Введение к работе
1. 1.1. Актуальность темы.
Сибирская язва является широко распространенным особо опасным зооантропонозом, который наносит серьезный ущерб животноводству и представляет угрозу здоровью людей. Сложность борьбы с этой инфекцией обусловлена особенностями биологии ее возбудителя, природной очаговостью, наличием широкого круга хозяев, недостаточной изученностью генома и антигенной структуры микробных клеток. Широкий спектр восприимчивых животных и людей, способность длительное время сохраняться во внешней среде определяют необходимость дальнейшего изучения природы возбудителя сибирской язвы с целью разработки новых, более чувствительных и специфичных средств и методов идентификации патогенных бацилл.
В последние годы большое внимание уделяется исследованиям молекулярной структуры генома возбудителей особо опасных болезней животных, изучению взаимосвязи структуры и функции генома с целью создания чувствительных, специфичных диагностических тест-систем и эффективных средств специфической профилактики нового поколения. Для идентификации возбудителей бактериальных болезней животных широко применяют высокочувствительные методы анализа генома, такие как рестрикционный анализ, методы молекулярной гибридизации, геномной "дактилоскопии", полимеразной цепной реакции (ПЦР), секвенирования и риботипирования.
Разработка методов молекулярной генетики в последнее десятилетие привело к появлению нового класса молекулярных маркеров — фрагментов ДНК, соответствующих нуклеотидным последовательностям, комплементарных генам или сцепленных с этим геном (Visser M.R. and Fluit А.С. 1995). Появление ДНК-маркеров радикально изменило методы оценки ге-
нетического разнообразия микроорганизмов, паспортизации и дифференциации близкородственных микроорганизмов, картирования и определения структуры генов и эпизоотологического мониторинга (Scheinert Р., KrausseR., 1996).
Поскольку частоты различных классов коротких тандемных повторов значительно различаются у микроорганизмов, принадлежащих к разным таксономическим группам, для каждой группы' необходимо подбирать свои наборы праймеров. Наиболее привлекательным свойством коротких тандемных повторов является то, что они распределены по всему геному (что облегчает использование этих маркеров для молекулярного картирования генома). Простота манипуляций в сравнении с RFLP-анализом и значительная вариабельность, порой в 10 раз превышающая вариабельность RFLP-фрагментов, что обеспечивает высокую информативность этих маркеров.
Сравнительная эффективность методов анализа генотипов бацилл с использованием четырех видов ДНК-маркеров (RFLP-, RAPD-, AFLP- и SSR-методы) показало, что SSR-маркеры (короткие тандемные повторы) обеспечивают наибольшую информацию, а использование AFLP-зондов — наибольшее число локусов, выявляемых в одном и том же опыте (Mi-tani К., Ito N., 1997).
Указанные методы позволяют, прежде всего, выявлять не фенотипи-ческое проявление, а непосредственно исследовать молекулярную структуру генома, выявлять генетическую вариабельность, устанавливать генетическую взаимосвязь штаммов и изолятов возбудителей, выделенных в разных регионах.
1.2. Цель и задачи исследования. Основной целью данной работы
явилось изучение вариабельности генома различных штаммов Bacillus
anthracis, выявление их различий и идентификация возбудителя сибирской
язвы.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
рассчитать и синтезировать универсальные и специфические праймеры для избирательной амплификации различных генов возбудителя сибирской язвы;
охарактеризовать геномы различных штаммов возбудителя сибирской язвы и спорообразующих сапрофитов методами рестрикционно-го анализа, молекулярной гибридизации и риботипирования;
оптимизировать условия постановки ПЦР для дифференциации изолятов В. anthracis;
клонировать фрагменты генов протективного антигена и капсуло-образования в плазмидном векторе pUC19.
1.3. Научная новизна :
1. Экспериментально доказана возможность использования методов
RAPD-fingerprint и риботипирования для изучения геномного полимор
физма вакцинных штаммов возбудителя сибирской язвы и спорообразую
щих сапрофитов.
2. Установлено наличие в хромосомной ДНК гипервариабельных
последовательностей, детектируемых универсальными праймерами, а
также праймерами, комплементарными вариабельной последовательности
рРНК и инсерционного элемента, расположение которых имеет родовую,
видовую и штаммовую специфичность.
3. Определены оптимальные условия проведения полимеразной
цепной реакции для дифференциации капсулообразующих штаммов си
бирской язвы от непатогенных с использованием универсальных прайме-
ров, комплементарных гену СарВ.
1. 4. Практическая значимость.
Полученные результаты и разработанные методы используются:
для идентификации и дифференциации штаммов возбудителя сибирской язвы;
дифференциации и паспортизации производственных вакцинных штаммов;
полученные рекомбинантные плазмиды, содержащие фрагменты ДНК сибиреязвенных плазмид pXOl, рХ02, кодирующих гены протективного антигена и капсулообразования, могут в дальнейшем использоваться для проведения различных генно-инженерных манипуляций.
По материалам диссертации разработаны и утверждены директором ВНИИВВиМ методические указания, которые подтверждены актами комиссионных испытаний.
1.5. Положения, выносимые на защиту.
-
Изучение геномного полиморфизма хромосомной ДНК различных штаммов возбудителя сибирской язвы методами RAPD-fingerprint и риботипирования.
-
Оптимизация полимеразной цепной реакции для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы с использованием праймеров, комплементарных генам плазмид вирулентности pXOl и рХ02 возбудителя сибирской язвы.
-
Клонирование фрагментов ДНК сибиреязвенных плазмид pXOl и рХ02, кодирующих гены протективного антигена и капсулообразования, в составе плазмидного вектора pUC19.
1.6. Апробация результатов исследований.
Результаты исследований доложены и обсуждены на заседаниях Ученого Совета ВНИИВВиМ в 1999-2000 г., опубликованы в сборниках материалов научно-практических конференций Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии (Покров 1998, 1999,2000).
-
Публикации по работе. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.
-
Объем и структура работы. Материалы диссертации изложены на 115 страницах машинописного текста и состоят из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, список литературы, содержащий 37 отечественных и 94 зарубежных источников. Диссертация иллюстрирована 12 таблицами и 16 рисунками и 1 приложением.
Исследования по диссертационной работе выполнены в 1997-2000 г.г. в лабораториях "Биофизики" и "Экспериментальной микробиологии» ВНИИВВиМ в соответствии с утвержденными плановыми заданиями НИР Российской академии сельскохозяйственных наук по теме 01.06. "Разработать генно-инженерные и иммунохимические методы идентификации и дифференциации возбудителей оспы овец и коз, чумы мелких жвачных, инфекционной бурсальной болезни, синдрома снижения яйценоскости, африканской чумы свиней, классической чумы свиней, сибирской язвы и листериоза".
![Конструирование и внедрение в практику генодиагностической тест-системы для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы [Электронный ресурс]](/i/i/4289/212277.png "Конструирование и внедрение в практику генодиагностической тест-системы для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы [Электронный ресурс] Тучков Игорь Витальевич")
