestris pv. malvacearum race 18 [Martinez et al., 1998].
С другой стороны, ПО может выступать, как активный участник системы антиоксидантной защиты [Меньшикова и др., 1994; Саприн, Калинина, 1999]. Окисление фенолов с одновременной утилизацией АФК с помощью пероксидазы является эффективной защитой, как от самоповреждения при окислительном взрыве, так и повреждения клеточных структур в результате воздействия неблагоприятных внешних факторов [Huh et al., 1997; Sitbon et al., 1999, Тарчевский, 2002; Чиркова, 2002].
Окисление монолигнолов и других фенольных соединений, образование связей между специфическими, структурными белками [Brisson et al., 1994], формирование связей между экстенсином, гидроксипролин-богатыми белками, пектинами при окислении тирозина и феруловой кислоты [Fry, 1986] позволяет отнести ПО к ферментам, участвующим в строительстве и укреплении клеточной стенки растений. При этом динамические свойства клеточной стенки растений должны снижаться, что характерно для лигнифицированных и дифференцированных тканей [Шарова, Суслов, 1999; Wallace, Fry, 1999]. Это, вероятно, объясняет обратную корреляцию между интенсивностью роста растений и активностью пероксидазы [Fukuda, Kokamine, 1983; Miidla et al., 1987; Sitbon, 1992], которая обычно повышается при дифференциации клеток и органов растений [Werker, Leshem, 1987; Olmos et al., 1997].
Важно отметить, что ПО может регулировать уровень и (или) активность сигнальных молекул, как в клетке, так и окружающей ее среде. Так, ПО способна продуцировать АФК, рассматриваемые как вторичные мессенджеры в передачи сигналов [Low, Merida, 1996; Pennel, Lamb, 1997]. Окисляя фенолы, например, ИУК как стимулятора роста [Гуськов, 1991], ПО может переключить метаболизм растений на дифференциацию тканей и органов - процессы, в которых сам фермент является активным участником.
Таким образом, пероксидаза выполняет в растениях множество функций в норме и при проникновении микроорганизмов в растительные ткани.
Оксалатоксидаза. К другим ферментам класса оксидаз относится оксалатоксидаза (00). Этот фермент привлекает к себе внимание по двум причинам. Во-первых, он вызывает образование перекиси водорода при окислении щавелевой кислоты (ЩК). Таким образом, его можно рассматривать как продуцента молекул АФК. Во-вторых, поскольку ЩК рассматривается как один из факторов патогенности грибных паразитов у растений, 00 может выступать как защитный фермент [Максимов, Черепанова, 2006; Яруллина и др., 2005, Трошина и др., 2004]. Например, один из фитопатогенов, синтезирущих ЩК является гриб Sclerotinia sclerotiorum, поражающий более чем 400 разновидностей растений. S. sclerotiorum синтезирует в больших количествах ЩК в инфицированных тканях, действующую как токсин, вызывающий увядание растений [Ни et al., 2003]. ЩК не только окисляет ткани растений, но также и хелатирует ионы Са+2, «отделяя» их от клеточных стенок, что приводит к губительному действию на них грибных гидролаз. ЩК также подавляет действие О-дифенол оксидаз [Ни et al., 2003]. Указанные авторы на примере подсолнечника продемонстрировали, что растения имеющие низкий уровень активности 00 не способны подавлять развите гриба S. sclerotiorum в растениях. Создание генноинженерных конструкций с усиленной продукцией 00 повышало устойчивость растений к грибным патогенам. Каталаза встречается у всех прокариотов и эукариотов и ее активность определяется во всех растениях и микроорганизмах, за исключением облигатых анаэробов [Меньщикова Е.Б., 1994]. Этот фермент разлагает перекись водорода в два этапа. При этом в окисленном состоянии каталаза может функционировать как пероксидаза, катализируя окисление спиртов или альдегидов [Меньщикова, 1994]. Кроме того, каталаза может выступать источником образования активированных кислородных метаболитов [Шинкаренко, Алексовский, 1982].
Роль каталазы в защите клеток и тканей против окислительного стресса хорошо изучена. Повышенная экспрессия каталазы делает клетки более стойкими к Н2О2 и окислительному стрессу [Erzurum et al., 1993]. В отличие от ПО и 00 этот фермент интересен тем, что каталаза присутствует в клетках многих бактерий, в том числе и В. subtilis.
Метод определения активности окисления фенольных соединений на поверхности корней интактных проростков пшеницы
В работе использовали метод, предложенный Хайруллиным P.M. и др., (2001). Перед опытами у проростков осторожно удаляли эндосперм, промывали корни в дистиллированной воде, переносили по 10 штук в чашки Петри с 10 мл раствора 0,0ЇМ КС1 и выдерживали не менее 4 ч для снятия раневого стресса. Затем среду отсасывали пипеткой и добавляли свежую, которая содержала 0,05% ОФД. Реакцию инициировали добавлением 1 мл раствора 0,025 М щавелевой кислоты. Среду сразу перемешивали осторожными круговыми движениями руки с чашкой Петри и с 2-минутным интервалом отбирали 0,2 мл жидкости, которую вносили в лунки плоскодонного планшета, содержащие 0,05 мл раствора 4N H2S04. Поскольку оптическая плотность раствора окисленного ОФД пропорциональна его массе количество окисленного субстрата выражали в условных единицах оптической плотности (А492) которую измеряли на приборе Униплан.
Активность ингибиторов трипсина (ИТА) определяли микрометодом [Конарев, 1992]. В лунки плоскодонных планшет ("Costar") вносили 45 мкл раствора трипсина (0,2 мг/мл, "Serva") в 0,05 М Трис-HCl буфере, рН 7,8. Затем приливали 35мкл образца в этом же буфере и инкубировали планшет 20 мин при 26С. После этого добавляли 70 мкл водного раствора N-a-бензоил-БЬ-аргинина-р-нитроанилида ("Serva", 1 мг/мл). Реакцию останавливали, внося 35 мкл 30%-ного раствора СНзСООН. Параллельно каждому образцу проводилось "холостое" определение, в котором перед добавлением субстрата реакцию предотвращали тем же раствором кислоты. Против этих лунок планшета определяли экстинкции образцов. В контроле вместо образцов добавляли тот же объем буфера. Оптическую плотность
Количественную оценку свободных фитогормонов и лектина пшеницы в одной растительной навеске проводили с использованием метода иммуноферментного анализа (ИФА) [Кудоярова и др., 1990; Шакирова и др., 1994]. Для этого навеску из проростков растирали в жидком азоте и экстрагировали фитогормоны 80%-ным этанолом в течение 16 ч при 4С. После центрифугирования при 15 000 g в течение 10 мин супернатант использовали для определения фитогормонов, а осадок - АЗП. Спиртовый экстракт упаривали в токе воздуха до водного остатка, в аликвоте которого определяли содержание цитокининов (зиатин-рибозид и его производные) [Кудоярова и др., 1990]. Оставшийся водный остаток затем подщелачивали 2%-ным гидрокарбонатом натрия, экстрагируя нейтральные и основные соединения серным эфиром (2:1). Процедуру повторяли дважды. Эфирный экстракт отбрасывали, из водного раствора после подкисления 1 н НС1ИУК и АБК дважды экстрагировали серным эфиром и метилировали диазометаном. После упаривания эфирного экстракта сухой остаток растворяли в 80%-ном этаноле, в аликвоте которого анализировали количество этих фитогормонов методом иммуноанализа [Шакирова, 1990; Хайруллин, 2001].
Оставшийся после центрифугирования спиртового экстракта твердый растительный осадок заливали 50 мМ НС1 (1 : 5) и экстрагировали лектин в течение 1 ч при комнатной температуре. После центрифугирования при 15 000 g в течение 15 мин надосадочную жидкость, содержащую этот белок, нейтрализовали 1 М фосфатным буфером (рН 7.2-7.4) в соотношении 1:10 [Хайруллин и др., 1993] и вновь центрифугировали. Полученный супернатант использовали для количественного определения лектина методом ИФА. В основе данного биотеста лежит способность цитокининов задерживать пожелтение срезанных листьев. О действии цитокининов на листья судят по содержанию в них хлорофилла, которое коррелирует с содержанием белка и отражает общее состояние листьев.
Для проведения эксперимента семена ячменя выращивали в нестерильной почве в теплице или в кюветах на светоплощадке. Через 10-14 дней после появления всходов у растений срезали первый лист и, отступив 2 см от основания листовой пластинки, отсекали фрагмент листа длиной 2 см. В чашки Петри на фильтровальную бумагу, смоченную 3 мл исследуемого раствора (суспензии клеток штамма B.subtilis 26Д в концентрации в концентрации 104, 105, 106 клеток/мл), раскладывали по 9 отрезков. В качестве контрольных растворов использовали дистиллированную воду и раствор кинетина в концентрации 10 мг/л.
Чашки Петри с отрезками листьев помещали в кюветы, на дно которых наливали воду, и закрывали сверху стеклом для поддержания оптимальной влажности. Кюветы ставили под люминесцентные лампы на круглосуточный свет (25000 люкс) на 7 дней. Для определения содержания хлорофилла по три отрезка из одной и той же чашки взвешивали, помещали на 1 час в морозильную камеру, после чего заливали 80% раствором этанола из расчета 1:30, закрывали пробками и оставляли в темноте для экстракции хлорофилла ещё на 7 дней. После этого количество хлорофилла в растворе определяли спектрофотометрически при длине волны 650 нм [Кулаева, 1973].
Гемагглютинирующую активность АЗП определяли с помощью кроличьих эритроцитов, обработанных трипсином (1мг/мл, "Serva") и фиксированных раствором 0,1%-ного глутарового альдегида [Lis et al., 1970; Turner, Liener, 1975]. Суспензию клеток (20% по объему осадка) хранили при 4С в ФБС с азидом натрия (0,02%). 30 мкл раствора белка вносили в лунку круглодонного планшета с 30 мкл ФБС и делали ряд двойных разведений. После этого вносили 30 мкл суспензии клеток эндофита, фиксированных формальдегидом, а затем 2%-ную суспензию эритроцитов в ФБС.
Для реакции гемааглютинации трипсинизированных эритроцитов кролика использовали следующие растительные лектины: Triticum vulgaris, Glycine hispide, Lens culinaris, Uritica dioica, Solanum tuberosum (Lectin lab, Украина). В реакции прямой агглютинации лектином пшеницы были использованы живые и фиксированные клетки эндофита. Суспензию клеток эндофита получали культивируя бактерии на качалках (220 об/мин) при 37С на среде ПСС [Недорезков, 2003]. Клетки отбирали через 12 часов роста. Таким же образом культивировали бактерии для определения активности катал азы в культуральной жидкости. Клетки отделяли от среды центрифугирования при 8000 g в течение 5 мин. Целостность клеток оценивали под микроскопом.
Изоэлектрофокусирование (ИЭФ) белковых экстрактов проводили с использованием 7 % -ого ПААГ и 2,5 % изолитов (ICN) с диапазоном ИЭФ белков от pi 3,0 до 10,0. Аликвоты супернатантов, содержащие как цитоплазматическую, так и клеточно-стеночную пероксидазу перед ИЭФ дополнительно диализовали против дистиллированной воды и выравнивали по содержанию белка. Наличие изопероксидаз в геле после ИЭФ проявляли с использованием 0,01% 3.3-диаминобензидина солянокислого ("Chemapol") в присутствии 0,001 % перекиси водорода в 0,1 М ФБ. Изоферменты пероксидазы, расположенные в геле между анодом и маркерным белком гемоглобином были обозначены как анионные, а между катодом и маркерным белком - катионные.
Формирование гормонального статуса пшеницы при инокуляции эндофитом и инфицировании некротрофом В. sorokiniana
В отличие от Т. caries, для паразитирования которого необходимо наличие живых клеток хозяина, для существования В. sorokiniana наоборот жизнеспособность клеток растений не обязательна. Таким образом, можно полагать, что изменения в гормональном статусе растений при инфицировании биотрофом и некротрофом будут различны.
Анализ количественного уровня ИУК в надземной части растений пшеницы через 3-9 дней после инфицирования двухнедельных проростков показал (рис. 4), что первоначальный этап патогенеза характеризуется снижением уровня ИУК в растительных тканях. Эти данные согласуются с результатами исследований Хайруллина P.M. (2001), показавшими существенное снижение уровня ауксина в тканях воприимчивой к корневым гнилям пшеницы Т. turgidum.
При обработке семян эндофитом уровень ИУК в инфицированных грибом растениях был выше, чем в остальных вариантах опыта. В дальнейшем наличие любого из микроорганизмов и их совместная комбинация снижали уровень ИУК в тканях растений. К концу опыта по содержанию ауксина растения разных вариантов не отличались существенно друг от друга. Повышенное содержание АБК в растениях, полученных из семян, инокулированных эндофитом (3 сутки после заражения) и зараженных В. sorokiniana к 9 суткам опыта может быть связано с естественной динамикой колебаний уровня АБК в растениях. Так, оно наблюдается вначале в растениях, инокулированных только эндофитом (3 сут.), развитие которых стимулируется бактерией, затем в контрольных, и, наконец, на фоне инокуляции обоими микроорганизмами. В целом же, система растение-эндофит-некротроф отличалась определенной стабильностью по содержанию АБК в ходе всего опыта.
В эксперименте с использованием некротрофа В. sorokiniana инокуляция семян эндофитом способствовала повышению уровня ЦК в надземной части растений на протяжении 6 сут. опыта. Это согласуется с данными, полученными в тест-системе с отрезками листьев ячменя (табл. 3). Увеличение уровня цитокининов в инфицированных В. sorokiniana растениях было, вероятно, связано с естественной защитной реакцией пшеницы на инфекцию [Яруллина, 2006].
Гормональный статус инфицированных некротрофом неинокулированных эндофитным штаммом В. subtilis растений сорта Жница во многом совпадает с аналогичным показателем при патогенезе у восприимчивых сортов пшеницы [Хайруллин, 2001; Яруллина и др., 2001]. Не исключено, что поддержание повышенного уровня ИУК и стабильность уровня других гормонов в растительных тканях в начале становления взаимоотношений растение-эндофит-патоген позволяет поддержать устойчивость хозяина к некротрофу, что, как правило, наблюдалось разными авторами в ходе полевых испытаний биофунгицида Фитоспорин [Недорезков, 2002; Менликиев и др., 1996]. Можно полагать, что определенная стабильность гормонального статуса растений в тройной системе сохраняет стабильность активности или содержания защитных белков и ферментов в растительных тканях. Анализу изменения активности некоторых из этих белков посвящены следующие разделы работы.
В последнее время отмечается интерес фитоиммунологов к несимбиотическим микроорганизмам, способным жить в растениях, не нанося им вреда. К таким относятся эндомикоризные грибы, формирующие везикулярно-арбускулярную микоризу [Проворов и др., 2002], а также эндофитные бактерии. Интерес к ним связан с повышением устойчивости колонизированных эндофитами растений к абиотическим стрессам и вредным организмам [Проворов и др., 2002; Garcia-Garrido, Ocampo, 2002]. Однако детальные и в то же время комплексные исследования молекулярных механизмов взаимоотношений эндофитных бактерий с растениями не проводились, что затрудняет практическое использование подобных микроорганизмов в защите растений от вредителей и болезней.
Основываясь на знаниях о защитных функциях таких оксидаз, как пероксидаза [Максимов, Черепанова, 2006], полифенолоксидаза [Cowan, 1999] оксалатоксидаза [Трошина и др., 2004, Яруллина и др., 2005, Ни et al., 2003] и других можно полагать, что во взаимоотношениях эндофита с растением активация этих ферментов хозяина «нежелательна» для микроорганизма. Одновременно для снижения активности защитных компонентов растения-хозяина эндофит, по-видимому, «должен» снижать и уровень сигнальных молекул. Таким образом, характер ответа растений на внедрение эндофита «должен», по нашему мнению, совпадать с реакцией восприимчивости к биотрофным фитопатогенам. В отличие от систем растение-патоген, для которых относительно легко можно подобрать линию или сорт хозяина, характеризующийся устойчивостью или восприимчивостью, для систем растение-эндофит такие сорта не описаны в литературе. Основываясь на высказанном выше предположении о сходстве биотрофов и эндофитов, в качестве модельной системы устойчивости пшеницы к эндофиту мы выбрали сорт пшеницы Башкирская 24, устойчивый к биотрофу Т. caries [Иргалина и др., 2004], а системы восприимчивости -восприимчивый к нему сорт Жница.
С целью поиска ответа на перечисленные и другие вопросы мы определяли характер изменения активности пероксидазы, каталазы, оксалатоксидазы и уровня Н2О2 в проростках пшеницы при инокуляции их эндофитным штаммом В. subtilis 26Д. Проводились кратковременные (минуты и часы) и длительные (сутки) воздействия эндофита на растения. Инокуляция 2-х и 4-х суточных проростков пшеницы обоих сортов пшеницы клетками эндофита в концентрации 10 кл./мл не меняла существенно активность пероксидазы в течение 15-60 минут опыта (рис.5).
