Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
Систематическое положение, морфология и биология шмеля B.terrestris 7
Биология шмелиной семьи Bombus terrestris 9
Микрофлора кишечника шмелей в норме 19
Технология круглогодичного лабораторного разведения шмелей Bombus terrestris 21
Паразитофауна шмелей Bombus terrestris в естественной популяции и в условиях круглогодичного лабораторного разведения их 24
Нозематоз насекомых 30
Формирование микропаразитоцспозов в кишечнике шмелей при нозематозе 38
Заключение 46
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 47
2.1. Материалы и методы исследований 47
2.2 Результаты исследований 50
2.2.1. Микрофлора кишечника шмелей bombus terrestris в естественной популяции в различных регионах европейской части рф и завезенных из голландии 50
2.2.2. Микрофлора кишечника у шмелей bombus terrcstris при круглогодичном лабораторном разведении их для опыления сельскохозяйственных культур закрытого грунта 72
2.2.3. Нозематоз шмелей bombus terrestris 80
2.2.3.1. Особенности эпизоотологии, патогенеза и клиники нозематоза шмелей bombus terrestris, вызванного n. bombi 80
2.2.3.2. Лечение и профилактика ассоциативного заболевания, вызванного паразитированием n. bombi и бактерий, при круглогодичном лабораторном разведеннии шмелей bombus terrestns 85
заключение 95
выводы 96
практические предложения 98
литература 99
- Технология круглогодичного лабораторного разведения шмелей Bombus terrestris
- Микрофлора кишечника шмелей bombus terrestris в естественной популяции в различных регионах европейской части рф и завезенных из голландии
- Особенности эпизоотологии, патогенеза и клиники нозематоза шмелей bombus terrestris, вызванного n. bombi
Введение к работе
Актуальность темы. В технологии получения высоких урожаев сельскохозяйственных культур открытого грунта шмели рода Bombus играют весьма важную роль, осуществляя активное опыление многих растений. В последние годы шмелей рода Bombus начали круглогодично выращивать в лабораторных условиях для опыления ими сельскохозяйственных растений (томатов, перцев, баклажанов и др.) закрытого грунта, что дает надбавку урожая до 15-20% (В.И. Ащеулов, 2002).
В настоящее время в РФ и других странах мира более 25 фирм занимаются лабораторным разведением шмелей Bombus terrestris, которые ежегодно производят около I млн семей. Однако при круглогодичном лабораторном разведении шмелей Bombus terrcstris у них часто возникают инфекционные и инвазионные болезни, которые нередко приводят к гибели насекомых и снижают экономические показатели тепличных хозяйств (В.И. Ащеулов, 2002). В связи с этим остро стоит вопрос выяснения этиологических факторов заразных болезней шмелей, разработки методов диагностики их и мер борьбы с ними в лабораториях по круглогодичному разведению этих полезных насекомых.
Цели и задачи исследований. Целью нашей работы являлась разработка методов профилактики ассоциативного заболевания, вызываемого па-раз итировани ем Nosema bombi и бактерий, у шмелей Bombus terrestris в условиях их круглогодичного лабораторного разведения для опыления сельскохозяйственных культур закрытого грунта. Для чего необходимо было:
определить динамику микрофлоры кишечника у клинически здоровых шмелей Bombus terrestris в естественной популяции в различных регионах Европы и при круглогодичном лабораторном разведении их;
определить зараженность шмелей Bombus terrestris в естественной популяции в различных регионах Европы и в условиях круглогодичного лабораторного разведения их паразитами Nosema bombi;
изучить динамику формирования микропаразитоценозов в кишечнике шмелей Bombus terrestris при нозематозе;
разработать комплексный метод терапии шмелей Bombus terrestris при ассоциативной болезни, вызванной паразитированием Nosema bombi и бактерий.
Научная новизна. Впервые определено, что микрофлора кишечника у шмелей Bombus terrestris в естественной популяции в различных регионах РФ и завезенных из Голландии представлена 42 видами, в том числе микробами из родов Lactobacterium, Bifidobacterium, Bactcroides (до вида не определяли), анаэробами из рода Clostridium, аэробами Proteus (до вида не определяли), грибами из родов Aspergillus, Mucor, Penicillium (до вида не определяли), в том числе непатогенными — 19 и патогенными — 23 видами. Наибольшее число видов (31), в т.ч. числе патогенных видов (19) микробов встречается в кишечнике шмелей Bombus terrestris в естественной популяции Краснодарского края, умеренное число - в Ярославской области (24 и 11 видов), Костромской области (26 и 12 видов), наименьшее число - у завезенных из Голландии (20 и 13 видов).
Установлено, что в естественной популяции шмели Bombus terrestris инвазированы Nosema bombi на 16,77 %, наивысшая ЭИ регистрируется у шмелей в центральном районе Нечерноземной зоны Российской Федерации (Владимирская, Ивановская, Костромская, Ярославская области, ЭИ = 20,26-21,60%). Выявлено, что при инвазии Nosema bombi в кишечнике шмелей формируется микропаразитоценоз., где преобладающими являются патогенные Staph, aureus, Staph, albus, Staph, muscae, Staph, epidermidis, E. coli, Strept. apis, в результате чего возникает ассоциативное заболевание протозойно-бактерийной этиологии.
Разработан комплексный метод терапии шмелей при данной болезни, включающий применение химических препаратов и антибиотиков.
Практическая значимость работы. Научные разработки автора вошли в «Рекомендации по профилактике паразитарных и ассоциированных
заболеваний шмелей Bombus terrestris (L.) в условиях их круглогодичного лабораторного разведения для опыления сельскохозяйственных культур закрытого грунта» (одобрены РАСХН 25 мая 2001 г.), «Рекомендации по профилактике инфекционных болезней Bombus terrestris в условиях их круглогодичного лабораторного разведения для опыления сельскохозяйственных культур закрытого грунта» (одобрены РАСХН 2002г.).
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и одобрены на: научных конференцях ВОГ РАН (Москва, 2002, 2004), научных конференциях Ивановской ГСХА (2004), Костромской ГСХА (2004).
Основные положения, выносимые на защиту:
микрофлора кишечника клинически здоровых шмелей Bombus terrestris в естественных популяциях 6 регионов РФ, а также завезенных из Голландии;
микрофлора кишечника клинически здоровых шмелей Bombus terrestris при круглогодичном лабораторном разведении их;
зараженность шмелей Bombus terrestris Noscma bombi в естественных популяциях 6 регионов РФ и завезенных из Голландии;
микрофлора кишечника шмелей Bombus terrestris при нозематозе;
комплексное лечение шмелей Bombus terrestris при ассоциативной болезни, вызванной паразитированием в кишечнике Nosema bombi и бактерий, при лабораторном разведении насекомых.
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 статьи, которые отражают основное содержание работы.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 110 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических предложений. Работа иллюстрирована 10 таблицами, 10 рисунками. Список литературы включает 142 источника, из них 60 отечественных, 82 иностранных.
Технология круглогодичного лабораторного разведения шмелей Bombus terrestris
Опыты, проведенные О.Ф. Гробовым и др.(1971-1975) по скармлива нию здоровым пчелам различных штаммов бактерий, выделенных из средне го отдела кишечника, показали, что такие виды как Enlerobacter hafnia vas alvei 184, Вас alvei 164, Вас. mesentericus viscosis 48 приводили к гибели здо ровых пчел. Другие виды и их ассоциации или незначительно увеличивали гибель здоровых пчел или не вызывали никакого влияния. Одновре менное скармливание, проведенное Л.Н. Гузевой (1965) пчелам ноземы вместе с бактерией Enlerobacter hafnia vas alvei показало, что при введении их в организм здоровых пчел они обнаруживаются в крови на 12 день.
Микологическое изучение кишечника пчел П. Агаке и М. Марин (1965), привело к изолированию 19 штаммов микофитов от здоровых пчел (12 дрожжей и 7 нитчатых плесеней). Нитчатые плесени принадлежали родам Aspergillus (A. niger), Penicillium , Ascosphaera (A. apis). Дрожжи, принадлежащие родам Torulopsis, Candida.
О.Ф. Гробов и др.(1965) проводили скармливание пчелам некоторых видов грибов совместно со спорами ноземы. Это показало, что апатогенные штаммы Asp. flavus и Penicillium sp. не оказывают существенного влияния на гибель здоровых пчел. Апатогснный штамм Asp. niger и патогенные штаммы Asp. niger и Asp.fumigatus вызывают высокую гибель здоровых пчел.
Технология круглогодичного лабораторного разведения шмелей Bom bus terrestris. В России шмели многие годы были объектами изучения в связи с их ролью в перекрестном опылении растений и возможности их одо-машниваїгия. Достижения российских ученых в разведении шмелей и шмеле-опылении не были своевременно востребованы сельскохозяйственным производством (М.В. Березин, В.Б. Бейко,1997). Л.А.Долгов (1982), А.Н. Кобзев (1982,1991) применяли метод принудительного гнездования в лабораторных условиях отловленных в природе маток шмелей В. tcrrcstris с сохранением им свободы вылета для сбора корма. Оригинальные исследования по изучению комплекса условий, обеспечивающих успешную закладку гнезд матками шмелей В. terrestris в лаборатории были проведены в Новосибирске (Д.В. Речкин и Л.Л Долгов, 1984) и Киеве (Л.И. Боднарчук, 1982; И.И. Шалимов и Т.Д. Петриченко, 1989). Успешные эксперименты по вольерному разведению шмелей и их использованию для опыления селекционных линий новых сортов люцерны проводились в теплицах Всесоюзного института кормов в Московской области М.В. Березины м (1997). В разные годы XX столетия в России {Москва, Санкт-Петербург, Новосибирск) отдельным специалистам и небольшим научным группам удавалось более или менее успешно получать в лаборатории и на специальных участках семьи шмелей и использовать их для опыления культур (М.В. Березин, В.Б. Бейко,1997).
Успех круглогодичного лабораторного разведения шмелей Bombus terrestris стал возможным после выяснения действия углекислого газа на овогенез маток шмелей (Л.И. Боднарчук, 1982; P.-F ROseler, 1984), позволившее круглогодично и управляемо получать от них потомство (В.Г.Радченко, Ю.А.Песенко,1994), На этой основе со второй половины 1980 - начала 1990 гг. отрабатывалась технология промышленного разведения шмелей в ряде стран мира.
(W.Newman, 1851) с 1798 по 1848 годы исследовал поведе ниє рабочих и молодых репродуктивных особей шмелей., для чего использовал маленькие ящики, в которые он ночью помещал заранее найденные гнезда. К концу XIX века Хофферу (E.Hoffer, 1882) впервые удалось заставить самку шмеля основать гнездо в искусственных условиях. Слэйдан (F.W.L.SIaden,I912) и Линд-хард (E.Lindhard, 1912) провели серию удачных экспериментов по основанию самками шмелей гнезд в искусственных условиях и добились создания ими развитых семей. В Европе конец 80-х годов был ознаменован созданием в Нидерландах высокоэффективной технологии круглогодичного разведения шмелей, взятой за основу многими фирмами-производителями шмелей. Это позволило широко использовать шмелей в теплицах (J. Eijnde, 1990). В на 23 плицах (J. Eijnde,1990). В настоящее время в мире 25 фирм производят около 500000 семей шмелей Bombus terrestris (М.В. Березин, В.Б. Бейко,1997).
Впервые в России в «Совхозе Тепличный» Ивановской области с 1993 года В.И. Ащеулов, В.А. Пономарёв, П.И. Рупасов и др, провели исследования по разработке отечественной технологии круглогодичного лабораторного разведения шмелей с использованием их местных популяций, отечественного оборудования и материалов. На основании проведенных исследований в лаборатории таких видов шмелей, как В. agromm, В. lucorum, В. lapidaries, В. derhamellus, В. hypnorum, Bombus terrestris в целях «доместикации» их для дальнейшего изучения и размножения был выбран вид Bombus terrestris — большой земляной шмель. Он не агрессивен, семья этого вида формирует компактное гнездо и дает многочисленное потомство (700-1000) рабочих особей, участвующих в летно-опылителыюй деятельности, развитие семьи после периода лабораторного разведения продолжается на пыльце одного вида растений в присущих для теплиц температурно-влажностного режима. На основании проведенных исследований была создана отечественная технология круглогодичного управляемого разведения шмелей В. terrestris местной популяции на промышленной основе (защищена 15 патентами РФ).
Весь процесс искусственного разведения шмелей В. terrestris в лабораторных условиях «Совхоза Тепличный» имеет несколько этапов: отлов маток шмелей в природе в весенний период, транспортировка в лабораторию, посадка маток в садки и карантинные мероприятия, развитие шмелиной семьи, подготовка шмелиных семей к эксплуатации в теплицах, воспроизводство, преодоление диапаузы самок шмелей В. terrestris, длительное хранение маток шмелей В. terrestris. Для каждого этапа разработаны и осуществлены мероприятия по созданию и поддержанию условий температуры и влажности, соответствующих физиологическим потребностям самок шмелей и развивающихся семей (Ю.Ф. Петров, Гудкова А.Ю, В.И. Ащеулов, 2003).
Возникающие при импорте шмелей проблемы (завозят неспецифических комменсалов и патогенов шмелей) могут быть решены только при соз 24 даний отечественного производства семей шмелей на основе наиболее обычных в Европейской части России видов (MB. Березин, В.Б. Бейко,1997).
Микрофлора кишечника шмелей bombus terrestris в естественной популяции в различных регионах европейской части рф и завезенных из голландии
Микрофлора кишечника насекомых - опылителей растений определяется состоянием окружающей среды и способом питания их. Так, по данным A.D.Brian (1951), О.Ф. Гробова (1965,1971,1973), П. Агаке, М. Марин (1965) и других, микрофлора кишечника медоносной пчелы в различные периоды летнего сезона зависит от объектов фуражирования насекомых (сбор пыльцы и нектара), состояния загрязненности внешней среды. В тоже время в период зимовки (в условиях Нечерноземной зоны РФ — в октябре — марте) микрофлора кишечника пчел остается стабильной. Что же касается шмелей Bombus terrestris, микрофлора кишечника этих насекомых - хороших опылителей растений практически не изучена.
Наши исследования, проведенные с 1999-2003 гг., свидетельствуют, что в лётный период (с мая по сентябрь) микрофлора кишечника шмелей Bombus terrestris в различных регионах европейской части РФ и завезенных из Голландии является относительно стабильной, она меняется от объекта (растения) фуражирования насекомых. Так, у шмелей Bombus terrestris, выловленных из естественной популяции в Краснодарском крае, мы изолировали 31 вид микробов, в том числе патогенных - 19 видов, во Владимирской области - соответственно - 28 и II видов, Ивановской области - 29 и 16 видов, Костромской области -26 и 12 видов, Смоленской области - 22 и 11 видов, Ярославской области - 24 и 11 видов, завезенных из Голландии - 20 и 13 видов, полученных из лаборатории шмелеводства «Совхоза Тепличный» - 27 и 14 видов (табл.1 и 2).
70 Следовательно, наибольшее число видов микроорганизмов, в том числе патогенных регистрируется у шмелей в Краснодарском крае (соответственно 31 и 19 видов), умеренное число - в Ярославской области (24 и 11 видов), Костромской области (26 и 12 видов), наименьшее число - у завезенных из Голландии - (20 и 13 видов). Данные явления мы объясняем тем, что в южных регионах РФ объектами фуражирования шмелей является большой круг растений, на котором, кроме шмелей, фуражируются и другие виды насекомых, что способствует широкому обмену микробами между ними.
Во всех исследованных регионах постоянными обитателями кишечника шмелей Bombus terrcstris ЯВЛЯЕОТСЯ лактобациллы, бифидобактерии, бактероиды (до вида мы их не определяли). В кишечнике шмелей, кроме перечисленных групп микробов постоянно присутствуют непатогеиные Strept. faecalis, Strept. jodophilus, Bact. agropyri, Bact. antirrhini, Bact. ciirimaculans, Bact. dahliae, Bact. gladioli, Bact. lycopersici, Bact. ciirimaculans, Bact. dahiiae, Bact. gladioli, Bact. lycopersici, Bact. manitopoeum, Bact. medicaginis, Bact. mclophtorum, Bact. pollacii, Bact. pnmi, Bact. stewarti, Bact. trifoliorum, Bact vesicatorium, Bact. woodsii, Вас. maidis, Вас. insidiosum (табл. I и 2). Полученные данные позволяют считать, что лактобациллы, бифидобактерии, бактероиды и перечисленные выше виды являются облигатной микрофлорой кишечника шмелей Bombus terrestris.
В исследованных регионах факультативная микрофлора кишечника у шмелей Bombus terrestris представлена следующими условпопатоген-ными и патогенными видами Staph, aureus, Staph, albus, Staph, muscae, Staph, saprophytics, Staph, epidermidis, Staph, cereus flavus, Strept. cinereus, Strept. citrovorus, Strept. apis, Strept. bombycis, Strept. disparis, Strept. epidermtcus, Strept. pyogenes, Bact. tumefaciens, Вас. alvci, Вас. subtilis, Вас. loxosus, Вас. mesenthericum, Вас. megathericus. Патогенность перечисленных видов микробов для белых мышей при внутрибргошном введении колеблется в пределах 6,25-100,0%.
Наибольшее число (19) видов патогенных микробов регистрируется в кишечнике шмелей Bombus terrestris в естественной популяции в Краснодарском крае, умеренное - (13) у завезенных из Голландии, наименьшее - (11) во Владимирской, Ярославской и Смоленской областях.
Во всех регионах в кишечнике шмелей Bombus terrestris наиболее патогенными являюгея Staph, aureus, Staph, albus, Staph, muscac, Strept. apis, Strept. disparis, Strept. cpidermicus, Strcpt. pyogenes, Вас. alvei, умереннопато-геиными - Staph, epidermidis, Staph, saprophytics, Strept. bombycis, Вас. subilis, слабонатогенными - Staph, cereus flavus, Bact. tumefaciens, Strept. cinereus, Strept. citrovorus.
Из кишечника шмелей Bombus terrestris мы изолировали и изучили 156 культур Е. coli, которых по О-антигену отнесли к серовариантам 08, 015, 086, 0117. Наиболее патогенными для белых мышей являются серогруппы 08, 015 (33,3 - 100% гибель белых мышей), Е. coli 086 (38,46 - 100% гибель), слабо патоген ной - Е. coli — 0117 (25,0 - 62,5% гибель белых мышей). Наиболее патогенные серогруппы Е. coli регистрируются в естественных популяциях во Владимирской области и Краснодарском крае, умереннопато-генные - в Ивановской области и завезенные из Голландии, слабопатогенные - в Костромской и Смоленской областях (табл.3).
Особенности эпизоотологии, патогенеза и клиники нозематоза шмелей bombus terrestris, вызванного n. bombi
Нозематоз насекомых (медоносной пчелы, шмелей) является широко распространенным заболеванием на территории Европы, Азии, Африки, Северной и Южной Америки. Причем, у каждого вида насекомых имеется свой специфический возбудитель, но многие исследователи не исключают возможности перекрестного заражения различными возбудителями (НJ.Lin, 1973; D.V. Alford, 1975; П.С. Горбунов, 1987; О.Ф. Гробов и др., 1982; J. Van Den Eijnde, Vctte N., 1993; О.Ф. Гробов, A.H. Сотников, 1998;.B. И. Ащеулов, 2000,2001,2002; АЛО. Гудкова, Ю.Ф. Петров, В.И. Ащеулов, 2003 и др.). Наши исследования, выполненные в 1999-2003 гг., показали, что в естественной популяции шмели Bombus terrestris заражены N. bombi в среднем на 16,77% при интенсивности инвазии по 1-19 экз. спор паразитов в помете в поле зрения микроскопа (табл. 5). Наивысшая ЭИ и ИИ шмелей нозематозом регистрируется в центральном районе Нечерноземной зоны Российской Федерации (Владимирская, Ивановская, Костромская, Ярославская области, ЭИ = 20,26-21,60%), умеренная - в южном районе Нечерноземья РФ (Смоленская область, ЭИ = 17,63%), наименьшая — в Краснодарском крае (ЭИ = 4,39%) и у шмелей, завезенных из Голландии (5,39%).
Бактериологические исследования показали, что качественный состав микрофлоры кишечника шмелей Bombus terrestris, инвазированных N. bombi, существенно отличается от таковых у насекомых, свободных от возбудителя нозематоза (табл.6). Из таблицы 6 видно, что в кишечнике инвазированных N. bombi шмелей преобладают патогенные для белых мышей Staph, aureus, Staph, albus, Staph, ccreus flavus, Staph, saprophyticus, Staph, muscae, Staph, epidcrmidis, Strept. apis, Strept. bombycis, Strept. disparis, Strept. cpidermicus, Strept. pyogenes, E. coli серогрупп 08, 015, 086, О 117, Вас. alvci (табл.6). Следует отметить, что культуры патогенных микробов, изолированные из кишечника свободных от N. bombi шмелей Bombus terrestris в естественной популяции, при внутрибрюшинном заражении вызывали гибель белых мышей в основном (80% и более процентов лабораторных животных) при дозе 1млрд. микробных тел, а остальные культуры (менее 20%) вызывали гибель мышей при дозе 500 млн. микробных тел. Тогда как у инвазирован-ных N. bombi шмелей до 70% патогенных культур микробов вызывали гибель мышей при дозе 500 млн. микробных тел, а остальные 30% культур — при инъекции дозы 1 млрд. микробных тел.
Следовательно, при инвазии N. bombi в кишечнике шмелей, во-первых, увеличивается число патогенных микробов и они здесь становятся доминирующими; во-вторых, у патогенных микробов значительно возрастает вирулентность. На основании полученных данных можно заключить, что при заражении N. bombi в кишечнике шмелей Bombus terrestris формируется микропаразитоценоз с преобладанием здесь высокопатогенных бактерий, в результате чего развивается ассоциативное заболевание протозойно-бактерийной этиологии.
У больных ассоциативной болезнью маток, рабочих особей и трутней шмелей Bombus terrestris брюшко увеличено, мягкое, растянутое. При вскрытии кишечник увеличен, беловато-серого цвета. Шмели вялые, слабо реагируют на внешние раздражения. Больные матки шмелей не закладывают гнездо. Трутни теряют способность к осеменению. Рабочие особи малоактивны, они не способны летать. При круглогодичном лабораторном разведении больные семьи шмелей погибают. Так, в условиях лаборатории шмелеводст-ва в начальный период работы (в 1993-1996 гг.) смертность маток шмелей от этой болезни составила 15-20%, в 1997-2001 гг. - 2-5%, начиная с 2001 года по настоящее время (2003г.) - менее одного процента (В.И. Ащеулов, 2002 и др.).
Диагноз на нозематоз ставится на основании анализа эпизоотологиче-ских, клинических данных, обнаружении спор ноземы в помете насекомых. При вскрытии погибших или больных шмелей мы регистрировали потемнение стеиок кишечника, при микроскопировании помета или содержимого кишечника находили много спор ноземы, а также мелкие зерна не переваренной цветочной пыльцы.
