Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Озон, его свойства и методы получения 8.
ГЛАВА II. Механизм действия озона на микроорганизмы 12.
ГЛАВА III. Бактерицидное действие озона 19.
ГЛАВА IV. Применение озона для повышения качества и увеличенилсроков хранения мяса и мясных продуктов 30.
ГЛАВА V. Материалы и методы 36.
5.1. Озонаторы и техника озонирования 36.
5.2. Методы изучения влияния озона на популяции микробных клеток 41
5.3. Метод определения бактерицидной активности озона 44.
5.4. Изучение действия озона для стерилизации инструментария 46.
5.5. Метод определения устойчивости к озону конструктивных материалов 47.
5.6. Микробиологические методы исследований при проведении производственных испытаний 48.
5.7. Методы исследования мясного сырья 49.
ГЛАВА VI. Изучение влияния озона на популяцию микробных клеток 52.
6.1. Электронно-микроскопическое исследование популяции микроорганизмов после воздействия озоном 52.
6.2. Изучение биологических особенностей популяции микроорганизмов после воздействия озоном 53.
ГЛАВА VII. Изучение бактерицидной активности озона при обеззараживании поверхностей 64.
ГЛАВА VIII. Применение озона для стерилизации инструментария 67.
ГЛАВА IX. Определение устойчивости к озону ряда конструктивных материалов 71.
ГЛАВА X. Изучение изменения концентрации озона в воздушной среде замкнутых пространств 74.
10.1. Изучение остаточной концентрации озона 74.
10.2. Интенсификация процесса разложения озона 79.
ГЛАВА XI. Проведение производственных испытаний 83.
11.1. Применение озона для обработки холодильных камер 83.
11.2. Применение озона для обработки камеры дефростации 85.
11.3. Применение озона в отделении расфасовки мясного сырья 86.
11.4. Применение озона для обработки сырьевого отделения цеха копченостей 88.
11.5. Изучение влияния озона на санитарные и качественные показатели мясного сырья 89.
Обсуждение результатов 97.
Выводы 107.
Предложения для практики 109.
Список литературы по.
Приложения 130.
- Применение озона для повышения качества и увеличенилсроков хранения мяса и мясных продуктов
- Изучение биологических особенностей популяции микроорганизмов после воздействия озоном
- Интенсификация процесса разложения озона
- Применение озона в отделении расфасовки мясного сырья
Применение озона для повышения качества и увеличенилсроков хранения мяса и мясных продуктов
Озонирование является одним из перспективных методов санитарной обработки мяса, как наиболее эффективный способ обеззараживания пищевых продуктов.
Бактерицидное действие озона на поверхности мяса колеблется в значительных пределах, что определяется многими факторами: временем проведения обработки, состоянием мяса, продолжительностью действия и др.
Для выяснения этого вопроса Тардатьяном Г.А., Ким СЕ. и Кривопишиным И.П. (1988) были проведены исследования обработки тушек птицы в различных режимах, в различные периоды и при различном состоянии мяса озоном. В результате было выяснено, что обработка озоном в концентрации 0,1-0,9 мг/л, при температуре 1-4 С в течение 1-5 ч обеспечивает полное уничтожение мезофильной и холодоустойчивой микрофлоры на поверхности мяса, высокую степень сохранения его питательных и вкусовых свойств и повышения сроков хранения в охлажденном состоянии более чем в 5 раз. Наиболее выраженный бактерицидный эффект проявляется после созревания мяса, что связано с действием озона на вегетативные формы микроорганизмов (66).
По результатам исследований был разработан и испытан способ санитарной обработки тушек цыплят-бройлеров непосредственно перед охлаждением или в процессе его газообразным озоном в дозе 0,1-0,9 мг/л в час. При этом отмечено, что обработка мяса озоном обеспечивает сохранение питательных и вкусовых качеств продукта. Особенно отчетливо это проявлялось по таким показателям, как нежность, сочность и последующая влагоемкость мяса.
Известно, что замораживание и последующая дефростация тушек приводит к снижению влагоемкости мяса, его питательных и вкусовых качеств. Применение озона при обработке мяса позволяет сохранять его длительное время без глубокого замораживания в охлажденном состоянии. Кроме того, как показали исследования проведенные Игнатьевой А.Д., Тишенковой А.Н. и Кривопишиным И.П. (1988), озонирование способствует улучшению биологической ценности мяса. При проведении химического анализа было выяснено, что озонирование не оказывает существенного влияния на химический состав мяса. Но в то же время в мясе происходит уменьшение содержания протеина, жира, меди и марганца (66).
Отмечено, что мясо, подвергнутое озонированию, содержит меньше аминокислот по сравнению с неозонированным, при этом отношение незаменимых к заменимым аминокислотам практически не изменяется. Увеличение содержания аминокислот в неозонированном мясе может быть связано с распадом собственных белков под влиянием ферментативных процессов, тогда как озон препятствует их расщеплению и накоплению свободных аминокислот.
Кроме того, озонированное мясо содержит больше ненасыщенных жирных кислот, главным образом линолевой кислоты, что в свою очередь влечет за собой повышение отношения ненасыщенных к насыщенным жирным кислотам в озонированном мясе по сравнению с неозонированным. Обладая консервирующими свойствами, озон предотвращает окисление ненасыщенных жирных кислот в мясе и тем самым повышает его биологическую ценность.
Обработка мяса озоном практически не влияет на его качественные показатели в процессе хранения. Результаты исследований показали, что качество мяса, обработанного озоном по сравнению с неозонированным, при хранении в течение 30 дней при температуре 4С существенно не изменилось (66). Озон можно применять и при длительном хранении мяса. При этом наибольший эффект достигается только при использовании холода (75). Впервые озон был применен при длительном хранении мяса в 1909 г. в Кельне (Германия). В дальнейшем применение озона при хранении мяса в холодильниках стало распространяться в Англии, Франции, США и других странах.
Известно, что французская фирма «Депермон» использует озонирование для хранения пищевых продуктов в холодильных установках, на судах, на складах, на заводах, выпускающих пищевые продукты.
Японские фирмы «Мицубаси-электрик» и «Фудзи-электрик» выпускают озонаторы, которых широко применяют при хранении мяса и колбасно-ветчинных продуктов. В каталогах фирмы отмечается, чтэ озон обладает сильным бактерицидным действием, после обработки продуктов питания не остается неприятного привкуса и запаха.
Фирма «Стал» в Италии применяет озонирование с использованием холода на рефрижераторных судах и гарантирует при этом сохранность скоропортящихся продуктов, главным образом мяса, рыбы, молока, яиц и др. Эффект озонирования определяется длительностью действия и концентрацией озона. По данным литературных источников (66), наиболее оптимальные параметры озонирования при хранении охлажденного мяса находятся в пределах 10,0 ±3,0 мг/м при экспозиции 2-3 ч в сутки. Применение более высоких доз озона приводит к окислению пигментов, в результате разрушения двойных связей в их молекулах, что вызывает обесцвечивание мяса. Наилучший эффект озона проявляется, когда его действие совпадает с периодом лаг-фазы развития бактерий и созревания мяса. Хранение мяса птицы при постоянном и периодическом воздействии озона (3 ч/сут) в концентрации 8-12 мг/м способствует предотвращению плесневения, порчи и лучшему сохранению питательных и вкусовых свойств. Срок хранения мяса в охлажденном и замороженном состоянии при этом увеличивается в 2-3 раза.
Изучение биологических особенностей популяции микроорганизмов после воздействия озоном
Использование озона в различных отраслях пищевой промышленности в последнее время находит все большее применение благодаря своим преимуществам перед традиционными способами дезинфекции.
Впервые озон стали использовать как средство для обеззараживания питьевой воды и воздуха от патогенной микрофлоры, предложенное еще в 1874 г. профессором А.П. Доброславиным. В 1886 г. Н.К. Келдыш, основываясь на проведенных исследованиях по изучению бактерицидного действия озона, рекомендовал его как высокоэффективное дезинфицирующее средство. Многочисленные исследования озонирования особенно широко развернулись уже в XX веке и его начали использовать в различных отраслях перерабатывающей промышленности и медицине (66).
По своим физико-химическим свойствам озон представляет собой газ светло-голубого цвета с характерным острым запахом. Озон образуется из кислорода, поглощая тепло, и при разложении переходит в кислород, выделяя тепло. Основными свойствами озона следует считать его нестойкость, способность быстро разлагаться и высокую окислительную активность (78, 142, 164, 166).
В настоящее время, несмотря на большое количество исследований, механизм биологического действия озона еще не достаточно раскрыт. Вместе с тем накоплены данные об озоночувтвительности многих микроорганизмов различных таксонометрических групп (4, 17, 30, 70, 90, 121, 122, 137, 145, 163, 178, 179,204).
Возрастающее стремление использования озона требует для обоснования возможностей его применения проведения фундаментальных исследований. В связи с этим, на первом этапе работы нашей задачей являлось изучение механизма действия озона на микроорганизмы.
В последнее время одним из новых направлений в изучении поведения микроорганизмов стал популяционный подход, который основывается на исследованиях колоний бактерий. Общеизвестно, что многие патогенные и условно-патогенные микроорганизмы способны существовать и развиваться на объектах внешней среды, где они образуют колонии со сложными межклеточными связями и внешним покровом, защищающим клетки от воздействия неблагоприятных факторов (72, 102, 104, 148, 169). В этой связи, изучение влияния на микроорганизмы различных дезинфицирующих средств и других факторов следует проводить, используя не суспензии отдельных клеток, где они лишены естественной защиты, а колонии бактерий (98).
При изучении влияния озона на популяцию микроорганизмов применяли методику воздействия дезинфицирующих средств на колонии бактерий с использованием двойных мембранных фильтров с различным диаметром пор, помещенных на поверхность плотной питательной среды. Данная методика является модифицированной нами, поскольку в существующем стандартном методе изучение воздействия любых химических агентов проводится путем добавления их растворов в суспензию микроорганизмов. Учитывая, что в качестве дезинфицирующего средства в наших исследованиях применялся газообразный озон и при использовании такого метода не возможно получить объективной оценки его действия на популяции микроорганизмов, воздействие озоном проводили на изолированные колонии бактерий, культивированных на мембранных фильтрах, помещенных на поверхность плотной питательной среды.
В процессе исследования морфологии клеток в популяции изучаемых микроорганизмов после воздействия озоном методом сканирующей электронной микроскопии были выявлены основные стадии гетероморфного роста, описанные рядом авторов при воздействии на микроорганизмы различных химических агентов (98, 103, 118, 169).
Следует отметить, что в контрольных образцах изучаемых микроорганизмов на поверхностях колоний закономерно определялись покровы, которые имели вид пленок и повторяли очертания клеток. Наличие покровов рассматривают как морфологическую особенность, представляющее собой внеклеточное образование, играющее важную роль в существовании популяции и обеспечивающее защиту клеток от воздействия различных неблагоприятных факторов, а также устойчивость микроорганизмов ко многим дезинфекционным средствам.
При изучении популяции Е. coli и S. typhimurium после обработки озоном в концентрации 250 мг/м наблюдали частичное разрушение покровов на поверхности колоний. В этих участках выявлена деформация клеток, что свидетельствует о дефектности клеточной стенки. Подобные данные по механизму действия озона на микробные клетки приводятся другими исследователями (64, 66, 141, 145), которые считают, чтс при воздействии озоном в первую очередь нарушается целостность поверхностных структур клетки. Наблюдаемое нами увеличение клеток в 1,5-2 раза после озонирования можно объяснить образованием активированного кислорода и перекисных соединений, которые инициируют процесс активизации каталазы. При исследовании колоний бактерий после обработки озоном в концентрации 500 мг/м нами отмечены более глубокие изменения микроорганизмов в популяции, основная часть которой была представлена клетками сферопластного и протопластного типа. Кроме того, наблюдали формирование нитевидных структур, являющихся остатками лизированных клеток, объединенных спавшимися элементами покровов полисахаридной природы, которые представляют собой чехлы, содержащие гетероморфные клетки различной величины, включая L-формы. При исследовании популяции после озонирования также отмечено образование мелких, извитых, палочковидных форм клеток, которые могут быть рассмотрены как клетки-ревертанты. Полагают, что способность клеток к реверсии составляет характерную особенность гетероморфного роста бактерий (72, 98, 104, 118).
Изучение биологических свойств культур микроорганизмов, обработанных озоном в бактериостатических концентрациях (250 и 500 мг/м3), подтвердило их жизнеспособность с сохранением биохимических, антигенных и патогенных свойств, а также способность образовавшихся L-форм реверсировать в исходное состояние при попадании в благоприятные условия существования. При этом все же необходимо отметить, что для их реверсии требовалось длительное культивирование и у всех реверсированных культур отмечена замедленная способность утилизировать цитраты, что говорит о снижении их ферментативной активности.
Интенсификация процесса разложения озона
Как известно, озон является сильным окислителем, поэтому разрабатываемые процессы дезинфекции могут быть применены только в тех отраслях пищевой промышленности, где используется производственное оборудование, изготовленное из коррозионно-стойких материалов или материалов, имеющих антикоррозионное покрытие (32).
Принимая во внимание разрабатываемые нами режимы дезинфекции, для определения устойчивости к озону ряда конструктивных материалов была испытана концентрация 20-25 мг/м при экспозиции 24 часа. Проведенными исследованиями установлено, что озон в указанном режиме не обладает коррозионной активностью по отношению к испытываемым маркам стали (М-45, IV-09 Г2) и алюминиевым сплавам (АМГ-2М, АМГ-6, 1915-Т). Полученные нами результаты согласуются с данными литературных источников (78, 142, 152). Обработка озоном при данных концентрации и экспозиции не оказывает влияния на изделия из синтетических прорезиненных материалов и пластмассы, в то время как натуральная резина не обладает устойчивостью к озону.
Озон относится к тем веществам, использование которого важно контролировать в процессе его применения как в области высоких, так и низких концентраций. Однако применяемые в настоящее время методы измерения являются трудоемкими, а приборы для проведения анализог озона достаточно дороги по своей стоимости, и поэтому не всегда находят место на производстве. Так, нами для оценки остаточной концентрации озона в обрабатываемом помещении проведены испытания по определению реальных концентраций озона в замкнутом пространстве в зависимости от производительности применяемых озонаторов и объема обрабатываемого помещения. Полученные данные позволили составить таблицы со значениями реальных концентраций озона для помещений различного объема за время работы приборов и использовать результаты проведенных исследований в производственных условиях для предварительного расчета рабочей концентрации озона.
Применение процессов озонирования в крупномасштабном производстве и использование озона в значительных объемах требуют эффективного разложения озона, так как сила его антисептического действия обусловлена не самим озоном, а кислородом, образующемся при его распаде (89, 133, 170). Естественное разложение озона происходит очень медленно, поскольку период полураспада озона в воздухе при его концентрации ниже 1 % составляет 16 часов. Согласно данным литературы, озон разлагается под влиянием многих факторов - температуры, света, влажности, а так же под действием некоторых катализаторов, таких, как гидроокиси щелочных металлов, уголь, никель-серебрянные смеси, окислы металлов и др. (78, 142, 156, 195).
При проведении исследований по интенсификации процесса распада озона в качестве инициаторов разложения нами были использованы УФ-излучение и механическое перемешивание воздуха при помощи вентиляторов, поскольку данные способы являются наиболее доступными в производственных условиях и не требуют больших затрат как в материальном плане, так и в плане затрат ручного труда. Полученные результаты исследований показали возможность применения УФ-излучения и механического перемешивания воздуха внутри помещений для интенсификации процесса разложения озона. При этом скорость разложения озона сокращается в 1,5-2 раза. Так, при воздействии УФЛ (лампа ДБ-60) разложение озона при концентрации 65 мг/м происходило в течение 17 минут, в то время как для естественного распада требовалось 35 минут. При механическом перемешивании воздуха с помощью вентиляторов озон в концентрации 30 мг/м распадался за 17 минут, при контроле в 27 минут.
Основываясь на проведенных лабораторных исследованиях, на заключительном этапе работы нами проведены испытания разработанных режимов применения озона в производственных условиях. Испытания проведены в различных регионах РФ (г. Москва, г. Якутск) на объектах мясоперерабатывающей промышленности (холодильные камеры, камеры дефростации, отделение расфасовки мясного сырья, сырьевое отделение цеха копченостей), как в присутствии мясного сырья, так и без него.
Для достижения положительного результата озонирования в первую очередь, базируясь на данных составленных таблиц, определяли концентрацию озона, которую может дать озонатор в обрабатываемом помещении за определенный период времени. Принимая во внимание результаты исследований по изучению бактерицидной активности озона на различных поверхностях, подбирали экспозицию обработки, при которой возможно получение положительных результатов при проведении дезинфекции, с учетом природы материалов, использованных при строительстве обрабатываемого объекта или изготовлении оборудования, находящегося внутри помещения.
Применение озона в отделении расфасовки мясного сырья
В последнее время одним из новых направлений в изучении поведения микроорганизмов стал популяционный подход, который основывается на исследованиях колоний бактерий. Общеизвестно, что многие патогенные и условно-патогенные микроорганизмы способны существовать и развиваться на объектах внешней среды, где они образуют колонии со сложными межклеточными связями и внешним покровом, защищающим клетки от воздействия неблагоприятных факторов (72, 102, 104, 148, 169). В этой связи, изучение влияния на микроорганизмы различных дезинфицирующих средств и других факторов следует проводить, используя не суспензии отдельных клеток, где они лишены естественной защиты, а колонии бактерий (98).
При изучении влияния озона на популяцию микроорганизмов применяли методику воздействия дезинфицирующих средств на колонии бактерий с использованием двойных мембранных фильтров с различным диаметром пор, помещенных на поверхность плотной питательной среды. Данная методика является модифицированной нами, поскольку в существующем стандартном методе изучение воздействия любых химических агентов проводится путем добавления их растворов в суспензию микроорганизмов. Учитывая, что в качестве дезинфицирующего средства в наших исследованиях применялся газообразный озон и при использовании такого метода не возможно получить объективной оценки его действия на популяции микроорганизмов, воздействие озоном проводили на изолированные колонии бактерий, культивированных на мембранных фильтрах, помещенных на поверхность плотной питательной среды.
В процессе исследования морфологии клеток в популяции изучаемых микроорганизмов после воздействия озоном методом сканирующей электронной микроскопии были выявлены основные стадии гетероморфного роста, описанные рядом авторов при воздействии на микроорганизмы различных химических агентов (98, 103, 118, 169).
Следует отметить, что в контрольных образцах изучаемых микроорганизмов на поверхностях колоний закономерно определялись покровы, которые имели вид пленок и повторяли очертания клеток. Наличие покровов рассматривают как морфологическую особенность, представляющее собой внеклеточное образование, играющее важную роль в существовании популяции и обеспечивающее защиту клеток от воздействия различных неблагоприятных факторов, а также устойчивость микроорганизмов ко многим дезинфекционным средствам.
При изучении популяции Е. coli и S. typhimurium после обработки озоном в концентрации 250 мг/м наблюдали частичное разрушение покровов на поверхности колоний. В этих участках выявлена деформация клеток, что свидетельствует о дефектности клеточной стенки. Подобные данные по механизму действия озона на микробные клетки приводятся другими исследователями (64, 66, 141, 145), которые считают, чтс при воздействии озоном в первую очередь нарушается целостность поверхностных структур клетки. Наблюдаемое нами увеличение клеток в 1,5-2 раза после озонирования можно объяснить образованием активированного кислорода и перекисных соединений, которые инициируют процесс активизации каталазы. При исследовании колоний бактерий после обработки озоном в концентрации 500 мг/м нами отмечены более глубокие изменения микроорганизмов в популяции, основная часть которой была представлена клетками сферопластного и протопластного типа. Кроме того, наблюдали формирование нитевидных структур, являющихся остатками лизированных клеток, объединенных спавшимися элементами покровов полисахаридной природы, которые представляют собой чехлы, содержащие гетероморфные клетки различной величины, включая L-формы. При исследовании популяции после озонирования также отмечено образование мелких, извитых, палочковидных форм клеток, которые могут быть рассмотрены как клетки-ревертанты. Полагают, что способность клеток к реверсии составляет характерную особенность гетероморфного роста бактерий (72, 98, 104, 118). Изучение биологических свойств культур микроорганизмов, обработанных озоном в бактериостатических концентрациях (250 и 500 мг/м3), подтвердило их жизнеспособность с сохранением биохимических, антигенных и патогенных свойств, а также способность образовавшихся L-форм реверсировать в исходное состояние при попадании в благоприятные условия существования. При этом все же необходимо отметить, что для их реверсии требовалось длительное культивирование и у всех реверсированных культур отмечена замедленная способность утилизировать цитраты, что говорит о снижении их ферментативной активности. В популяции бактерий после воздействия озоном в концентрации 750 мг/м3 отмечено частичное разрушение покровов на поверхности колоний, которые имели меньшую толщину и уплощенный («прижженный») вид. В доступной нам литературе мы не нашли объяснений данному явлению и поэтому полагаем, что сохранение покровов происходит вследствие более сильного действия высоких концентраций озона, при которых образуется огромное количество перекисных соединений, подавляющих активность каталазы и поэтому покровы не успевают полностью разрушаться и «присыхают» к поверхностям колоний. При изучении биологических свойств микроорганизмов установлена нежизнеспособность таких популяций. Образовавшиеся L-формы были в некультивируемом состоянии, что свидетельствовало о бактерицидном действии указанной концентрации озона.
На основании проведенных исследований были разработаны «Методические рекомендации по изучению воздействия физико-химических факторов на популяцию микробных клеток» (Утв. Отделением ветеринарной медицины РАСХН 24.12.1999г.), которые позволяют, наряду с изучением морфологии колоний, исследовать внутрипопуляционные взаимоотношения микроорганизмов, изменение их биологических свойств, а также различные проявления гетероморфизма, процессы L-трансформации и реверсии L-форм в исходное состояние после воздействия на популяцию микроорганизмов любых физико-химических факторов, таких как озон, УФ-излучение, ультразвук и др.
Проведенные нами исследования по изучению воздействия озона на популяции микробных клеток показали возможность достижения бактерицидного и бактериостатического эффекта путем озонирования. Важным аспектом в данном случае являлся выбор оптимальной концентрации озона, которая позволяла бы добиться надежной дезинфекции в производственных условиях.
