Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1. Таксономическое положение и краткая историческая справка изучения возбудителя иерсиниоза 7
1.2. Распространение Yersinia enterocolitica в природе, источники и пути заражения животных и человека 10
1.3. Свойства Yersinia enterocolitica и дифференциация от сходных энтеробактерий 18
1.4. Факторы патогенности Yersinia enterocolitica 25
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 44
2.1. Методы оценки дифференциально-диагностических питательных сред 44
2.2. Методы изучения дифференциально-диагностических признаков культур Y.enterocolitica 47
2.3. Методы определения вирулентности и свойств Y.enterocolitica, связанных с плазмидой вирулентности 54
2.4. Методы определения адгезивности, инвазивности и гемолитической активности 56
2.5. Методы оценки энтеротоксигенности 57
2.6. Методы статистической обработки результатов исследований 59
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 61
3.1. Определение оптимальной дифференциально-диагностической питательной среды для выделения Y.enterocolitica 62
3.2. Сравнительное изучение дифференциально-диагностических признаков культур Y.enterocolitica и сходных энтеробактерий 74
3.3. Определение вирулентности и свойств Y.enterocolitica, связанных с плазмидой вирулентности 87
3.4. Факторы патогенности Y.enterocolitica (адгезивность, инвазивность, энтеротоксигенность) 91
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 106
ВЫВОДЫ 117
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 118
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 119
- Распространение Yersinia enterocolitica в природе, источники и пути заражения животных и человека
- Методы оценки дифференциально-диагностических питательных сред
- Определение оптимальной дифференциально-диагностической питательной среды для выделения Y.enterocolitica
Введение к работе
Актуальность темы. Одной из задач ветеринарной службы является контроль безопасности пищевых продуктов по микробиологическим показателям (СанПиН 2.3.2.1078-01).
В последнее десятилетие ассортимент пищевых продуктов непрерывно расширяется, увеличивается доля импортных основных и вспомогательных материалов, изменяется порядок заготовки сырья для изготовления мясных изделий. При этом холодильная обработка приобретает одно из первостепенных значений, что обусловливает необходимость изучения биологических свойств малоизученных психрофильных микроорганизмов, в частности Yersinia enterocolitica.
Благодаря исследованиям А.Б. Дайтера и соавт. (1987); Н.Ф. Тимченко (1989); Г.В. Ющенко (1989); Ю.Е. Полоцкого (1992); И.В. Смирнова (1992); Г.Г. Гурлевой (1994); Г.Я. Ценевой (1997); В.Ю. Литвина (1999); А.Р. Мав-зютова (2001); R.R. Brubaker (1983); G. Kapperud et al. (1987); R.M. Robins-Browne et al. (1993); B. China et al. (1994); G. Cornelis et al. (1994) и др., доказана роль Y.enterocolitica в этиологии болезней человека, протекающих по типу пищевой токсикоинфекции. Установлено, что генотип патогенных штаммов иерсиний включает хромосомные и плазмидные детерминанты, кодирующие образование факторов патогенности.
Для ветеринарной практики методы выделения Y.enterocolitica и определения патогенности не унифицированы, что приводит к получению противоречивых данных. При проведении эпизоотологических исследований в ряде регионов страны установлено, что микроорганизмы Y.enterocolitica могут явиться этиологическим фактором желудочно-кишечных заболеваний животных раннего постнатального периода. Наряду с этим указанные микроорганизмы чрезвычайно широко распространены в объектах внешней среды (А.Ф. Бабкин и соавт., 1987; А.В. Куликовский и соавт., 1988; Е.А. Кирьянов,
И.И. Савчук, 1989; И.И. Писаренко, 1990; МЛ. Елезов, 1994; B.C. Ефремов, 1995; Л.С. Каврук, 1995; В.А. Сабурин, 1995; В.Г. Скрыпник, А.В. Митрофанов, 1997; К.В. Шумилов, Л.П. Мельниченко, 1998; А.С. Собакин, Л.Ф. Зыкин, 1998; В.К. Тихонов, 1999; Е.М. Ленченко, 2000; З.Ю. Хапцев, 2000; Р.Б. Корочкин, 2003).
Наличие перекрестных серологических реакций Y.enterocolitica 09 с представителями рода Brucella обусловливает получение ложноположитель-ных результатов при исследовании сыворотки крови животных из благополучных по бруцеллезу хозяйств (B.C. Ефремов, 1995; Л.П. Мельниченко и соавт., 2001; Т.С. Астахова, 2002; В.Б. Кузьмина, 2002).
Сельскохозяйственные животные являются основным источником возбудителя инфекции, а продукты животного происхождения — ведущими факторами передачи возбудителя иерсиниоза человеку (Санитарные правила. 3.1.094-96; Ветеринарные правила 13.3.1318-96). В этой связи изучение биологических свойств указанных микроорганизмов представляет социальную значимость. Изыскание эффективных дифференциально-диагностических питательных сред для индикации микроорганизмов Y.enterocolitica в различных объектах, а также научное обоснование определения патогенных свойств эпизоотических штаммов иерсиний, являются актуальными для ветеринарной медицины.
Цель исследований: изучить факторы патогенности для усовершенствования индикации вирулентных штаммов Y.enterocolitica.
Задачи исследований:
Определить оптимальную дифференциально-диагностическую питательную среду для выделения и первичной идентификации Y.enterocolitica.
Изучить морфологические, культуральные, биохимические и антигенные свойства энтеробактерий, выделенных из патологического материала, фекалий поросят и телят, кормов и продуктов животного происхождения.
Изучить чувствительность к антибиотикам и межвидовой антагонизм музейных штаммов и выделенных из различных объектов культур микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae.
Изучить адгезивные и инвазивные свойства Y.enterocolitica.
Подобрать доступный для воспроизведения в практических лабораториях метод определения энтеротоксигенности Y.enterocolitica.
Изучить морфологические изменения в тканях лабораторных мышей при воздействии энтеротоксина Y.enterocolitica.
Научная новизна. Научно обоснованы и предложены методы выявления энтеротоксигенности у культур Y.enterocolitica. Экспериментальными исследованиями установлены критерии оценки вирулентности у выделенных культур Y.enterocolitica. Определен видовой и количественный состав бактерий семейства Enterobacteriaceae, в том числе Y.enterocolitica, выделенных из репрезентативной выборки объектов ветеринарно-санитарного надзора.
Практическая значимость. Установлено, что дифференциально-диагностическая среда с бромтимоловым синим (СБТС) является оптимальной для выделения и первичной идентификации Y.enterocolitica от таксоно-мически близких бактерий по сравнению со средами Эндо, Левина, Плоски-рева, висмут-сульфит агаром.
Для определения энтеротоксигенности культур Y.enterocolitica предложено использовать плантарный тест на лабораторных мышах.
Изданы и внедрены в учебный процесс МГУПБ: методические указания к самостоятельной работе студентов ветеринарно-санитарного факультета по теме «Иерсиниоз как пищевая токсикоинфекция» (М., МГУПБ, 2001).
Апробация материалов диссертации. Основные результаты диссертационной работы доложены и одобрены на заседаниях кафедры инфекционных и паразитарных болезней МГУПБ (Москва, 2001-2003 гг.); международной научно-практической конференции: «Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях» (Воронеж, 2002); 4-ой международной научно-практической конференции: «Актуальные проблемы ветеринарной медицины и ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции» (М., 2002); 2-ой международной научной конференции студентов и
молодых ученых: «Живые системы и биологическая безопасность населения» (М., 2003).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ.
Основные положения, выносимые на защиту:
Сравнительная оценка дифференциально-диагностических питательных сред для выделения Y.enterocolitica.
Видовой состав энтеробактерий, выделенных из объектов ветеринар-но-санитарного надзора.
Характеристика факторов патогенности Y.enterocolitica.
Таксономическое положение и краткая историческая справка изучения возбудителя иерсиниоза
Психротрофные свойства иерсиний способствовали распространению и закреплению их в антропосфере. Данный вид микроорганизмов выделяется практически от всех видов млекопитающих, птиц, рыб, земноводных, моллюсков, насекомых (К.В. Подболотов, B.C. Сурков, 1984; Г.В. Ющенко, 1989; Н.Ф. Тимченко, 1989; В.А. Сабурин, 1995; В.К. Тихонов, 1999; Е. Aldova і dr., 1980; С. Kaneuchi et al., 1989).
Однако помимо способности обитать в окружающей среде, Y.enterocolitica обладают факторами патогенности и могут паразитировать в организме сельскохозяйственных животных.
Иерсиниоз - бактериальная инфекция, характеризующаяся развитием у животных гастроэнтероколита, полиморфизмом клинических признаков с развитием поражений в отдельных органах и длительным бактерионосительством (цит. по I. Bockemuhl, 1995).
О выделении иерсиний от животных в странах Европы, в США, Канаде, Бразилии, Южной и Северной Африке, Японии, странах Ближнего Востока сообщалось в работах ряда исследователей (Е. Aldova і dr., 1980; Т. Inoue, М. Kurose, 1975; Т. Caprioli et al., 1978; К.В. Pedersen, S. Winblad, 1979; S.G. Christensen, 1982; H. Nattermann et al., 1985).
На территории России сообщения о выделении микроорганизмов Y.enterocolitica из аппендикулярного отростка больной, оперированной по поводу предполагаемого хронического аппендицита, появились в конце 60-х годов (М.А. Белова, Г.В. Ющенко, 1968). В настоящее время заболеваемость людей иерсиниозом в Российской Федерации регистрируется постоянно и составляет 3,0 на 100 тыс. населения (Г.Г. Онищенко, 2001). Болеют люди всех возрастов, но заболеваемость детей до 14 лет выше в 3-4 раза.
Среди сельскохозяйственных животных наибольшее количество сообщений о выделении Y.enterocolitica приходится на долю свиней (Г.В. Ющенко, 1989; В.А. Гордейко, 1990; А.С. Собакин и соавт., 1998; Е.М. Ленченко, 2000; З.Ю. Хапцев, 2000; Р.Б. Корочкин, 2003; R. Wooley et al., 1980; X. Наттерман, Ф. Хорш, 1985, 1987; 3. Маркик, 1993; A. Jakubczak, 1995; A. Platt-Samoraj, 1996; J. Pilon et al., 2000).
Особенно восприимчивы к иерсиниозу поросята отъемного возраста. Иерсиниоз у свиней характеризуется полиморфизмом клинических признаков. Болезнь может охватывать большое число животных. Отмечается острое и хроническое течение патологического процесса. При этом повышение температуры тела, диарея, артриты, дерматиты являются ориентировочными признаками при диагностике иерсиниоза свиней (X. Наттерман, Ф. Хорш, 1987; И.И. Савчук, Л.А. Король, 1988).
По сообщению Г.Д. Довгаль (1988), исследование материала, полученного от 100 голов здоровых свиней без видимых поражений внутренних органов, позволило выделить иерсинии в 7,0 % случаев. Частота выделения в группе свиней с различными поражениями печени и брыжеечных лимфатических узлов составила 30,5 %. Отмечено значительное преимущество серо-вара 09 (92,7 %) по сравнению с ОЗ (7,3 %).
В Норвегии из обследованных 99 свиноводческих хозяйств 82,0 % оказались неблагополучными по иерсиниозам. Уровень носительства Y.enterocolitica у свиней в этой стране колебался от 11,1 до 65,5 %. При этом, у 25,0 % носителей выделяли иерсинии из фекалий и у 80,0 % - из миндалин. При исследовании поголовья свиней Дании, Бельгии, Швеции серовар ОЗ наиболее часто выделяли из миндалин и корня языка клинически здоровых свиней (G. Wauters, 1979; К.В. Pedersen, S. Winblad, 1979; S.G. Christensen, 1982).
Некоторые исследователи считают, что микроорганизмы Y.enterocolitica являются комменсалом ротовой полости свиней, так как встречаемость их в мазках с миндалин и языка выше, чем из фекалий и содержимого слепой кишки (С. Goudzwaard, 1973; G. Wauters, 1979; M.J. Yanguela et al., 1987; 3. Маркик, 1993). При изучении иерсиниоза у крупного рогатого скота установлено, что у молодняка болезнь протекает в острой форме с симптомами расстройства желудочно-кишечного тракта, реже — с артритами и бронхопневмониями. У взрослых в большинстве случаев протекает латентно и развивается в форме специфической иммунологической перестройки организма. У небольшой части коров могут наблюдаться маститы, аборты, задержание последа, энтериты. От коров Y.enterocolitica выделяли Т. Inoue, М. Kurose (1975), R. Wooley et al. (1980), E.H. Колос с соавт. (1985), В.А. Гордейко (1990), М.П. Елезов и соавт. (1994); В.А. Сабурин (1995), В.Г. Скрыпник, А.В. Митрофанов (1997), И.В. Етобаев (1998); В.К. Тихонов (1999).
В.Г. Скрыпником и А.В. Митрофановым (1997) при изучении роли Y.enterocolitica в патологии крупного рогатого скота патогенные серовары бактерий были выделены из органов павших животных, телят с признаками диареи, из абортированных плодов, замороженной спермы быков-производителей. При спонтанном заражении иерсиниозом у коров наблюдалась диарея, аборты, рождение мертвого приплода, эндометриты, маститы. У телят иерсиниоз протекал с симптомами расстройства пищеварения, реже с артритами и бронхопневмонией. Авторы считают, что иерсиний являются весомым, но не диагностируемым в практике фактором при абортах и мертво-рождениях крупного рогатого скота.
Методы оценки дифференциально-диагностических питательных сред
Сравнивали ростообеспечивающие и дифференцирующие свойства сред Эндо, Левина, Плоскирева, висмут-сульфит-агара, среды с бромтимоло-вым синим (СБТС) (табл. 3). Исследования проводили в соответствии с «Методическими рекомендациями к контролю питательных сред по биологическим показателям» (1980) и «Инструкцией по бактериологическому контролю диагностических питательных сред для чумного микроба» (1984). Определяли следующие показатели: дифференцирующие свойства, чувствительность питательной среды, скорость роста, ингибирующие свойства, сохранение стабильности биологических свойств культивируемого микроорганизма.
Чувствительность среды определяли по наибольшему разведению, обеспечивающему формирование колоний. Показатель скорости роста определяли по минимальному времени инкубации посевов, за которое наблюдался отчетливый, видимый невооруженным глазом рост культур на всех засеянных чашках.
Для этого готовили взвеси бактерий Y.enterocolitica из суточной агаровой культуры по стандарту мутности (ГИСК им. Тарасевича), что соответствовало 1x109 м.к./мл (первая пробирка) и делали серийные разведения, перенося по 0,5 мл взвеси в 4,5 мл 0,85 %-ного раствора хлорида натрия. Исследования проводили согласно «Методическим рекомендациям по определению общего микробного числа в пищевых продуктах и объектах внешней среды», утвержденным Департаментом Ветеринарии Минсельхозпрода РФ 23 января 1999 г. Высевали по 0,1 мл из 7-й пробирки (100 клеток) и из 6-ой пробирки (1000 клеток) на мембранные фильтры, помещенные на поверхность питательной среды. Культивировали при 28 С, результаты учитывали через 18,24, 48 и 72ч.
Для изучения ингибирующих свойств среды готовили смеси путем соединения по 1 мл взвесей, содержащих 2000 м.к./мл, высевы производили по 0,1 мл на испытуемые среды.
Дифференцирующие свойства выявляли по отношению к культурам E.coli и S.typhimurium.
Сохранение стабильности биологических свойств определяли по морфологическим, культуральным и биохимическим свойствам.
Диагностическая среда признавалась пригодной, если среднее число выросших колоний на чашке Петри при высеве 100 микробных клеток не менее 50. Кроме того, среда должна обладать дифференцирующими свойствами, обеспечивать рост типичных по морфологии колоний и все культуры должны обладать стабильными биологическими свойствами.
Определение оптимальной дифференциально-диагностической питательной среды для выделения Y.enterocolitica
Задачей данного этапа исследований являлся подбор плотной питательной среды, которая могла бы использоваться для выделения иерсиний в ветеринарной практике. Учитывая данные литературы, что иерсиний в большинстве случаев выделяются в ассоциации с другими энтеробактериями, была проведена оценка дифференциально-диагностических питательных сред по биологическим показателям и дифференцирующим свойствам.
Объектом исследований служили культуры Y.enterocolitica, E.coli, S.typhimurium, S.aureus, а также среды Эндо, Левина, Плоскирева, ВСА и СБТС. Результаты исследований представлены в табл. 4.
Основным реактивом среды Эндо являлся основной фуксин, который обесцвечивался в среде при добавлении сульфита натрия (Na2S03). Присутствие в среде этих реагентов оказывало ингибирующее действие на грампо-ложительную микрофлору. Бактерии, способные ферментировать лактозу, изменяли рН среды в кислую сторону, вследствие образования конечного продукта расщепления - ацетилальдегида, который, реагируя с сульфитом натрия, способствовал появлению красного окрашивания.
Через 18 ч культивирования бактериальные клетки Y.enterocolitica формировали круглые, выпуклые, с ровными краями, прозрачные, бесцветные, диаметром 0,2-0,5 мм колонии, 48-часовые культуры приобретали розовый оттенок в центре колоний и увеличивались в размере до 2,0 мм. E.coli росли, образуя круглые, темно-красные или малиновые, диаметром 1,0-4,0 мм колонии; S.typhimurium - прозрачные, слегка голубоватые или светлосерые, диаметром 1,0-4,0 мм (рис. 4, 5).
Дифференцировать иерсиний по характеру роста от лактозоотрица-тельных бактерий и эшерихий со слабой лактозной активностью оказалось затруднительным. Кроме того, иерсиний в первой генерации на среде Эндо росли в виде росинчатых, трудно различимых колоний, и зачастую их рост подавлялся сопутствующей микрофлорой.
