Фармакология и применение имунофана в животноводстве Степанов Олег Геннадьевич

Содержание к диссертации

2. Обзор литературы

1. Иммунокорригирующая терапия - важнейший компонент лечебно-профилактических мероприятий 9

2. Применение иммуномодуляторов при инфекционных болезнях

животных 16

3. Роль пептидов тимуса в механизме регуляции периферической иммунной системы организма 20

4. Получение и синтез полипептидов тимуса 34

4. Результаты собственных исследований

2. Токсикологические свойства имунофана

1. Общетоксические свойства имунофана 54

2. Патоморфология при применении имунофана 81

3. Изучение сенсибилизирующих свойств 90

4. Изучение тератогенной активности 101

5. Изучение способности имунофана вызывать генные мутации на индикаторных бактериях в тесте Эймса 8а1топе11а/микросомы....102

6. Учет хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей, индуцированных имунофаном 106

7. Учет доминантных летальных мутаций, индуцированных имунофаном в зародышевых клетках мышей 111

8. Влияние имунофана на показатели генетической стабильности лимфоидных клеток 111

Иммунофармакологическое исследование имунофана

1. Влияние имунофана на продукцию гормонов иммунитета 113

2. Влияние имунофана и пептидных тимических гормонов на продукцию простагландинов 114

3. Действие имунофана на продукцию интерлейкина-2 116

4. Регуляторное действие имунофана на продукцию фактора некроза опухоли 118

5. Регуляторное действие имунофана на синтез различных классов иммуноглобулинов . 119

6. Экспериментальное изучение влияния имунофана на

инфекционный и вакцинальный процессы 121

7. Влияние имунофана на выживаемость потомства при заражении вирусом гриппа 123

8. Радиозащитные свойства препарата имунофан 124

4.4. Применение имунофана в ветеринарии.... 130

5. Терапевтическая эффективность имунофана при парагриппе....:. 132

7. Эффективность применения имунофана в качестве ранозаживляющего средства 136

2. Лечебная эффективность имунофана при респираторных и желудочно-кишечных заболеваниях телят и поросят 142

   Эффективность имунофана при вакцинации птиц и телят 146

   Профилактическая эффективность имунофана при послеродовом эндометрите у коров 147

   Влияние имунофана на перекисное окисление липидов и иммунологическую резистентность кур при транспортном стрессе 151

   Эффективность применения имунофана в собаководстве 153

   Анализ результатов производственных испытаний и расчет экономической эффективности применения

   имунофана 156

   4. Заключение 160

   6. Предложения производству 176

   7. Список использованной литературы 177

   Введение к работе

   Актуальность темы. Широкое распространение и появление новых инфекционных заболеваний, возникновение антибиотикорезистентных штаммов патогенных микроорганизмов, недостаточная эффективность этиотроп- ных противовирусных препаратов, а также развитие тяжелых осложнений у иммунодефицитных больных с различной патологией вызывают настоятельную необходимость создания новых эффективных средств патогенетической и иммунокорригирующей терапии.

   Одним из наиболее важных аспектов совершенствования средств терапии широко распространенных инфекционных заболеваний человека и животных является расширение существующего арсенала и создание новых более эффективных препаратов имму но корригирующего типа действия. Актуальность данного направления в повышении эффективности терапии болезней определяется прежде всего тем, что тяжесть течения патологического процесса, развитие осложнений или формирование жизнеугрожающих состояний в значительной мере определяется именно глубиной нарушений иммунной реакции организма и снижением его неспецифической резистентности. Постоянное воздействие на организм неблагоприятных факторов внешней среды является одной из причин формирования вторичных иммунодефицитных состояний и усугубления клинического течения патологий.

   Значительные успехи, достигнутые в области разработки лекарственных препаратов для коррекции нарушений иммунной системы организма, обусловлены открытием нового класса биологически активных соединений- тимических пептидных гормонов иммунитета (А.Ь.Оо1с181ет, 1.Ноорег, 1970). Естественные гормоны Т-системы иммунитета представлены семейством ти- мозинов, тимопоэтинов и сывороточным тимическим фактором (тимулином). Данные гормоны продуцируются клетками центрального органа иммунитета- вилочковой железой и обеспечивают гуморальную регуляторную связь центральной и периферической иммунной системы организма (К.З.ВаэсЬ, в-Сок^ет, 1974; У.М.Ьеч^Б, JJ.Twomey а а1., 1978; С.Н.ЗипБЫпе, К.З.ВаБсЬ е1 а1., 1978; С.СоЫз1ет, Т.К.АиёЬуа, 1985).

   В этой связи создание иммунорегуляторных пептидов следующего поколения требует направленного синтеза этого класса соединений путем модификации последовательности аминокислотных остатков естественных гормонов иммунитета для усиления их влияния на противовирусный и антибактериальный иммунитет, расширения регулирующего действия на другие системы защиты и инактивации патогенетических факторов, вызывающих повреждения и нарушения функционирования клеточных структур организма. (В.И.Покровский, В.В.Лебедев, 1998).

   Цель и задачи исследований. Основной целью настоящей работы является разработка и фармако-токсикологическое исследование нового пептидного иммуномодулирующего препарата тимуса- имунофана (Г целью разработки его применения' в ветеринарии и животноводстве. Для реализации этой цели были поставлены следующие задачи:

   10. Разработать получение пептидного препарата тимуса четвертого поколения - имунофана, обладающего широким спектром регуляторной активности на различные звенья иммунной системы и другие факторы защиты организма.

   11. Определить основные токсикологические свойства препарата на организм животных, его влияние на основные морфо-функциональные параметры их отдельных систем, органов и тканей при его назначении.

   12. Изучить основные стороны фармакодинамики препарата, в т.ч. механизмы иммунокорригирующего действия.

   13. Разработать показания к применению имунофана при отдельных болезнях животных в качестве лечебно-профилактического препарата и иммуномодулирующего средства при иммунодефицитах и вакцинальном процессе.

   Научная новизна. В результате проведенных исследований с помощью химико-инженерной технологии разработано и освоено промышленное производство нового отечественного пептидного препарата тимуса - имуно- фан. Определены основные механизмы его-фармакодинамики и токсикологические характеристики препарата. Изучена лечебная и профилактическая эффективность имунофана при отдельных заболеваниях животных и его влияние на формирование иммунитета при различных состояниях организма.

   Научная новизна разработки подтверждена 3 патентами РФ.

   Практическая значимость. Практическому животноводству и ветеринарии предложен новый иммунокорригирующий препарат - имунофан, обладающий высоким лечебно-профилактическим действием при различных заболеваниях животных и иммунодефицитных состояниях их организма.

   Практическая значимость работы подтверждается положительными результатами клинических и широких производственных испытаний и .Врет менным наставлением по применению имунофана в ветеринарии ,№ 13.5.2/135 от 25.07.94 г., одобренным Ветеринарным фармакологическим советом (протокол № 3 от 16 июня 1994 года) и утвержденным в установленном порядке Департаментом ветеринарии МСХ РФ 25 июля 1994 г. и удостоена премии правительства РФ.

   Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на I съезде иммунологов России, Новосибирск, 1992; Международном симпозиуме по аллергологии и клинической иммунологии, Алма-Ата, 1992; Конференции «Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии», Махачкала, 1992; Международном симпозиуме «Пищевые зоонозы- сальмонеллезы, кампилобактериоз, иерсиниозы, листериоз. Методы и средства диагностики, лечения и профилактики», Москва, 1995; II Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 1995.

   ^ Основные положения, выносимые на защиту:

   1. разработка и синтез нового отечественного препарата тимуса- иму- нофана.

   2. результаты токсикологического исследования имунофана.

   3. результаты фармакологического исследования имунофана.

   4. результаты применения имунофана при различных болезнях живот** ных, а также в качестве иммуномодулирующего средства в животноводстве.

   #

   2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1. Иммунокорригирующая терапия — важнейший компонент лечебно-профилактических мероприятий

   Иммунокорригирующая терапия (ИКТ) является необходимым звеном лечебных мероприятий при бактериальных и вирусных инфекциях. Среди многообразия используемых в клинической практике лекарственных средств препараты, влияющие на иммунную систему, занимают особое место. Иммунокорригирующая терапия, вошедшая в обиход сравнительно недавно, в настоящее время приобретает все большее значение в комплексной терапии большинства патологических процессов. (Д.Н.Лазарева, Е.К.Алехин, 1985).

   Актуальность ИКТ инфекционной патологии обусловливается, прежде всего, быстрым ростом числа возбудителей, обладающих множественной резистентностью к антимикробным средствам, а также повышением патоген- ностью условно-патогенной флоры. В этих условиях антибиотическая терапия становится все менее эффективной. Антропогенные загрязнения природы (химические вещества, биотоксиканты продукты неполного сгорания топлива и др.), способствуя задержке развития иммунной системы, являются факторами исходного снижения иммунологической реактивности и, следовательно, повышают в современных условиях чувствительность организма к инфекционным процессам. (Ю.Е.Вельтищев, 1991).

   Кроме того, непосредственно инфекционный процесс, протекающий с антигенемией, приводит к дефициту иммунокомпетентных клеток в результате их гибели и истощающей дифференцировке также сопровождается им- мунодепрессивным действием. (В.И.Покровский, М.М.Авербах, В.И.Литвинов, И.В.Рубцов, 1979). Необходимо подчеркнуть, что используемые в лечении инфекционных заболеваний химиотерапевтические средства даже в субтерапевтических дозах оказывают ингибирующее действие на все клеточные элементы иммунной системы (К.П.Кашкин, З.О.Караев, 1984; А.Г.Чучалин, 1989; К.А.8Ьагге, О.О.Еске1е, М.Е.СеггзЬшт, 1981) за счет расстройства нуклеинового и белкового обмена (А.М.Земсков, А.В.Караулов, В.М.Земсков, 1994).

   К известным агентам, приводящим к приобретенной (вторичной) иммунологической недостаточности, относятся вирусы, вызывающие широко распространенные острые респираторные заболевания (ОРЗ), а также перси- стирующие (гепатит, герпес, цитомегало- и аденовирусные инфекции) и про- тозойные- (токсоплазмоз) болезни. (Д.В.Стефани, Ю.Е.Вельтищев, 1996; Доклад научной группы ВОЗ, 1980; У.И.Бьюлэк, 1982).

   В условиях иммунной недостаточности и снижения чувствительности микрофлоры к препаратам увеличивается значение макроорганизма в борьбе с инфицирующими факторами. Но даже'при отсутствии явных изменений в иммунном статусе (при «средних» уровнях антимикробной резистентности) современная ИКТ позволяет снизить объем антимикробной терапии: В перспективе при создании «идеальных» иммунокорригирующих средств вполне реальна ситуация минимизации этиотропного лечения. Некоторые новые антибиотики (рулид, модивид) уже сочетают выраженный антимикробный профиль и иммунореабилитационные характеристики. (А.В.Караулов, 1997).

   Арсенал современных средств значителен и наиболее удобной является их классификация по их происхождению. К их числу относят:

   1. Витамины и микроэлементы. Витамины, являясь коферментами или их частью, благодаря своей роли в обменных процессах, оказывают весьма значительное влияние на систему иммунитета. (Д.Н.Лазарева, Е.К.Алехин, 1985). Наиболее отчетливое воздействие на неспецифическую резистентность к инфекции показано в отношении витаминов А, В₆, В|2, С, Е, фолиевой кислоты. Однако иммунотропная активность витаминов изучена крайне недостаточно. До настоящего времени не получено доказательств универсального иммуностимулирующего действия витаминных комплексов. Более того, способность отдельных витаминов стимулировать иммунитет может не проявляться в условиях поливитаминотерапии из-за возможного антагонизма между ними.

   Известна роль цинка в становлении и функционировании иммунных механизмов. Интересно, что препараты цинка оказывают действие, подобное продуктам вилочковой железы. Повышают устойчивость к инфекциям за счет стимуляции антителопродукции и активности фагоцитов такие микроэлементы, как кобальт и литий. Стимулирующими факторами естественного иммунитета являются селен, железо, медь, марганец.

   1. Синтетические препараты (левамизол, зиксорин, ликопид). Имеют большую перспективу вследствие возможности создания любых синтетических веществ узконаправленного действия. Наиболее изучено соединение имидазола - левамизол (декарис), механизм действия которого напоминает активность тимопоэтических субстранций. Препарат оказывает действие на количественные и функциональные характеристики Т-лимфоцитов, регуля- торные их субпопуляции, завершающую стадию фагоцитоза.

   Зиксорин, влияя на систему цитохромов и другие факторы внутриклеточного метаболизма, активирует фагоцитоз (продукцию супероксидного радикала), который приобретает завершенный характер, и модулирует функции ЕК-клеток. Отечественный препарат ликопид (синтетический аналог клеточной стенки бактерий) оказывает иммуностимулирующее действие через стимуляцию функций макрофагов, секретируемый последними интерлейкин-1 (ИЛ-1) опосредует повышение синтеза антител, активности Т-лимфоцитов, ЕК-клеток и фагоцитоза.

   2. Препараты растительного происхождения (нуклеинат натрия, им- мунал, элеутерококк). Несмотря на меньшую активность по сравнению с бактериальными средствами, они привлекательные из-за отсутствия побочных реакций. В силу указанной особенности препараты растительного происхождения могут применяться длительными курсами. Наиболее изучен содержащий дрожжевую РНК нуклеинат натрия (В.М.Земсков, С.В.Родионов, А.В.Храмцов и др, 1988), который широко используется в клинической практике в сочетании с другими иммунокорректорами. (А.М.Земсков, А.В .Караулов, В.М.Земсков, 1994).

   Иммунотропное влияние таких препаратов, как элеутерококк и имму- нал, хорошо не изучено, несмотря на достаточно однородные сведения об их защитном (адаптогенном) действии. Данные средства используются, главным образом, с профилактической целью.

   4. Препараты бактериального происхождения и их аналоги (реафе- рон, виферон, реополиглюкин, аципол). Это, прежде всего продукты бактериальных мембран (полисахариды ПС). (З.В.Ермольева, Г.Е.Вайсберг, 1976). Сконструирован препарат на основе антигенов четырех условно-патогенных микробов: стафилококка, протея, кишечной палочки и клебсиеллы, показавший хороший клинический эффект при бактериальных процессах в легких. (Н.Б.Егорова, В.Н.Ефремова, И.М.Мансурова и др., 1986).

   Получены препараты из ферментированных молочных продуктов, им- муномодулирующая активность которых связана как с исходным сырьем, так и способностью некоторых структур клеточной стенки микробов влиять на иммунную систему. К полисахаридным препаратам относится аципол, содержащий инактивированные кефирные грибы. Известен продукт молозива - чигоин, применяемый в виде инсталляций для лечения циститов.

   К структурным аналогам бактериальных ПС относятся декстраны, получаемые при участии некоторых штаммов микробов или синтетическим путем (реаполиглюкин). Основным механизмом действия ПС является

   усиление , фагоцитарной активности нейтрофилов и макрофагов

   /

   (З.В.Ермольева, Г.Е.Вайсберг, 1976; В.И.Кириллов, Н.Г.Зернов, Л.Я.Бульба, 1988), а также продукции специфических антител. Многие ПС стимулируют синтез эндогенного интерферона (ИФ).

   К продуктам жизнедеятельности бактерий, созданных с помощью генной инженерии, относятся рекомбинантные альфа-ИФ, получившие наибольшее распространение в клинической практике. Помимо непосредственно противовирусного действия ИФ (реаферон, виферон) обладают иммунокорригирующей активностью: повышают фагоцитарные реакции и активность ЕК-клеток, что значительно расширяет показания к их клиническому применению при инфекционных процессах.

   5. Препараты крови и животного происхождения (тактивин, тима- лин, В-активин, лейкинферон, иммуноглобулины). Экспериментальные данные о важной роли вилочковой железы в становлении иммунитета вообще и Т-звена,- в частности, послужили основанием для изучения возможностей получения лекарственных препаратов из вилочной железы. Тактивин и другая фракция гормонов вилочковой железы - тималин показаны при дефицитных показателях Т-звена иммунитета, а также оказывают опосредованное влияние на гуморальные механизмы.

   Из супернатантов костномозговых клеток млекопитающих получен полипептидный препарат В-активин, который стимулирует образование анти- телообразующих клеток, а также «молодых» Т-лимфоцитов. Установлено влияние В-активина на супрессорные свойства аутосыворокти в реакции бла- сттрансформации лимфоцитов. Он также обладает эндорфинной активностью, за счет которой, по-видимому, участвует в процессах нейроиммуномо- дуляции.

   К препаратам крови относится лейкинферон, содержащий помимо интерферона медиаторы иммунитета, чем, главным образом, и обусловлен его иммуномодулирующий эффект.

   Направленно созданные для лечения гипогаммаглобулинемии внутривенные иммуноглобулины, включающие главным образом в последнее время расширили сферу клинического применения. В частности, они используются для лечения тяжелых вариантов генерализованных вирусных и бактериальных инфекций. С этих позиций данные препараты вводятся с заместительной целью. Кроме того, они оказывают иммуномодулирующее действие за счет своих олигопептидных фрагментов. Некоторые лекарственные формы ^ (пентаглобин) содержат повышенные концентрации ^А и ^М. Такая особенность целесообразна с точки зрения формирования локального иммунного ответа (^А), а также обеспечения опсонизирующего эффекта в отношении грамотрицательных бактерий (^М).

   На современном этапе наиболее перспективными представляются препараты из вилочковой железы, в число которых входит целый ряд высокоэффективных средств хорошо зарекомендовавших себя в клинической практике, благодаря избирательному и специфическому механизму действия. Широкое признание получили целый ряд лекарств из этой группы соединений. Наиболее известными из них являются тималин, тактивин, тимопоэтин и др.

   Тималин представляет собой комплекс полипептидных фракций, выделенных из вилочковой железы (тимуса) крупного рогатого скота. Он обладает способностью стимулировать иммунную систему организма. Регулирует количество Т- и В-лимфоцитов, стимулирует реакцию клеточного иммунитета, усиливает фагоцитоз. Стимулирует также процессы регенерации и кроветворения в случае их угнетения. Применение препарата наиболее эффективно в период выздоровления после тяжелых инфекционных заболеваний, с целью восстановления активности иммунной системы, для предупреждения осложнений и рецидивов.

   Тактивин также является препаратом полипептидной природы, полученным из вилочковой железы крупного рогатого скота. При иммунодефицит- ных состояниях нормализует количественные и функциональные показатели Т-системы иммунитета, стимулирует продукцию лимфокинов, в том числе интерферонов, нормализует другие показатели клеточного иммунитета. Препарат наиболее эффективен в период выздоровления после тяжелых инфекционных заболеваний, когда применяется с целью восстановления активности иммунной системы, для предупреждения осложнений и рецидивов.

   Тимопоэтин представляет собой комплекс пептидов из вилочковой железы млекопитающих животных.

   Вилозен лиофилизированный диализат экстракта вилочковой железы крупного рогатого скота. Содержит соединения нуклеотидной и нуклеозид- ной природы, аминокислоты, олигопептиды, амины, неорганические соединения. Он обладает иммуномодулирующей активностью, стимулирует пролиферацию и дифференцировку Т-лимфоцитов, подавляет развитие гиперчувствительности немедленного типа. В отличие от тималина, тактивина и тимопоэтина вилозен применяют местно, в виде закапываний в нос или ин- траназальных ингаляций при аллергических заболеваниях верхних дыхательных путей (аллергические риносинуситы).

   Тимостимулин, тимоувокал и тимомодулин представляют собой комплекс полипептидных фракций, выделенных из вилочковой железы крупного рогатого скота. По действию и применению сходны с тималином и тактиви- ном.

   Из синтетических пептидов известен тимоген — синтетический дипеп- тид, состоящий из остатков глутамина и триптофана. Он оказывает иммуностимулирующее действие и усиливает неспецифическую резистентность организма. ...... ,

   Известен также тимопентин ТР-5 (США) - синтетический пентапеп- тид, который на Т-клетках вызывает появление маркеров дифференцирвоки, усиливает функциональную дифференцировку, пролиферацию, продукцию интерлейкинов.

   Таким образом, наиболее значительные успехи, достигнутые в области разработки лекарственных препаратов для коррекции и нарушений иммунной системы организма, обусловлены открытием нового класса биологически активных соединений - тимических пептидных гормонов иммунитета. Естественные гормоны Т-системы иммунитета представлены семейством тимозинов, тимопоэтинов и сывороточным тимическим фактором (тимули- ном). Данные гормоны продуцируются клетками центрального органа иммунитета -вилочковой железой (тимусом).

   Пептидные гормоны тимуса контролируют рост и развитие лимфоид- ных клеток периферической иммунной системы посредством их прямого действия и влияния на продукцию медиаторов иммунитета. Активация лим- фоидных клеток пептидными гормонами тимуса, как и действие других регу- ляторных пептидов, осуществляется универсальным способом путем образования в цитоплазме вторичных мессенджеров.

   Иммуномодулирующее действие пептидов тимуса выражается в адекватном изменении функционального состояния клеток Т-системы иммунитета. На фоне нарушенных функций иммунной системы организма введение полипептидов тимуса характеризуется тенденцией к восстановлению баланса субпопуляций Т-лимфоцитов и их функциональной активности. При этом сниженные показатели увеличиваются, а гиперактивные процессы среди отдельных субпопуляций Т-лимфоцитов возвращаются до значений, близких к нормальному уровню (Ю.М.Лопухин, 1982).

   2.2. Применение иммуномодуляторов при инфекционных болезнях животных

   Для клинической ветеринарной медицины наиболее перспективно использование низкомолекулярных пептидов: Т- и В-активинов.

   Применение препаратов Т- и В-активинов приводит к значительному усилению гуморальных факторов неспецифической защиты устранению иммунодефицита у телят в первые 10 дней жизни., вызванного действием им- мунодепрессивных факторов в период их постнатального развития (A.M. Петров, 1994). Комплексное применение Т- и В-активинов обеспечивало си- нергидный эффект, особенно в случае трехкратного их введения в профилактических дозах (И.Д. Александров и др., 1993; A.M. Липатов и др., 1995) и обеспечивает высокую лечебную эффективность при острых желудочно- кишечных и респираторных болезнях телят (Д.А. Девришов, Е.С. Воронин, 1988; Е.С. Воронин и др., 1990; Т.Н. Грязнева, 1991; Е.С. Воронин и др., 1994).

   Т- и В-активины обладают также адъювантными свойствами. Иммунизация телят против сибирской язвы в сочетании с Т-активином повышает уровень антител к возбудителю антракса в 1,5-2 раза (Л.Б. Некудов, 1995). В- активны повышает эффективность введения поросятам вакцины против сальмонеллеза (М.С. Жаков, 1991) корректирует иммунный ответ у свиней при вакцинации против лептоспироза (В.А. Кирпиченок и др., 1991). Исследованы адъювантные возможности Т- и В-активинов при иммунизации вакциной ППД, вакциной ВГНКИ против болезни Ауески, при иммунизации телят и поросят против сальмонеллеза. Установлено, что эти препараты активизируют иммунологические реакции у животных и способствуют выработке

   иммунитета высокой напряженности (М.С. Жаков и сотр., 1994).

   Применение иммуномодуляторов повышает иммунный ответ при иммунизации против рожи свиней, сальмонеллеза свиней (В.П. Урбан и др., 1992; Б.Т. Артемов и др., 1994), против болезни Марека, Ньюкаслской болезни и колибактериоза птиц (A.B. Соколов, 1995). Введение тимогена способствует. повышению общей резистентности молодняка животных с разной степенью физиологической зрелости (Г.Р. Алавердиев, 1991; В.П. Урбан и др., 1995; Д.Р. Борисов, P.P. Игнатьев, 1995). Добавление в вакцину против бешенства иммуномодуляторов приводит к выраженному адъювантному , действию и стимуляции. иммунитета против плевропневмонии свиней (I. Hunderg et al., 1988) или при добавлении таких препаратов в вакцину против везикулярного стоматита крупного рогатого скота и осповакцину (J.Tilahum et al., 1987).

   Различные иммуномодуляторы испытаны при лечении респираторных инфекций. Они оказывают положительное влияние на течение болезни, корректируют фагоцитарную активность лейкоцитов и альвеолярных макрофагов, воздействуют на течение воспалительного процесса в легких. Для этих целей изучены и применяются: карбоцепный сополимер винилпирролидона (А.З. Абышев, 1989), димефосфон (Р.З. Курбанов, 1994), пептидные биостимуляторы (С.И. Лютинский, 1993), Т-активин (П.А. Красочко, 1990; Д.А. Дервишев, 1991), комплексный препарат Т- и В-активинов (Д.А. Дервишев, 1988; A.B. Жаров, 1995), тимоген (С.И. Лютинский, 1989), Тимотропин (Г.А. Красников и др., 1987), миелопептид (Г.В. Палов и др., 1988).

   Для лечения и профилактики желудочно-кишечных инфекций используются имзауф (В.И. Издепский, 1993), БАИ (В.Н. Симович, 1994), тимоген (В.П. Урбан и др., 1991), Т-активин (Г.А. Ноздрин и др., 1995), пептидогли- кан и хитозан (В.П. Урбан и др., 1992); для лечения и профилактики гель- минтозов - метилурацил, дибазол, мебикар, аминовит, вегстан, градекс и др., используют ягнятам до выгона на пастбище - способствуют профилактике стронгилятозов в течение 1,5-2 месяцев, повышают иммунологический статус организма (В.В. Филиппов, Э'Х. Даугалиева, 1994).

   Т- и В-активины использовались в эксперименте при инфекционном ринотрахеите (Е.С. Воронин и др., 1991), сальмонеллезе и пастереллезе белых мышей (Окапаттах Годвин Агбеко Куджо, 1991; Сума Лансана, 1991), при экспериментальном бруцеллезе (А.П. Красиков и др., 1988). Применение витамина В повышает иммуногенность вакцины и значительно увеличивает сохранность поросят. При. использовании диэтилдитиокарбоната натрия в комплексе с вакциной против ротавирусной инфекции телята получают более напряженный иммунитет, чем контрольные (I. Archandault et al., 1988); проти- воящурная вакцина вместе с авридином обеспечивает стойкий иммунитет у животных (М.М. Rweyemamu et al., 1986). Тималин существенно тормозит развитие спонтанных опухолей (Н.П. Напалков и др., 1988), левамизол в значительной степени влияет на течение и исход лейкоза (Е.М. Неико и др., 1984; Г.Ю. Митарев и др., 1984; Т.П. Маркова, 1984; Г.Н. Чувиров и др., 1984); кроме того, в этих целях используют Т-активин (Т.П. Макарова и др., 1984; Г.Н. Чувиров, 1984); тималин (Е.М. Абакумов и др., 1984); дицифон (Г.Ю. Митарев и др., 1984); тимозин (H.H. Клепиков и др., 1984); препараты костного мозга (K.M. Абдулкадыров и др., 1984); препараты из клеточных мембран (A.A. Ракитинская и др., 1984; B.Bizzini et al., 1986). С целью профилактики инфицирования телят ВЛКРС (A.M. Никитенко, 1990), для профилактики и лечения ге-мобластозов крупного рогатого скота используют гомотин и кализол (A.M. Никитенко, 1990). Ведутся исследования влияния иммуномодуляторов на развитие противобруцеллезного иммунитета. Установлено, что однократное введение тималина с вакциной из штамма 19 значительно увеличивает среднюю продолжительность жизни мышей (С.К. Пе- реходова и др., 1988). Кроме его в инфекционной патологии бруцеллеза с целью повышения иммунитета использовали- такие иммуномодуляторы как поливинилпирролидон, левамизол, дибазол и дрожжевая РНК (В.И. Белобаб и др., 1985; А.П. Красиков и др., 1988; А.П. Красиков и др., 1989; А.П. Красиков и др., 1990).

   Установлено, что в экспериментальных условиях на лабораторных животных и крупном рогатом скоте применение левамизола (И.И. Хасатов и др., 1978) обеспечивает стимуляцию клеточного иммунитета. В.Ф. Кику (1980) указывает на то, что левамизол хорошо растворяется в воде и других жидкостях, не влияет на картину крови, мочи, функцию печени, быстро выводится из организма, не обладает кумулятивными свойствами.

   О терапевтическом эффекте левамизола при лечении экспериментального туберкулеза сообщали Е.А. Александрова и др. (1981). Б.М. Туякбаева и др. (1986) изучали вопрос о возможности применения левамизола как имму- номодулятора при вакцинации БЦЖ на кроликах и морских свинках, и установлена целесообразность применения левамизола при вакцинации кроликов вакциной БЦЖ.

   В данном случае необходимо отметить, что (И.Д. Александров, И.П. Ха- бузов, Г.М.Ганеева, 1995-2000) получены положительные результаты при использовании левамизола в сочетании с противотуберкулезной вакциной из штамма БЦЖ на телятах в раннем (3-7 суток) возрасте. Полученные результаты свидетельствуют о наибольшем влиянии левамизола в сочетании с вакциной на иммунную систему животных по отношению к влияниям левамизола и вакцины применяемые раздельно. Сохраняется тесная прямая корреляция динамики Ти В-лимфоцитов с общей продукцией лейкоцитов; В-лимфоцитов с Т- и В- лимфоцитами, БАСК с захватывающей активностью нейтрофилов и моноцитов. Показано, что левамизол усиливает иммуномоде-лирующее влияние вакцины

   БЦЖ на клеточный и гуморальный иммунитет, пролонгируя его до 12 месяцев (срок наблюдения).

   Имеются данные о применении Т- и В-активинов в качестве иммуно- модулирующих препаратов и в качестве адъюв'антов при антигенных нагрузках. Изучена иммуномодулирующая роль Т- и В-активинов в сочетании с противобруцеллезной вакциной из штамма 82 (И.Д. Александров, Г.М.Га- неева, 1998), вакциной БЦЖ (И.Д.Александров, И.П.Хабузов, Н.С.Ладан, 1998).

   Определенный путь в повышении протективных свойств слабоагглю- тиногенных вакцин против хронических инфекций крупного рогатого скота наметился с использованием иммуномодуляторов вакцинированным животным: полирибоната с вакциной БЦЖ на морских свинках (A.C. Донченко и др., 1989); Т- и В-активинов с вакциной из штамма 82 для профилактики бруцеллеза крупного рогатого скота (И.Д! Александров и др., 1996).

   2.3. Роль пептидов тимуса в механизме регуляции периферической иммунной системы организма

   В зависимости от этиологического агента, его вирулентности и дозы возбудителя иммунная недостаточность протекает по транзиторному типу, например, в случае острого инфекционного поражения, или носит характер стойкого иммунодефицитного состояния, с нарушением продукции цитоки- нов, дисбалансом субпопуляций Т- и B-лимфоцитов и функциональной недостаточностью мононуклеарных фагоцитов, что обычно наблюдается при хронических инфекционных или онкологических заболеваниях (Г.К.Баймуканова и др., 1991, 1992; Л.А.Певницкий и др., 1994).

   Среди патогенетических факторов инфекционных болезней человека, важное место занимают вновь образующиеся медиаторы или модуляторы воспаления, которые в условиях нормальной жизнедеятельности организма существуют в физиологических концентрациях и ответственны за регуляцию функций на клеточном и тканевом уровне. Некоторые из них, такие как лим- фокины, монокины и метаболиты арахидоновой кислоты- эйкозаноиды, одновременно, являются медиаторами клеток иммунной системы, а другие, например, активные метаболиты кислорода, обеспечивают функционирование кислородзависимой системы бактерицидности нейтрофилов. При инфекционном воспалении, в условиях гиперпродукции медиаторов, резкое увеличение концентрации цитокинов, прежде всего монокинов и лимфокинов, вызывает количественные и функциональные изменения иммунокомпетентных

   клеток, а усиление продукции активных метаболитов кислорода оказывает на них прямое повреждающее действие (Д.Н.Маянский, 1994; S.Chensue, 1996; J.W.M. Van der Meer, 1996).

   Следовательно, посредством вновь образующихся медиаторов, инфекционная воспалительная реакция всегда вовлекает в типовой патологический процесс клетки иммунной системы организма и может являться одной из причин формирования вторичного, иммунодефицитного состояния.

   Важное патогенетическое значение цитокинов в развитии воспалительной и иммунной реакции организма вызывает особый интерес в плане их использования в качестве лекарственных препаратов для патогенетической и иммунокорригирующей терапии. Среди большого многообразия цитокинов можно выделить дериваты антигенстимулированных CD4+ Т-лимфоцитов: интерлейкин-2 (ИЛ-2), основной регулятор роста Т-клеток; интерлейкин-4 (ИЛ-4), регулятор синтеза IgE; группу медиаторов естественного иммунитета и воспаления: антивирусные интерфероны типа I, фактор некроза опухоли (ФИО), интерлейкин-1 (ИЛ-1), интерлейкин-6 (ИЛ-6) и цитокины воспалительной реакции лейкоцитов, которые продуцируются антиген- активированными CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитами. Последняя группа включает у-интерферон- активатор мононуклеарных фагоцитов; лимфотоксин- активатор нейтрофилов; интерлейкин-5 (ИЛ-5)- активатор эозинофилов. Самостоятельное семейство цитокинов представлено колоние-стимулирующими факторами, которые продуцируются неспецифическими эффекторными клетками и Т-клетками, стимулируют рост клеток костного мозга, принимая опосредованное участие в воспалительной реакции лейкоцитов (Н.В.Медуницин и др., 1995; K.Arai, F.Lee et al., 1990).

   Применение цитокинов или медиаторов в качестве фармакологических средств терапии иммунодефицитных состояний предполагает усиление или изменение того или иного звена иммунитета в системе каскадной регуляции иммунной реакции организма. При этом необходимо иметь в виду, что действие одного цитокина или цитокиномиметика на клетки-мишени в результате их активации обязательно вызывает продукцию других медиаторов и, соответственно, расширение спектра фармакологических эффектов. Такое расширение спектра действия при введении медиаторов в организм может вызывать серию параллельных или побочныхрффектов (И.П.Ашмарин, 1984; Е.И.Чазов, М.И.Титов и др., 1984; Donahue, Rosenberg, 1983).

   Другая причина появления побочных эффектов заключается в несоответствии между уровнем распределения медиаторов а органах и тканях при их введении в организм и созданием действующей концентрации цитокинов в зоне межклеточной передачи сигнала. В физиологических условиях медиаторы продуцируются непосредственно в межклеточное пространство, где оказывают влияние по автокринному и паракринному типу действия. Такой тип передачи сигнала обеспечивает высокие концентрации медиатора среди клеток ближайшего окружения, как это, например, происходит в системе межклеточного взаимодействия А-клеток, Т- и В-лимфоцитов. Паракринный тип передачи сигнала обеспечивает определенную избирательность действия цитокинов и имеет существенное значение в регуляции воспалительной и иммунной реакции организма. Напротив, поступая в кровь при парентеральном введении, цитокины утрачивают паракринный тип действия, распределяются по органам и тканям и приобретают не свойственный медиаторам эндокринный характер действия. Поэтому введение в организм экзогенных цитокинов или цитокиномиметиков может вызывать нарушение специфики их действия с расширением спектра фармакологических и побочных эффектов. Вероятно, по этой причине попытки лекарственного применения ряда цито- кинов, таких как ИЛ-1, ИЛ-2, ФНО и некоторых других, не получили широкого клинического применения (Р.8.Ыаагкаи1, О.Нагштюпс1-МсС1ЬЬеп, 1994).

   Регуляторные тимические пептиды или гормоны тимуса секретируют- ся в кровь и осуществляют дистанционное управление клетками периферической иммунной системы, вызывая стимуляцию их дифференцировки и созревания. Активированные лимфоидные клетки периферической иммунной системы, в свою очередь, продуцируют цитокины, которые инициируют пролиферацию и созревание субпопуляций Т- и В-лимфоцитов (,1.\.Нас1с1еп, 1992). Таким образом, пептидные гормоны тимуса контролируют рост и развитие лимфоидных клеток периферической иммунной системы посредством их прямого действия и влияния на продукцию медиаторов иммунитета.

   Активация лимфоидных клеток пептидными гормонами тимуса, как и действие других регуляторных пептидов, осуществляется универсальным способом путем образования в цитоплазме вторичных мессенжеров: цАМФ и донов кальция, инозилтрифосфата, диацилглицерола с последующей генерацией сигнала на разнообразные индукторы (Н.П.Мертвецов, 1986; К.К.СМеБ, А.Ь.Оо1(181ет, 1984). Ряд пептидных гормонов тимуса, такие как тимозин-а 1 и тимопоэтин, помимо изменения продукции цАМФ, вызывают стимуляцию синтеза вторичных медиаторов- простагландинов группы Е, действие которых, вероятно, реализуется через цГМФ (Е.Сагаа, РауаШ а1., 1984; Е.Ра1з1, А.Магке\укг е1 а!., 1991).

   Следовательно, влияние пептидов тимуса на функциональное состояние клеток периферической иммунной системы обусловлено биохимическими механизмами, свойственными пептидным гормонам. Такой универсальный механизм действия лежит в основе двух важных фармакологических эффектов пептидных гормонов иммунитета: эффекта малых доз и эффекта иммуномодулирующего действия.

   Эффект малых доз выражается в том, что регуляторные пептиды или пептидные гормоны вызывают адекватное изменение функции клетки- мишени в очень низких концентрациях, порядка Ю"¹⁰ — 10"¹² М (И.П.Ашмарин, 1997; Н.П.Мертвецов, 1984; В.А.Ткачук, 1983). Регуляторные пептиды тимуса и их синтетические аналоги также вызывают фенотипиче- скую трансформацию лимфоидных клеток в низких дозах близкого порядка (Т.Ь.К.Ьош, А.Ь.ОоШет, 1979; Т.АисШуа, М.Р.8сЬе!с1 & а1., 1984). Активация клетки низкими дозами регуляторных пептидов достигается за счет генерализации сигнала путем образования вторичных мессенжеров в цитоплазме

   клетки (В.А.Ткачук, 1983; МЛ.Вегпс^е, ЛЛМтп, 1985). При этом итоговое

   усиление сигнала может составлять 10^б- 10⁸ раз, что позволяет тимическим пептидам, действующим в каскадной системе, работать в диапазоне ультрамалых доз.

   Иммуномодулирующее действие пептйдов тимуса выражается в адекватном изменении функционального состояния клеток Т-системы иммунитета. На фоне нарушенных функций иммунной системы организма введение

   ' Л

   полипептидов тимуса характеризуется тенденцией к восстановлению баланса

   * ' '

   субпопуляций Т-лимфоцитов и их функциональной активности. При этом сниженные показатели увеличиваются, а гиперактивные процессы среди отдельных субпопуляций Т-лимфоцитов возвращаются до значений, близких к нормальному уровню (Ю.М.Лопухин, Р.В.Петров и др., 1981; Л.В.Ковальчук, Б.В.Цейтлин и др., 1981; К.К.ОагеБ, А.Ь.ОоШет, 1984).

   В настоящее время принято считать, что основные эффекты пептидных и белковых гормонов, а также катехоламинов (в случае действия через р- адренергическую систему) реализуются посредством изменения содержания в клетке-мишени циклических нуклеотидов цАМФ и цГМФ (В.В.Лебедев, 1996). Исследования механизма действия регуляторных пептидов иммуно- тропного типа действия также демонстрируют их влияние на содержание циклических нуклеотидов. Ряд полипептидов иммунотропного типа действия, помимо изменения продукции цАМФ, вызывают стимуляцию синтеза вторичных медиаторов-простагландинов группы Е, эффект которых, по- видимому, реализуется через цГМФ.

   Модулирующее действие является универсальным для регуляторных пептидов различного происхождения и выражается в восстановлении функции ЦНС и эндокринных органов через изменение содержания циклических нуклеотидов в соответствующих клетках-мишенях (В.В.Лебедев, В.А.Болибок, 1996; В.В.Лебедев, А.К.Сулейманов, 1993; В.В.Лебедев, В .И.Покровский, 1992; В.В.Лебедев, В.М.Писарев, 1992).

   На молекулярном уровне процесс передачи информации обеспечивается цепочкой мембранных белков последовательно взаимодействующих друг с другом. Каждый раз взаимодействие вызывает конформационную перестройку следующего в цепочке белка- изменение его структуры, а, следовательно, и функции. На определенном этапе дальнейшая передача информации генерируется находящимся в цитоплазме малым молекулам или ионам, которые и являются вторичными мессенжерами. Диффузия вторичных мес- сенжеров обеспечивает быстрое распространение сигнала по всей клетке.

   Число различных вторичных мессенжеров резко ограничено, поэтому передача внутриклеточного сигнала на разнообразные индукторы является универсальной. Известны два основных пути передачи сигналов. В одном из них вторичным мессенжером служит цАМФ. В другом- действует комбинация трех вторичных мессенжеров: ионы кальция, инозилтрифосфат и диа- цилглицерол Инозитолтрифосфат и диацилглицерол образуются из самой плазматической мембраны клетки. Оба пути передачи сигналов имеют много общего, поскольку внешний сигнал воспринимают через поверхностный рецептор, а внутренние сигналы- посредством О- белков. Последние представляют собой мембранные белки, которые активируют при их связывании с гуанозитрифосфатом (ГТФ). в- белки активируют «усилительный» фермент, который превращает молекулы вещества-предшественника в молекулы вторичного мессенжера. Усилительный фермент аденилатциклаза превращает АТФ с цАМФ, а усилительный фермент фосфолипаза С расщепляет мембранный липид фосфатидилинозитол- 4,5 дифосфат на диацилглицерол и инозитолтрифосфат.

   В настоящее время рассматривается возможность участия в роли вторичного мессенжера цГМФ, хотя его конкретная функция в клетке не вполне понятна. Прежде всего гуанилатциклаза- фермент, превращающий ГТФ в цГМФ, обычно не связан с рецептором. Однако, образование цГМФ обычно происходит одновременно с активацией инозитидного пути передачи сигнала и реализация его эффектов подобно цАМФ происходит одновременно с активацией инозитидного пути передачи сигнала и реализация его эффектов подобно цАМФ происходит при посредстве другого вторичного мессенжера ионов кальция. Данное наблюдение предполагает участие ионов кальция в реализации эффектов обоих вторичных мессенжеров: цАМФ и цГМФ, которое осуществляется через связь кальция со специфическим белком- кальмо- дулином. В отличие от цГМФ образование вторичного мессенжера цАМФ осуществляется через, стимулирующие (Р_с) и ингибирующие (Р_и) рецепторы на плазматической мембране клетки. Оба типа рецепторов воздействуют на ' усилитель аденилатциклазу также через стимулирующие (О_с) и ингибирующие (О_и) белки, то есть посредством в- белков. Далее аденилатциклаза превращает АТФ в цАМФ.

   Другой путь, передачи информации, для которого ингибирующие внешние сигналы остаются неизвестны, осуществляется через стимулирующий в- белок (С_с), который активирует усилитель- фосфо-диэстеразу. Этот фермент расщепляет фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат на два уже известных вторичных мессенжера: диацилглицерол и инозитолтрифосфат. Инози- толтрифосфат вызывает накопление в клетке еще одного вторичного мессенжера- ионов кальция. Одновременно активируется усилитель гуанилатциклаза, которая превращает ГТФ в другой вторичный мессенжер- цГМФ.

   Геномные эффекты, обеспечивающие активацию покоющейся клетки и ее репликацию, в обоих случаях передачи информации реализуются, по- видимому, за счет повышения рН и содержания ионов кальция в клетке, которое вызывает индукцию синтеза РЫК и белков, необходимую для подготовки к репликации ДНК. Вторичный мессенжер инозитолтрифосфат вызывает мобилизацию внутриклеточного кальция, а диацилглицерол активирует С-киназу, которая приводит в действие мембранный механизм обмена ионов. Данный механизм выкачивает ионы водорода из клетки, за счет чего повышается внутриклеточный рН.

   Таким образом, за счет универсальности механизма включения вторичных мессенжеров в ядре клетки обеспечивается адекватное изменение рН и концентрации ионов, которое через ряд геномных эффектов вызывает вступление клетки в новое функциональное состояние по типу модулирующего действия.

   Как известно, эндокринный путь действия регуляторных пептидов характеризуется их секрецией в кровь из эндокринных органов с последующим действием на отдаленные клетки-мишени, несущие соответствующие рецепторы (В.В.Лебедев, В.И.Покровский, 1992; В.В.Лебедев, А.К.Сулейманов, 1992). Секреция иммунорегуляторных пептидов центральными органами иммунитета установлена для (Х| тимозина, тимулина, РТБ, тимопоэтина Г, 2 и спленина, которые идентифицированы в крови радиоиммунологическими методами, либо выделены в чистом виде.

   Ряд других полипептидов тимуса- тимозин а₇, а также группа Р- полипептидов в периферической крови не обнаружены. Отсутствие данной группы тимических полипептидов в крови объясняется тем, что они представлены либо предшественниками функционально зрелых молекул, или выполняют функции, не связанные с эндокринным действием.

   Таким образом, функционально зрелые полипептиды тимуса и спле- нин селезенки по способу действия могут быть отнесены к группе пептидных гормонов.

   Центральными органами иммунитета являются вилочковая железа (тимус) и сумка Фабрициуса, которая обнаружена только у птиц. У млекопитающих, по-видимому, не существует единого аналога сумки Фабрициуса и ее роль выполняют клетки костного мозга, селезенка и, возможно, регионарные лимфатические узлы.

   Сумка Фабрициуса или ее функциональные эквиваленты у млекопитающих обеспечивают продукцию стволовых клеток-предшественников лимфоцитов. Оба центральных органа иммунитета являются местами диффе- ренцировки определенных популяций лимфоцитов. Тимус является ответственным за формирование тимусзависимых клеток (Т-лимфоцитов), а в сумке Фабрициуса или ее аналогах образуются В-лимфоциты.

   Фармакологические представления о медиаторном типе действия обычно основываются на существовании специальных замкнутых морфологических образованиях- синапсах. Наличие синаптической структуры обеспечивает межклеточную передачу сигнала посредством продукции медиатора в синаптическую щель. Такой тип действия имеет то физиологическое значение, что позволяет создавать в момент времени высокие концентрации медиатора на поверхности постсинаптической мембраны строго определенных клеток, имеющих синаптическую связь с эфферентной клеткой. Существование синаптических образований между лимфоидными клетками не известно, поэтому передача межклеточного сигнала в лимфоидной системе организма осуществляется преимущественно эндокринным и паракринным путем.

   Таким образом, пути передачи сигналов в лимфоидных клетках имеют важное отличие от центральной и периферической нервной системы, а именно отсутствие синаптической передачи.

   Фармакокинетические эффекты регуляторных полипептидов центральных органов иммунитета, как уже отмечалось, реализуются по эндокринному пути действия. По-видимому, данный тип действия обеспечивает быструю передачу сигнала из центральных органов иммунитета на периферию с вовлечением в специфический ответ широкого разнообразия лимфоидных клеток. Парентеральное введение экзогенных полипептидов, при условии их быстрого поступления в кровь, воспроизводит экспериментальную модель, наиболее близкую к эндокринному действию. Однократное введение животным препаратов пептидной структуры представляет собой импульсное воздействие на рецепторный аппарат лимфоидных клеток, поскольку период полужизни регуляторных пептидов в организме исчисляется в пределах 1-2 минут. Длительное перфузионное введение иммунорегуляторных препаратов вызывает устранение их специфических эффектов на фоне проявления острых токсических симптомов. Оба эффекта можно объяснить с общих позиций рецепторной теории возбуждения клетки. Длительное увеличение концентрации вещества приводит к сдвигу эффективной константы диссоциации рецептор-медиатор и, соответственно, к блоку рецепторов. Принципиальную аналогию такого механизма блока рецепторов можно найти в холинергиче- ских структурах периферической нервной системы, при введении препаратов антихолинэстеразного типа действия. Увеличение концентрации медиатора- ацетилхолина, вследствие ингибирования холинэстеразы, вызывает блок хо- линергических рецепторов и выключение клетки-мишени из функционирующего состояния.

   Общие принципы рецепторной теории можно применить и для объяснения другого фармакокинетического действия - эффекта «ускользания». Доза- зависимый эффект регуляторных пептидов тимуса при некоторой постановке экспериментов «in vivo» и "in vitro" описывается П- образной кривой (В.В.Лебедев, Г.Н.Хлябич, 1987). Иначе говоря, регуляторные полипептиды вызывают специфический эффект в относительно узком интервале доз, а увеличение концентрации вещества приводит к утрате- "ускользанию" эффекта. Можно предположить, что данная особенность действия регуляторных пептидов также реализуется на уровне запредельного сдвига константы диссоциации рецептор-индуктор.

   Важным фармакокинетическим параметром является распределение лекарств в различных органах и тканях, которое никогда не бывает равномерным. При введении в организм регуляторных пептидов иммунотропного типа действия, в силу неравномерности их распределения по органам и тканям, доступность рецепторов различных клеток не одинакова. С другой стороны, возможность активации клеток-мишеней определяется в значительной степени концентрационной зависимостью. Поэтому конечный результат действия регуляторных пептидов выражается суммой эффектов, зависящей от создания в момент времени эффективной концентрации вещества среди различных популяций клеток, несущих перекрестно-реагирующие рецепторы. Вероятно, данные фармакокинетические особенности лежат в основе проявления множества параллельных эффектов при назначении препаратов, созданных на основе регуляторных пептидов (В.В.Лебедев, В.И.Покровский, 1992).

   Высокая аналогия последовательности аминокислотных остатков среди семейства тимопоэтинов и спленина указывает на существование близкородственных генов в клетках тимуса и селезенки. Тимопоэтин 2 тимуса стимулирует дифференцировку предшественников Т-лимфоцитов и ингибирует созревание B-лимфоцитов. В отличие от тимопоэтина 2, спленин селезенки активизирует созревание предшественников В- лимфоцитов, сохраняя при этом влияние на Т-лимфоциты. .. „ , i

   Таким образом, экспериментальные доказательства специфичности анатомической локализации продукции, функционально различающихся им- мунорегуляторных полипептидов. Такие отличия, по-видимому, обеспечивают возможность созревания В- лимфоцитов в селезенке, которое не наблюдается в в другом органе- тимусе. В то же время в селезенке достигается созревание и Т-лимфоцитов за счет универсальности действия спленина на обе популяции лимфоцитов.

   Специфичность анатомической локализации продукции иммунологи- чески активных регуляторных полипептидов вероятно отражает общебиологическую закономерность. Примером строгой локализации продукции регуляторных пептидов может служить образование Met и Leu энкефалина в центральной нервной системе (В.В.Лебедев, А.К.Сулейманов, 1993). Данные нейротропные пептиды подобно тимопоэтину 2 и спленину имеют единственную аминокислотную замену, которая определяет особенности их регулирующего действия. Подобно происхождению типов и классов полипептидных цепей иммуноглобулинов, появление структурно родственных иммуно- логически активных полипептидов можно представить как результат дивергенции в течение эволюции родоначального гена. Однако, ввиду универсальности действия регуляторных полипептидов в отношении созревания различных субпопуляций лимфоидных клеток, дивергенция их генов ограничена, что отчасти находит свое выражение в немногочисленности их отдельных представителей.

   Помимо семейства тимопоэтинов и спленина, продукция которых ограничена отдельными органами: существует ряд регуляторных полипептидов, например, тимозин си и тимозин р₄, образование которых не связано с определенными органическими структурами. Такие полипептиды помимо чисто иммунологической функции выполняют роль регуляторов в подкорковых образованиях центральной нервной системы. Подкорковые образования ЦНС являются филогенетически древними структурами и их регуляторные пептйды обладают достаточно высокой консервативностью последовательности аминокислотных остатков. Поскольку тимозин а! выполняет двойную функцию, он имеет несколько полиморфных форм, аналогичных тимопоэти- ну и спленину.

   Таким образом, среди иммунологически активных регуляторных пептидов можно выделить две группы: семейство тимопоэтинов, образующее полиморфные формы в различных органах лимфоидной системы, и семейство тимозинов, которое помимо лимфоидной системы представлено в ЦНС, сохраняя при этом общность химической структуры.

   К настоящему времени можно считать доказанным, что ряд полипептидов семейства тимозинов помимо тимуса образуются в подкорковых морфологических структурах головного мозга, где они, по-видимому, выполняют определенные биологические функции (В.В.Лебедев, В.И.Покровский. Патент РФ №2062096). При парентеральном введении тимозинов, они вызывают ряд параллельных эффектов со стороны подкорковых образований ЦНС и коры надпочечников. Тимозин фракция 5 повышает в плазме крови концентрацию АКТГ, р- эндорфина и кортизола. Фармакокинетические исследования показали, что изменения концентрации стимулированных продуктов подчиняются принципу время-эффект.

   Данные факты показывают иммунорегуляторную связь лимфоидной системы с центральной и эндокринной системами, через продукцию общих регуляторных пептидов.

   Среди семейства тимозинов отдельные его представители оказывают неоднозначное действие на секрецию гормонов гипофиза. Тимозин р₄ стимулирует нейроэндокринную связь гипоталамус-гипофиз-половые железы путем активации продукции релизинг-фактора лютеинизирующего гормона ЬН-Ю⁷.

   Лимфоидные клетки, с которыми связаны все иммунные механизмы, обеспечивающие индивидуальность и, целостность организма, появляются, созревают и функционируют в определенных органах и тканях. Лимфоидные; органы и ткани, ответственные за формирование иммунологических реакций, разделяют на два основных типа: первичные (центральные) и вторичные (периферические).

   В основу данной классификации положены различия в участии антигенов при формировании иммунологического ответа организма. В центральных органах иммунной системы созревание лимфоцитов проходит без существенного влияния антигенов в результате антиген-независимой дифферен- цировки соответствующих генетических областей. Развитие периферических лимфоидных органов и тканей определяется непосредственно действием антигенного раздражителя и вызывает пролиферацию и дифференцировку им- мунокомпетентных клонов лимфоцитов.

   Обнаружено, что при выделении тимонов некоторые сопутствующие фракции обладают выраженной ингибирующей активностью на пролиферацию лимфоцитов. Данные вещества были выделены в чистом виде. Оказалось, что по химической структуре они являются известными полиаминами:

   I Я

   спермином (Ы -ацетилспермидин) и спермидином (Ы -ацетилспермидин).

   Спермин и спермидин обнаружены также в тимозине фракция 5, причем около 50% спермидина находится в виде ковалентно связанного конъюгата. Присутствие свободного спермина и спермидина или ковалентно связанного конъюгата вызывает резкое снижение стимулирующего эффекта тимозинов на Т-лимфоциты. При конъюгации полиаминов типа спермин-спермидин с СТТ или тимозином р₄ отмечается инверсия активности тимических пептидов и они приобретают свойство супрессоров. Присутствие в тимусе ингиби-

   торов пролиферации может играть важную роль в регуляции темпов роста популяции Т-лимфоцитов. Отмечено, возрастание синтеза полиаминов на ранних сроках активации Т-лимфоцитов. Данный экспериментальный факт может служить подтверждением участия спермина и спермидина в регуляции темпов пролиферации Т-лимфоцитов.

   Следовательно, полиамины типа спермин-спермидин являются функциональными антагонистами тимонов и путем химического взаимодействия могут инвертировать действие тимических полипептидов.

   Среди патогенетических факторов инфекционных болезней человека важное место занимают вновь образующиеся медиаторы или модуляторы воспаления, которые в условиях нормальной жизнедеятельности организма существуют в физиологических концентрациях и ответственны за регуляцию функций на клеточном и тканевом уровне. Некоторые из них, такие как ин- терлейкины, ФНО и метаболиты арахидоновой кислоты- эйкозаноиды, одновременно являются медиаторами клеток иммунной системы. Однако в условиях их гиперпродукции они выполняют функцию медиаторов воспаления и непосредственно участвуют в развитии типового патологического процесса. Несбалансированное усиление продукции медиаторов, например ФНО или интерлейкинов, в период инфекционного воспаления является одной из причин развития системных нарушений или септического шока.

   Другие факторы, например, активные метаболиты кислорода обеспечивают функционирование кислородзависимой системы бактерицидности, а несбалансированное увеличение их образования вызывает прямое повреждающее действие на клетки и нарастание явлений интоксикации.

   В этой связи, одним из основных требований предъявляемых к совершенствованию средств патогенетической и иммунокорригирующей терапии является их способность оказывать регуляторное действие как на продукцию медиаторов воспаления и иммунитета, так и на образование активных метаболитов кислорода и систему инактивации свободнорадикальных соединений.

   2.4. Получение и синтез полипептидов тимуса

   К настоящему времени предложено несколько десятков методов экстракции ткани тимуса, селезенки и костного мозга, которые достаточно полно систематизированы (И.Е.Гаврилова, О.В.Короткова, 1995; И.Е.Гаврилова, О.В.Короткова, 1995; А.В.Змызгова, Л.Н.ЛСокорева, 1993; С.Г.Кремлев, В.М.Писарев, 1992).

   Данное наблюдение явилось обоснованием для создания пептидных л иммунорегулирующих препаратов 1 поколения, таких, как тимозин - фракция 5, Т-активин, тималин и некоторых других.

   Создание лекарственных препаратов II поколения на основе синтетических гормонов иммунитета (а-тимозина, тимопоэтин I, II) позволило обеспечить их надежную стандартизацию и усиление иммунорегулирующего действия.

   Однако расширение производства и применение лекарственных препаратов II поколения оказалось затруднительным из-за сложности химического синтеза пептидов с длинной полипептидной цепью и наличия у них полифункциональных участков. Поэтому дельнейшие исследования касались изучения структурно-функциональных особенностей и поиска активных фрагментов естественных гормонов иммунитета. Сравнительный анализ фрагментов различных тимических гормонов показал, что только активные синтетические фрагменты тимопоэтина способны воспроизводить иммунорегули- рующее действие естественного тимического гормона на периферическую иммунную систему организма с достижением терапевтического эффекта Им- мунофана, а другие, например, короткие фрагменты тимозина, не обладали иммунорегуляторной активностью и не получили развития для их лекарственного применения.

   Тимозин (XI1 обнаружен в составе тимозина фракции 5 как сопутствующий продукт при выделении тимозина <х|. Полипептид содержит 35 аминокислотных остатков, причем 28 из них идентичны тимозину а. Наличие общего Ы-концевого участка придает тимозину а! 1 ряд общих биологических свойств с тимозином <Х1. Фрагменты И-концевого участка тимозина (Х) обеспечивают высокую активность в реакциях Е-розеткообразования, а фрагменты карбоксильного конца обладают активностью в реакции смешанной культуры лимфоцитов, что придает тимозину ап однотипность иммунологических эффектов. Возможно, что тимозин ап является биологическим предшественником тимозина а |.

   Тимозин (Заявляется первым из семейства Р-тимозинов, который выделен в чистом виде и сиквенирован. Тимозин |3₄ имеет последовательность из 15 аминокислот, общую с тимозином с^ и, возможно, является его более ранним предшественником. Обнаружено, что тимозин р4 идентичен убикви- тину и присутствует в различных тканях и органах: тимусе, головном мозге, селезенке, перитонеальных макрофагах и т.д. Одним из характерных эффектов тимозина 04 является его способность стимулировать в клетках костного мозга экспрессию терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы, то есть имеет активность, сходную с действием МП⁷.

   Ряд других полипептидов из семейства Р-тимозинов: тимозин р₈, р9, рю к настоящему времени также получены в чистом виде. Определена последовательность их аминокислот. Однако, биологическая активность данных полипептидов еще не установлена. Возможно, семейство Р-тимозинов выполняет роль более ранних предшественников биологически активных пептидов.

   В 1974 году Г.Гольдштейн выделил из ткани тимуса два полипептида, получивших название тимин 1 и тимин 2 (В.В.Лебедев, С.Г.Кремлев, 1994). Позднее они были переименованы в тимопоэтин 1 и тимопоэтин 2. Оба полипептида оказывают влияние на нервно-мышечную проводимость и не различаются по своему действию на иммунную систему организма. Структурные различия тимопоэтина 1 и 2 связаны с положением двух аминокислот (1 и 43) и, по-видимому, отражают полиморфизм одного функционирующего гормона, подобно тому, как это наблюдается у инсулина, когда у единственного организма существует два гена, обеспечивающих продукцию двух видов инсулина, отличающихся единичной аминокислотной заменой. Путем поиска функциональных активных центров синтезирован фрагмент тимопоэтина 2- пентапептид, соответствующий положению 32-36 аминокислот тимопоэтина. Синтетический пентапептид, получивший название тимопентин

   . L. , ' '

   (ТР-5) обладает той же активностью, что и нативный тимопоэтин

   " * ' -

   (В.В.Лебедев, М.И.Титов, 1988). Тимопентин индуцирует созревание предшественников Т-лимфоцитов in vitro и в то же время ингибирует фенотипи- ческую дифференцировку in vitro В-клеток.

   Несколько позднее, в 1981 году, из ткани селезенки был получен полипептид, обладающий высоким химическим сходством с тимическими полипептидами- тимопоэтином 1 и 2. Данный полипептид первоначально получил наименование тимопоэтин 3. Однако, в дальнейшем в связи с обнаружением новых биологических свойств, он был переименован в спленин. По химической структуре спленин отличается от тимопоэтина 2 только по замене в 43 положении сериновой кислоты у тимопоэтина 2 на гистидиновую у спленина и ь 34 положении аспарагиновой кислоты на глютаминовую. В отличии от тимопоэтина 2 тимуса, спленин не оказывает влияния на нервно- мышечную проводимость и стимулирует фенотипическую дифференцировку предшественников В-лимфоцитов in vitro. Таким образом, тимопоэтин 2 и спленин обладают совершенно различным действием на нервно-мышечную

   проводимость и популяцию В-лимфоцитов. Очевидно, что такое различие связано с заменой аминокислот в первичной структуре обоих полипептидов.

   Данные различия отчетливо прослеживаются на примере их коротких синтетических фрагментов. Оказалось, что фрагмент спленина- спленопен- тин, содержащий последовательность 32-36, оказывает такое же биологическое действие, как и естественный полипептид. Сравнение структуры спле- нопентина и тимопентина показало, что короткий фрагмент спленина содержит замену в 34 положении, котрая обеспечивает специфичность его действия, и поэтому является функционально значимой.

   Таким образом, специфичность биологических и иммунологических эффектов естественных тимопоэтинов и их .синтетических фрагментов- ти- мопоэтина и спленопентина- обусловлена заменой единственной аминокислоты в 34 положении. Как уже отмечалось, естественные тимические тимо- поэтины 1. и 2 несут различие ив 43 положении аминокислот, которое однако не существенно для проявления их биологических свойств. Таким образом, ⁴ лишь отдельные замены в положении аминокислот у естественных и синтетических пептидов оказываются значимыми для изменения их биологической -активности. Данный феномен открывает широкие перспективы для поиска новых синтетических коротких пептидов путем минимального изменения их структуры и определения функционально значимых замен аминокислотных остатков.

   Среди биологически активных веществ, выделенных из ткани тимуса, существует самостоятельная группа соединений, получившая название тимо- ны. Выделяют три группы тимонов: тимон А, В и С, которые обладают некоторым сходством по биологическому действию.

   Группа тимонов обладает мощным стимулирующим действием на ми- тотическую активность лимфоцитов и по своему эффекту имеет ряд общих свойств с Т-клеточным фактором роста (ТССИ).

   Другие иммунологические активные вещества продуцируются непосредственно в межклеточное пространство, где оказывают влияние по пара- кринному типу действия. Такой тип продукции обеспечивает высокие концентрации вещества среди клеток ближайшего окружения. Паракринный тип действия, по-видимому, реализуется в системе межклеточного взаимодействия А- клеток, Т- и В- лимфоцитов для интерлейкинов и других факторов роста и дифференцировки клеточных популяций.

   Результаты предыдущих исследований и данные научной литературы о роли пептидных тимических гормонов иммунитета, как центральных регуляторах иммунной системы организма, уже позволили создать на их основе три генерации лекарственных препаратов иммунокорригирующего типа действия. К числу таких препаратов следует отнести: Тактивин, Тимолин и Ти- мопентин, полученные путем экстракции ткани тимуса и представляющие собой неразделенную смесь пептидов тимуса; Тимозин-ар синтетический пептидный гормон иммунитета и Тимунокс или тимопентин, содержащий синтетический фрагмент гормона тимуса тимопоэтина. Действие препаратов, содержащих пептидные гормоны тимуса, ограничено их влиянием на восста-,,. новление Т-системы иммунитета (А.У.О^с^ет, Т.Ь.К.Ьо\у, 1978; Ю.М.Лопухин, Р.В.Петров и др., 1978; В.Г.Морозов, В.Х.Хавинсон, 1978; С.Л.Максимов и др., 1990).

   Клиническое изучение препаратов, полученных на основе экстрактов ткани тимуса, продемонстрировало выраженное улучшение количественных и функциональных показателей Т-системы иммунитета с достижением положительного терапевтического эффекта у больных инфекционной и неинфекционной патологией (Ю.М.Лопухин, 1982; В.Х.Хавинсон, В.Г.Морозов, 1981; О.Г.Петрова, 1995; А.К.Сулейманов и др., 1992; В.И.Покровский и др., 1992; .ГСог^агш, .ШашеЬ а а1., 1979). Вместе с тем, препараты первого поколения обладают рядом существенных недостатков, которые резко ограничивают возможности их производства и применения. Экстракты тимуса представляют собой неразделенную смесь пептидов и других биологически активных веществ, что не позволяет проводить их стандартизацию.

   Создание лекарственных препаратов второго поколения на основе синтетических гормонов иммунитета (тимозин- аь тимопоэтин 1,2) позволило обеспечить их надежную стандартизацию и усиление иммунорегулирую- щего действия (W.B.Ershler, J.C.Hebert et al., 1985; T.K.Audhya, M.P.Scheid et al., 1984).

   Однако, масштабирование производства и применение лекарственных препаратов второго поколения оказалось затруднительным из-за сложности химического синтеза больших пептидов и наличия у них полифункциональных участков. Поэтому дальнейшие исследования касались изучения структурно-функциональной особенности и поиска активных фрагментов естественных гормонов иммунитета. Такие фрагменты были обнаружены в составе тимозина-ai и тимопоэтина I и II. На основе одного из таких фрагментов, включающего аминокислотные остатки 32-36 тимопоэтина, создан препарат .. третьего поколения - Тимунокс (Тимопентин) (G.Goldstein, T.K.Audhya, 1985). Экспериментальное исследование подтвердило полное соответствие его иммунорегулирующей активности и действия нативного тимопоэтина. Клиническое изучение тимунокса продемонстрировало его безвредность; способность частично или полностью восстанавливать нарушенные показатели Т-клеточного иммунитета;

   Терапевтическую эффективность при лечении острого и хронического стресса, рассеянного склероза, ревматоидного артрита; в качестве средства профилактики гнойно-септических осложнений в плане предоперационной подготовки хирургических больных (А.А.Лешин и др., 1993; A.S.Seiscnbuev et al., 1989) и для достижения адъювантного действия при назначении некоторых вакцин (Е.М.Вазничая, Л.М.Тарасенко и др., 1992; A.Cognazzo, D.Seliak et al., 1991; A.Afeltra, M.Galeazzi et al., 1991; M.Braga, A.D.Francesco et al., 1992; M.Palestini, A.Messina et al., 1990). Сравнительный анализ фрагментов различных тимических гормонов показал, что только активные синтетические фрагменты тимопоэтина способны воспроизводить иммунорегу- лирующее действие естественного тимического гормона на периферическую иммунную систему организма с достижением терапевтического эффекта (Т.М.Шелепова и др., 1992), а другие, например, короткие фрагменты тимо- зина- a] (C.Birr, 1984), рестриктированы по иммунорегуляторной активности и не получили развития для их лекарственного применения.

   Однако, дальнейший поиск естественных регуляторных пептидов тимуса для создания препаратов, отвечающих вышеуказанным требованиям, к настоящему времени, представляется исчерпанным по причине крайне ограниченного представительства тимических гормонов иммунитета и однотипности их действия.

   Поэтому перспектива создания новых регуляторных пептидов потребовала применения иных теоретических и методических решений.

   Изучение структурно-активностных взаимоотношений фрагментов отдельных пептидных. гормонов тимуса продемонстрировало широкие возможности для поиска новых иммунологически активных коротких пептидов. Наиболее значительные успехи в этом направлении достигнуты при исследовании фрагментов тимозина aj и семейства тимопоэтинов. Химический синтез коротких фрагментов тимозина ai позволил вскрыть причину его функционального многообразия в проявлении иммунорегуляторных эффектов.

   Сущность данного механизма действия заключается в том, что эффект стимуляции созревания Т-лимфоцитов по тесту экспрессии Thy- 1⁺ создается за счет фрагментов N- концевого участка тимозина a_l5 а влияние на реакцию смешанной культуры лимфоцитов опосредуется фрагментами С- концевого участка. Создание соответствующих фрагментов обеспечивает получение препаратов более узкого спектра действия по сравнению с нативной молекулой естественного регуляторного пептиДа- тимозина ai.

   Совершенно иная картина структурно-активностных взаимоотношений получена при изучении фрагментов семейства тимопоэтинов 1, 2 и 3 (T.Andhya et al., 1984). Оказалось, что специфическая активность семейства тимопоэтинов реализуется одним активным участком, локализованным последовательностью 32-36. Единственная замена аминокислотного остатка в

   гссу;:лггт;:21шля

   Biib.'IiiOTEILA

   34 положении вызывает глубокое изменение направленности действия тимо- поэтина 2 и тимопоэтина 3 (спленина). Тимопентин, фрагмент тимопоэтина, вызывает экспрессию Thy-1⁺ и не влияет на созревание В-лимфоцитов. Напротив, фрагмент спленина (спленопентин) индуцирует созревание предшественников В-лимфоцитов (Lyb- 2,1⁺).

   Таким образом, структурно-активностные взаимоотношения участка 32-36 характеризуются высокой изменчивостью эффектов при минимальной модификации структуры.

   Детальный анализ активного участка тимопоэтинов показал его высокую чувствительность к N и С- концевой элонгации пептидной цепи. В то же время, фрагменты активного участка, укороченные со стороны N- конца полностью теряют биологическую активность, а редуцирование со стороны карбоксильного конца вызывает снижение специфической активности.

   Таким образом, фрагмент тимопоэтинов 32-36 в наиболее полном объеме сохраняет иммунорегулирующие свойства естественного регулятор-

   ного пептида. Поэтому дальнейший поиск в направлении создания естественных фрагментов тимопоэтинов уже представляется нецелесообразным.

   Вместе с тем, высокая изменчивость эффектов при минимальной модификации структуры участка 32-36 предполагает получение его дериватов, потенциально способных к проявлению новых иммунорегуляторных свойств. Такие пептиды могут быть получены путем замены аминокислотных остатков в структуре самого активного участка или элонгации естественного фрагмента за счет негомологичного аминокислотного остатка. Существование единого активного участка в структуре тимопоэтинов значительно упрощает такого рода поиск по сравнению с определением аналогов тимозина aj. Кроме того, тимозин d| реализует эффект посредством индукции синтеза простагландинов, который может сохраняться и среди его аналогов (L.Kisfalndy, O.Nyeki et al., 1983).

   Представленные соображения побудили создать новую структуру короткого пептида, сохраняющую определенную гомологию с активным участком тимопоэтина 2.

   Создание пептидного препарата нового поколения, представленного в данной работе, теоретически основывается на результатах сравнительного анализа механизма действия регуляторных пептидов тимуса и экспериментальной оценки структурно-активностных взаимоотношений их различных участков.

   В представленном обзоре продемонстрирована возможность получения новых биологически активных соединений путем модификации аминокислотной последовательности естественного гормона тимуса и показаны пути создания препарата нового поколения для патогенетической и иммуно- корригирующей терапии инфекционных болезней.

   Развитие этого направления требует дальнейшего исследования фар- мако-токсикологических свойств данного препарата, показаний к его применению в медицинской практике и животноводстве с целью освоения его промышленного производства и внедрения в практику ветеринарии.

   3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

   С целью выяснения обратимости возможных патологических изменений, возникающих под влиянием вещества, на животных проведены «отставленные опыты», в которых животных обследовали через 3 недели после последнего введения тимогексина.

   По ходу эксперимента проводили наблюдения за общим состоянием и поведением животных, потреблением корма и воды, состоянием шерстного покрова, слизистых оболочек, регистрировали динамику массы тела и отдельных органов (в конце эксперимента).

   Состояние гомеостаза животных оценивали с помощью функциональных гематологических, биохимических и патоморфологических методов.

   Периферическую кровь оценивали по количеству эритроцитов и лейкоцитов (гемоцитометр, модель ГМЦ-3); гемоглобина (метгемоглобиновый метод- КФК-2-УХЛ-4,2); соотношение форменных элементов крови определяли в мазках, окрашенных по методу Романовского-Гимза; скорость оседания эритроцитов определяли с помощью аппарата Панченкова.

   Состояние сердечно-сосудистой системы оценивали по электрокардиограмме. Электрокардиограмму записывали на одноканальном электрокардиографе (модель- 060) во втором стандартном отведении.

   Для оценки функционального состояния печени, почек и других органов использовали комплекс биохимических исследований крови (определение белка биуретовым методом; активности трансаминаз метод Френкеля, глюкозы, креатинина, мочевины- с помощью диагностических наборов «Ла- хема»), а также «гексеналовый сон» и пробы с бромсульфалеином и феноловым красным. Соотношение белковых фракций определяли методом электрофореза на ацетатных пленках.

   По окончанию введения тимогексина, а также через один месяц после его отмены часть подопытных животных убивали. Убой проводили под эфирным наркозом. Убитых животных вскрывали, проводили макроскопическое изучение внутренних органов, определение их массы (абсолютный вес).

   В последующем проводили гистологические (микроскопические) исследования органов: тимуса, сердца, легких, почек, печени, надпочечников, селезенки, желудка, тонкого и толстого кишечника, лимфоузлов и гонад.

   Определение содержания гемоглобина проводили на эритрогемомет- ре, количества эритроцитов и лейкоцитов на приборе Р8Ь-1, гематокрита с помощью центрифуги ТН-12, подсчет тромбоцитов и лейкоцитарной формулы под микроскопом, окраска по Романовскому-Гимзе.

   Учитывали также активность аланиновой и аспарагиновой ами- нотрансфераз в плазме крови (по Рейтману и Френкелю), количество сахара в плазме крови (глюкозооксидазный метод), активность щелочной фосфатазы (каталитической концентрации щелочной фасфатазы) в плазме крови, количество общего белка в плазме крови (Диаком ОБ), холестерина в плазме крови (диагностический метод определения концентрации холестерина), содержание альбумина в плазме' крови (бромкрезоловый метод, Диаком ЧСА), мочевины в плазме крови (салицилатногипохлоритным реактивом).

   Для выявления патологических изменений в структуре органов и тканей проводили визуальный осмотр внутренних органов. Для гистологического исследования брали печень, почки, надпочечники, сердце, легкие, селезенку, головной мозг, толстую и тонкую кишку, щитовидную железу, тимус, поджелудочную железу, матку, яичники. В процессе вскрытия органы взвешивали. После фиксации в 10% формалине из них готовили гистологические препараты (окраска гематоксилин-эозином).

   Для изучения сенсибилизирующих свойств препарата, содержащего в качестве действующего вещества синтетический гексапептид иммунофан, использовали следующие модели анафилаксии: реакция общей анафилаксии (анафилактический шок); активная кожная анафилаксия; реакция гиперчувствительности «замедленного» типа на мышах; реакция гиперчувствительности «замедленного» типа на морских свинках; реакция иммунных комплексов; конъюнктивальная проба на морских свинках, кроликах.

   Имунофан вводили по схемам, соответствующим формированием изучаемых аллергических реакций и предложенных Минздравом России, Департаментом по внедрению новых лекарственных средств и медицинской техники, Фармакологическим комитетом в «Методических рекомендациях по оценкам аллергенных свойств фармакологических средств» (М., 1988 г.) в следующих дозах:

   Изучение потенциальной тератогенной активности имунофана проводили в соответствии с «Методическими рекомендациями по оценке мутагенности новых лекарственных средств», утвержденных Фармакологическим комитетом Минздрава СССР 15.01.1988 г. в тест-системах учета мутаций на микроорганизмах, клетках костного мозга млекопитающих и зародышевых клетках млекопитающих.

   Изучение способности имунофана вызывать генные мутации проводили на индикаторных бактериях в тесте Эймса Salmonella/микросомы.

   Сущность метода (Ames et al.. 1973) заключается в регистрации способности испытуемого соединения и/или , его метаболитов индуцировать генные мутации у индикаторных микроорганизмов в системе метаболической активации in vitro. Индикаторные бактерии вместе с исследуемым препаратом, постмитохондриальным супернатантом го- могената печени крысы (фракция S-9) и кофакторами (НАДФ, глюкозо-6- фосфат) вносят в слой верхнего полужидкого агара на чашки Петри. Влияние ферментов мутагенного эффекта у исследуемого препарата учитывали по индукции обратных мутаций от ауксотрофности по гисти- дину к прототрофности.

   Для получения хромосомных препаратов на стадии метафазы, использована методика C.Ford, J.Hamerton (1956) в модификации А.М.Малашенко, 1977; Г.Н.Золотарева с соавт. (1978).Учет доминантных летальных мутаций, индуцированных имунофаном вели в зародышевых клетках мышей. Доминантные летальные мутации - генетические изменения, индуцируемые в родительских зародышевых клетках и приводящие к гибели первое поколение на эмбриональных стадиях развития. Большая часть доминантных деталей представляет собой численные и структурные аберрации хромосом, частично они могут быть представлены генными мутациями. Мутагенный эффект проявлялся в виде повышенной эмбриональной смертности. Если яйцеклетка была оплодотворена сперматозоидом, несущим доминантную леталь, то смерть развивающегося эмбриона происходила как до, так и после имплантации. Для оценки мутагенных свойств лекарственных препаратов учитывают постимплантаци- онную смертность. Обычная схема проведения эксперимента включала проверку лекарственного препарата на самцах ^последующим спариванием обработанных самцов с интактными самками (A.M. Малашенко, 1977; U.Ehling etal., 1978). .

   Иммунорегулирующее действие тимических гормонов характеризуется их способностью стимулировать созревание Т-лимфоцитов. Данное свойство тимических гормонов положено в основу фармакологического скрининга. Так, оценка иммунорегулирующей активности препарата проводилась по тесту 50%-ного восстановления чувствительности фоновых розеткообра- зующих клеток селезенки тимэктомированных мышей к ингибирующему действию азатиоприна (Аз-РОК) (A.L. Goldstein, T.L.K. Low et al., 1978). Данный тест оценки экспрессии маркера дифференцировки Т-лимфоцитов аналогичен определению Thy-1 антигена с помощью соответствующей антисыворотки и является характеристикой зрелых Т-клеток (Poulter, Bredley et al., 1977). Результаты оценки продемонстрировали его способность стимулировать экспрессию Thy-1 маркера в дозе 9-25 мкг на 3x10⁶ кариоцитов.

   В дальнейшем была предложена модификация метода экстракции ткани тимуса, включающая выдерживание гомогената ткани в течение 12-16 часов и отбор на этапе гельхроматографии целевого продукта, содержащего пептиды с молекулярной массой 1500-6000 Да. Применение нового приема экстракции ткани тимуса позволило увеличить активность препарата по сравнению с Тимозином 5 в 10 раз по тесту Аз-РОК. Последующая работа была направлена на поиск новых индивидуальных иммунорегуляторных пептидов путем изучения их активности в сравнении с Тактивином.

   Для определения участия простагландинов в реализации иммунорегу- лирующего действия синтетического производного тимопоэтина - имунофа- на было изучено его влияние на продукцию естественного гормона тимуса- тималина у тимэктомированных мышей в условиях ингибирования синтеза 111 Н2 индометацином. Индометацин, согласно методике (Е. Garaci, С. Favalli et al., 1983), вводили внутрибрюшинно тимэктомированным мышам в дозе 100 мкг/мышь, которая обеспечивает ингибирование синтеза ПГЕг. Спустя 30 минут животные получали Тактивин, тимопоэтин 1 (фрагмент 27-43) или имунофан соответственно в дозе 1 мкг/мышь. Определение работающих титров тимулина по тесту Аз-РОК осуществляли согласно стандартной методике. Как следует из полученных данных, имунофан на фоне блока синтеза 111 ±2 вызывает восстановление продукции тимулина. Напротив, комплекс пептидов тимуса- Тактивин и индивидуальный гормон- тимопоэтин теряют специфическую активность в условиях премёдикации индометацином.

   С целью дальнейшего изучения механизмов иммунорегулирующего действия имунофана представляло интерес определить его влияние на продукцию ИЛ-2, как универсального фактора пролиферации лимфоцитов. Для решения этой задачи мышам линии СБА вводили имунофан в дозах 0,05-1,25 мкг/мышь внутрибрюшинно, через 1, 2 и 3 дня выделяли клетки селезенки и определяли продукцию ИЛ-2 in vitro. При определении ИЛ-2 клетки селезенки культивировали в присутствии 5 мкг/мл Кон A («Calbiochem», Швейцария) в течение 20 часов. Концентрацию ИЛ-2 в надосадочной жидкости (НЖ) определяли по способности усиливать пролиферацию клеток ИЛ-2- зависимой линии CTLL-2, оцениваемую по включению ³Н-тимидина. В качестве стандарта использовали рекомбинантный ИЛ-2 («Cetus», США) в концентрации 0,5-50 МЕ/мл. Количество ИЛ-2 в НЖ оценивали в МЕ/мл, используя калибровочную кривую, полученную при использовании стандарта.

   Особенный интерес представляло изучение действия имунофана на синтез ИЛ-2 мононуклеарными клетками периферической крови здоровых доноров. Для решения поставленной задачи исследовали способность лимфоцитов продуцировать ИЛ-2 в ответ на стимуляцию Кон А (5 мкг/мл). Инкубацию с митогеном осуществляли в среде 11РМ1-1640, содержащей 2% сыворотки АВ, в течение 24 часов". Содержание ИЛ-2 оценивали по способности образцов поддерживать рост ИЛ-2-зависимой цитотоксической клеточной линии (СТЬЬ-2). В качестве контроля использовали раствор рекомби- нантного ИЛ-2 с известной активностью.

   Радиозащитные свойства имунофана оценивали по его способности снижать воздействие перекисных соединений на структуру ДНК и ее репарацию, сокращать летальность и восстанавливать защитную функцию иммунной системы при лучевом поражении." ' '

   Экспериментальное изучение препарата на животных проводили в условиях облучения мышей летальной дозой радиации. В качестве экспериментальной модели использовали белых мышей. Непосредственно перед облучением мышам опытной группы вводили имунофан в дозе 1,5 мкг/кг в объеме 0,25 мл изотонического раствора хлорида натрия. Контрольные животные получали равный объем физиологического раствора.

   Влияние препарата на продукцию антителообразующих клеток (восстановление иммунной защиты организма) изучали в условиях экспериментального радиационного иммунодефицита созданного сублетальной дозой ионизирующего излучения.

   В модельных экспериментах исследовали защитное действие имму- нофана при повреждении ДНК лимфоцитов перекисью водорода. Для этого лимфоциты, выделенные из периферической крови человека, инкубировали в питательной среде при 37С с иммунофаном (10 нг/мл) в течение 15 мин, затем к клеткам добавляли перекись водорода в концентрации 10,0-50,0 мкм и продолжали инкубировать в питательной среде еще 1 час. Затем исследовали структуру ДНК лимфоцитов.

   Структуру ДНК лимфоцитов и нейтрофилов больных и здоровых доноров в разные сроки после добавления имунофана изучали с помощью прямого флюоресцентного метода с бромистым этидием в качестве флюорофора в модификации. При этом оценивали скорость щелочной денатурации ДНК в процентах ДНК, остающейся в форме двунитевой ДНК (дДНК) через 1 час инкубации лизата клеток при 15С после установления денатурирующего значения pH 12.8 в течение 30 минут при 0С. Эта величина определяется количеством однони- тевых разрывов и щелочелабильных сайтов, которые в процессе щелочного лизиса превращаются в разрывы. Флюориметрию проводили на флюориметре "Jasco FP 550" при L возбуждения 520 нм и L эммис- сии 590нм. - .

   Способность лимфоцитов к репарации ДНК оценивали по соотношению величин индуцированного УФ-облучением и спонтанного репа- ративного синтеза ДНК. Для этого свежевыделенные лимфоциты суспендировали в среде Хенкса и делили суспензию на две части (2-6x10 клеток в 1мл), одну из которых облучали УФ-светом от лампы БУФ-30 в дозе 100 Дж/м , а другую использовали для определения спонтанного репаративного синтеза ДНК. Контрольные и облученные клетки суспендировали в питательной среде RPMI 1640 в концентрации 2-6x10⁶ клеток в 1мл с 10% фетальной бычьей сыворотки, добавляли оксимо- чевину (10 мМ) для подавления репликативного синтеза и через 15 мин добавляли Н-тимидин (40 мкКи/ммоль, 10 мкКи/мл), после чего пробы инкубировали 2 ч при температуре 37С. Затем клетки собирали на фильтры с помощью автоматического устройства "Харвестер" и после отмывания 5% ТХУ и водой от кислоторастворимых продуктов определяли радиоактивность кислотонерастворимых продуктов ДНК. Способность лимфоцитов к репарации ДНК рассчитывали по отношению удельной радиоактивности ДНК УФ облученных клеток к удельной радиоактивности контрольных клеток и выражали в условных единицах. Спонтанный репаративпый синтез оценивали в имп./мин/10 клеток. . .

   Анализ субпопуляций лимфоцитов проводили при помощи проточного цитофлюориметра - анализатора и сортировщика клеток EPICS-C. (Coulter Electronics, Florida USA). Для возбуждения флюоресценции использовали аргоновый лазер ARGON-Innova 90-6 (Coherent, USA) с длиной волны 488 нм.

   Лечебно-профилактическое действие препарата изучали при заболеваниях желудочно-кишечного тракта (диспепсии, гастроэнтериты, ко- либактериозы телят, поросят и цыплят), бронхопневмонии, парагриппе, ИРТ телят, эндометрите крупного рогатого скота, микроспории и чуме собак. Заключение о положительном действии препарата давали на основании комплексных специфических клинических, биохимических, гематологических и иммунологических методов исследований. Лечебно- профилактическую эффективность определяли в сравнении с широкопри- меняемыми при данных показаниях препаратами и отрицательным контролем. Отдельные испытания были проведены комиссионно с участием животноводов и ветспециалистов хозяйств.

   Все полученные данные обрабатывали методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стъюдента. Результаты считали достоверными при р<0,05.

   4. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

   4.1. Синтез олигопептидов и методы контроля имунофана.

   Фрагмент тимопоэтина I, получивший наименование тимопентин, вызывает экспрессию маркера Т-лимфоцитов и не влияет на созревание В- лимфоцитов. Напротив, фрагмент тимопоэтина III, получивший наименование спленопентин, индуцирет созревание предшественников В-лимфоцитов.

   Таким образом, структур"но-активностные взаимоотношения данного участка характеризуются высокой изменчивостью эффектов при минимальной модификации последовательности аминокислотных остатков.

   Высокая изменчивость иммунологических эффектов при минимальной модификации активного участка указывает на возможность получения его дериватов, способных к проявлению новых иммунорегуляторных свойств. Такие регуляторные пептиды могут-быть получены путем замены аминокислотных остатков в структуре самого активного участка или элонгации фрагмента за счет негомологичного аминокислотного остатка. Основываясь на представленных соображениях осуществлен синтез ряда пептидов, среди которых наибольший интерес представил гексапептид, получивший наименование имунофан.

   Синтез олигопептидов осуществляли методом последовательного наращивания аминокислотной цепи с помощью активированных эфиров. Защитные группы удалялись с помощью каталитического гидролиза нал палла- диевым катализатором на угле и ацидолиза. Тонкослойная хроматография проводилась в системах хлороформ-метанол-32% уксусная кислота 60:45:20 (система 1) и бутанол-уксусная кислота-вода 3:1:1 (система 2). Индивидуальность соединения подтверждали методом жидкостной хроматографии высокого давления (ЖХВД) путем обратнофазовой гидрофобной хроматографии на колонках «Spherisorb ODC» в градиенте концентрации ацетонитрила (520%) с использованием 1%-ной трифторуксусной кислоты в качестве гидрофобного контриона (pH 2,13). Регистрацию оптической плотности материала проводили в проточной микрокювете при 220 нм. Структуру и состав полученного олигопептида подтверждали путем определения аминокислотного состава и методом инфракрасной спектроскопии или спектроскопией ядерного магнитного резонанса при 500 Мгц (Ю.М.Лопухин и др.).

   Анализ полученного гексапептида в тесте первичной иммунофарма- кологической оценки показал увеличение его активности в 1000 раз по сравнению с ранее полученным комплексом пептидных гормонов тимуса Такти- вином. Предложенная методика модификации структуры естественного гормона иммунитета позволила не только усилить специфическую активность имунофана, но также адаптировать его действие, как средства патогенетической терапии (М.И.Титов и др., О.С.Слепова и др., 1997). Так, например, препараты, содержащие естественные регуляторные пептиды тимуса, такие как тимозин, тактивин, тимунокс и ряд других, реализуют иммуномодули- рующий эффект посредством индукции - ПГЕ-2. Напротив, иммунорегули- рующее действие имунофана не требует сопряженной продукции простаг- ландинов и его влияние осуществляется альтернативным способом, что позволяет рекомендовать имунофан в комплексной терапии совместно с противовоспалительными препаратами нестероидного ряда.

   Ветеринарный препарат имунофан представляет собой синтетический гексапептид аргинин - альфа-аспарагил - лизил — валил — тирозил - аргинин (СзбН^ОюМи). Его применяют для коррекции иммунодефицитных состояний, комплексной профилактики и лечения кишечных и респираторных заболеваний вирусной, бактериальной этиологии, внутриутробных бактериально-вирусных инфекциях, а также для увеличения титра и продолжительности циркуляции специфических антител при вакцинации животных.

   Препарат имунофан должен соответствовать требованиям нижеприведенных показателей условий и изготавливаются в соответствии с экспериментально-производственным регламентом, утвержденным в установленном порядке.
   

   Таблица 1.

   Определение внешнего вида, цвета, запаха. Прозрачная жидкость без цвета и запаха. 0,005%-ный раствор препарата должен быть прозрачным и бесцветным по сравнению с водой.

   Определение рН. рН 6,5 + 0,5 (0,005%-ный раствор препарата потен- циометрически, ГФ XI, стр. 791).

   Подлинность имунофана и глицина определяют методом ВЭЖХ. Для этого 20 мкл 0,005%-ный раствора имунофана наносят на аналитическую колонку типа ОЭБ 5 мкм (4,6 х 250) мм; в качестве подвижной фазы использовать градиент ацетонитрила в 0,1 %-ном растворе трифторуксусной кислоты (1-20%). Элюировать 20 минут со скоростью 1 мл/мин. Глицин элюируют при концентрации ацетонитрила (2 + 1) %, а фармакологическое вещество- при концентрации ацетонитрила (12 + 3) %. Детекцию проводят с помощью проточного спектрофотометра при длине волны 220 нм.

   Показатели имунофана

   Количественное определение содержания глицина и активного вещества 20 мкл 0,005%-ного раствора имунофана наносят на аналитическую ко
   лонку типа ODS 5 мкм (4,6 х 250) мм; в качестве подвижной фазы использовать градиент ацетонитрила в 0,1 %-ном растворе трифторуксусной кислоты (1-20%). Элюировать 20 минут со скоростью 1 мл/мин. Глицин элюируют при концентрации ацетонитрила (2 + 1) %, а фармакологическое вещество- при концентрации ацетонитрила (12 + 3) %. Детекцию проводят с помощью проточного спектрофотометра при длине волны 220 нм. Содержание глицина должно быть (5 + 0,5) мг, а фармакологического вещества (50 + 5) мкг.

   Определение механических примесей. Препарат не должен содержать механических примесей (ГФ XI, с. 165-166). Определение проводят по методу приведенному выше.

   Определение стерильности. Препарат должен быть стерильным. Контроль стерильности производят согласно ГФ XI, стр. 187 как препарата, не обладающего антимикробным действием.

   Определение токсичности. Препарат должен быть не токсичным. Испытание на токсичность проводят по ГФ XI, стр. 182. Тест-доза 0,5 мл в брюшную полость. Срок наблюдения 24 часа.

   Испытание на пирогенность. Препарат должен быть апирогенным. Тест-доза 0,2 мл/кг массы кролика. Исследования ведут в соответствии с ГФ XI, стр. 183.

   4.2. Токсикологические свойства иммунофана 4.2.1. Общетоксические свойства имунофана

   Изучение токсичности (острой и хронической) имунофана проводили на половозрелых животных (мыши, крысы, собаки), обоего пола. Мыши и крысы были доставлены из питомника АМН СССР «Белый мох». Животных содержали в виварии, в стандартных клетках, обеспечивали полноценными кормами в необходимом количестве.

   Острую токсичность препарата определяли на 60-ти белых беспородных мышах. Вещество вводили однократно подкожно, в объеме 0,1 мл на 10 г веса мыши. Длительность наблюдения за животными составляла 14 дней.

   Состояние животных оценивали по поведению, пищевой активности, изменению массы тела.

   Хроническую токсичность лекарственной формы имунофана изучали на двух видах животных: на 160 крысах и 27 собаках (испытывали лекарственную форму тимогексина). При подборе доз для проведения хронических экспериментов учитывали рекомендуемую терапевтическую дозу для клинических исследований, а также величины ЛД50 препарата при подкожном введении мышам. Исходя из этого, его терапевтическая доза была равна 0,5 мкг/кг (1/120000 от ЛД50) и промежуточная (между субтоксической и терапевтической)- 5 мкг/кг (1/12000 от ЛД50). Препарат вводился подкожно.

   Контрольным группам животных вводили подкожно стерильный физиологический раствор. Объем вводимых препаратов (в опытной и контрольной группах) были эквиваленты.

   Учитывая длительность курса и''путь введения имунофана, рекомендуемых для клинической практики, исследуемое вещество вводили животным подкожно в течение одного месяца.

   С целью выяснения обратимости возможных патологических изменений, возникающих под влиянием вещества, на животных проведены «отставленные опыты», в которых животных обследовали через 3 недели после последнего введения тимогексина.

   По ходу эксперимента проводили наблюдения за общим состоянием и поведением животных, потреблением корма и воды, состоянием шерстного покрова, слизистых оболочек, регистрировали динамику массы тела и отдельных органов (в конце эксперимента).

   Состояние гомеостаза животных оценивали с помощью функциональных гематологических, биохимических и патоморфологических методов.

   По окончанию введения тимогексина, а также через один месяц после его отмены часть подопытных животных убивали. Убой проводили под эфирным наркозом. Убитых животных вскрывали, проводили макроскопическое изучение внутренних органов, определение их массы (абсолютный вес).

   В последующем проводили гистологические (микроскопические) исследования органов: тимуса, сердца, легких, почек, печени, надпочечников, селезенки, желудка, тонкого и толстого кишечника, 12-перстной кишки, лимфоузлов и гонад.

   В результате проведенных исследований острой токсичности установлено, что при однократном подкожном введении имунофана мышам в максимальных дозах (30-60 мг/кг) отмечалось резкое угнетение двигательной и рефлекторной активности мышей.'Подопытные животные не реагировали на посторонние шумы, постукивания по клетке и лишь только при сильном уколе их иглой несколько отодвигались в противоположную сторону. Отмеченное состояние у мышей наблюдалось в течение 50-70 минут. В последующем постепенно (в течение 2-3 часов) наблюдалась нормализация двигательной и рефлекторной активности.

   V Гибели у подопытных мышей в течение суток не отмечалось. Наблюдения за мышами в последующие 14 суток не выявили значительных отклонений от нормы поведения животных в целом. Гибели не отмечалось. Учи... тывая малые рекомендуемые терапевтические дозы (0,5 мкг/кг), сочли нецелесообразным дальнейшее определение ЛД₅₀ тимогексина.

   При изучении хронической токсичности имунофана установлено, что поведение животных, получавших препарат и находящихся в клетке, практически не отличалось от поведения крыс, находившихся в контроле. Исследование двигательно-эмоциональной активности крыс по тесту «открытое поле» позволило обнаружить дозозависимое снижение (в отдельных группах значимое) горизонтальной, исследовательской активности, а также уменьшение груминга как у самок, так и у самцов. Однако, снижение двигательной (горизонтальной и исследовательской) активности у крыс сопровождалось отчетливым увеличением эмоционального фона (в 2 раза) у самцов, получающих тимогексин в дозе 0,5 и 50 мкг/кг, тогда как у самцов с дозой тимогексина 5 мкг/кг эмоциональность была отчетливо снижена (50%). У самок эмоциональный уровень практически не изменялся, отмечалось лишь некоторое его подавление у животных с дозой тимогексина 0,5 мкг/кг. После отмены применения отмечалось восстановление эмоционального уровня у подопытных самок и самцов, однако, исследовательская активность самцов и их груминг были значительно ниже контрольных (табл. 2).

   Оценивая динамику массы тела подопытных крыс, выявлен отчетливый прирост массы тела самцов, получавших препарат в дозе 0,5 и 50 мкг/кг и самок, получавших его в дозе 5 и 50 мкг/кг. У самок с дозой тимогексина 0,5 мкг/кг и самцов- 5 мкг/кг прирост массы тела относительно контрольных животных был не выражен и даже несколько отставал (у самок). После отмены препарата прирост массы тела у опытных крыс, в сравнении с контрольными животными, был отрицательным (,табл. 3).

   Анализ электрокардиограмм, а также системного артериального давления и частоты сердечных сокращений не выявил значительных отличий у -подопытных и контрольных крыс. Отмечалось лишь некоторое урежение частоты сердечного ритма у крыс, получавших препарат в дозе 0,5 мкг/кг, а урежение числа дыхательных движений у опытных крыс в дозе 50мкг/кг. Однако, указанные отличия были статистически незначимы и не превышали рамок физиологической нормы (табл. 4).

   Анализ динамики периферической крови крыс выявил четкую, но недостоверную тенденцию снижения общего количества эритроцитов у самок и самцов, получавших тимогексин. При этом общее количество гемоглобина не изменялось (у самок) или недостоверно уменьшалось (у самцов), а соотношение концентрации гемоглобина и числа эритроцитов (цветовой показатель) было в пределах единицы. Скорость оседания эритроцитов и свертывания крови у контрольных и подопытных крыс были аналогичны. Количество лейкоцитов у опытных самцов было в пределах нормы, однако, прослеживалась четкая дозозависимая тенденция к их снижению. В их лейкограмме значимых сдвигов не обнаружено, отмечалось лишь некоторое (р<0,05) увеличение содержания лимфоцитов у самок на 20% (табл. 5).

   т «

   Поведение крыс в «открытом поле» при назначении иммунофана

   Таблица 2.

   Таблица 3.

   Масса тела крыс, получавших иммунофан

   *- изменения достоверны по отношению к исходу при р<0,05

   с I #

   Таблица 4.

   Частота сердечных сокращений, дыхание и АД крыс после введения иммунофана

   *- изменения достоверны по отношению к исходу при р<0,05

   Таблица 5.

   Показатели периферической крови крыс после введения имунофана

   I с I

   продолжение таблицы 5.

   . т «

   Биохимические показатели крови крыс после введения иммунофана

   Таблица 6.

   *- изменения достоверны по отношению к исходу при р<0,05
   

   Биохимические показатели крови крыс после отмены имунофана

   изменения достоверны по отношению к контролю при р<0,05

   Биохимические исследования сыворотки крови крыс позволили обнаружить неоднозначные (во время опыта снижение, в отставленных опытах - повышение) сдвиги в количественном содержании белка и глюкозы (достоверно значение в дозе 0,5 мкг/кг). Однако, отмеченные сдвиги не носили патологического характера, т.к. не выходили за рамки допустимых норм. В сыворотке крови самцов значимых изменений не обнаружено как во время введения препарата, так и после его отмены (табл. 6, 7).

   При проведении пробы «гексеналовый сон» было обнаружено отчетливое (60% и более) удлинение латентного периода у крыс, получавших имунофан (статистически значимое в дозе 0,5 мкг/кг у самок и в дозе 50 мкг/кг у самцов), тогда как продолжительность гексеналового сна практически не изменялась. Отмечалось лишь недостоверное уменьшение длительности гексеналового сна у самцов, получавших препарат в дозе 5 и 50 мкг/кг (в среднем на 25-30%), сохраняющееся и после его отмены. В отставленных опытах значимых отклонений в продолжительности латентного периода и длительности гексеналового сна у крыс не обнаружено (табл. 8).

   С феноловым красным отмечалось нарастание эффекта (в зависимости от дозы) скорости выведения красителя почками самок. У самцов подобных изменений не обнаружено. В отставленных опытах наблюдаемые изменения были статистически незначимы (табл. 9).

   Исследования физико-химических свойств мочи у подопытных крыс практически не выявило существенных различий с контрольной группой. У самцов, получавших препарат в дозе 0,5 и 5 мкг/кг, отмечалось незначимое (р<0,05) увеличение концентрации рН (табл. 10).

   Исследования гемокоагулограмм подопытных крыс позволили обнаружить тенденцию (в дозе 5 мкг/кг достоверно значимую) уменьшения длительности свертывания крови у самок. Кроме того, у самок, получавших ти- могексин, отмечалось отчетливое повышение гематокрита (достоверное в дозе тимогексина 0,5 мкг/кг). О величине гематокрита судили по максимальной амплитуде колебаний на диаграммной ленте при записи скорости

   Длительность «гексеналового сна» у крыс после отмены имунофана

   *- изменения достоверны по отношению к контролю при р<0,05
   

   Печеночные и почечные функциональные пробы крыс после введения имунофана

   Таблица 9.

   « « *

   Скорость свертывания крови крыс при назначении имунофана

   изменения достоверны по отношению к контролю при р<0,05

   свертывания крови. При анализе гемокоагулограмм подопытных самцов значимых различий с контрольными не обнаружено (табл. И). После отмены скорость свертывания и величина гематокрита самок и самцов подопытных и контрольных групп были аналогичны.

   При изучении хронической токсичности имунофана на собаках показано, что препарат практически не оказывал влияния на их поведение и прирост массы тела. Отмечалось лишь некоторое снижение двигательной активности у собак, получавших его в'дозе 50 мкг/кг. А увеличение массы тела у собак с дозой 0,5 и 5 мкг/кг было недостоверно. После его отмены поведение у подопытных собак и их масса тела практически не отличалась от группы животных, находящихся в контроле (табл. 12).

   Анализ состава периферической крови собак показал, что введение препарата собакам (подкожно, 1 месяц) в дозах 0,5 и 5 мкг/кг способствовало некоторому увеличению количества лейкоцитов, однако, указанное увеличение отмечалось только в сравнении с контрольной группой животных (в 2 раза), но оставалось в пределах существующих физиологических норм. У этих же животных отмечалось снижение общего количества эритроцитов (на 25-30%). Величины содержания гемоглобина оставались в пределах нормы. В связи с этим наблюдалось повышение среднего содержания гемоглобина в эритроцитах, цветовой показатель был увеличен на 50% и более. В лейко- грамме собак, получавших препарат в дозе 0,5 и 5 мкг/кг, по отношению к контролю, отмечалось достоверное увеличение содержания эозинофилов и базофилов (что, однако, соответствует норме здоровых собак). У 60% подопытных собак, получавших имунофан в дозе 0,5 мкг/кг, в лейкограмме отмечалось также незначительное увеличение содержания лимфоцитов. У собак, получавших его в дозе 5 мкг/кг, увеличение содержания лимфоцитов было выражено в большей степени (на 40-60%) (табл. 13-16).

   При введении препарата собакам в дозе 50 мкг/кг отмечалось более выраженное снижение количества эритроцитов и гиперхромия. Среднее

   Динамика массы тела собак при назначении имунофана в дозе 0,5 мкг/кг

   Таблица 13.

   Показатели периферической крови собак, получивших имунофан (сводная таблица)

   Таблица 14.

   Периферическая кровь собак при назначении имунофана в дозе 0,5 мкг/кг

   « I 1 *

   .Периферическая кровь собак при назначении имунофана в дозе 5 мкг/кг

   Периферическая кровь собак при назначении тимогексина в дозе 50 мкг/кг

   Таблица 16.

   Периферическая кровь собак после отмены тимогексина в дозе 0,5 мкг/кг

   . , Ч-.-.1 . ; .

   «

   ' 76

   Показатели периферической крови контрольных собак

   Таблица 19.

   Биохимические показатели сыворотки крови собак при назначении тимогексина в дозе 0,5 и 5 мкг/кг

   Таблица 20.

   Биохимические показатели сыворотки крови собак при назначении тимогексина в дозе 50 мкг/кг

   Таблица 21.

   Биохимические показатели сыворотки крови собак после отмены тимогексина в дозе 0,5,5 и 50 мкг/кг

   Биохимические показатели крови собак, получавших имунофан (сводная таблица)

   количество лейкоцитов было в пределах существующих норм. А в лейко- грамме собак увеличение содержания лимфоцитов отмечалось у самок.

   После его отмены, через месяц, у собак отмечалось восстановление количества эритроцитов и цветного показателя, однако, в лейкоформуле самок отмечался умеренный лимфоцитоз (табл. 17 и 18).

   Биохимические исследования сыворотки крови собак показали, что тимогексин в указанных дозах практически не оказывал влияния на основные показатели крови собак. Отмечалось незначительное снижение глюкозы у собак, получавших препарат в дозе 0,5 мкг/кг и увеличение креатинина у всех подопытных групп. Однако указанные колебания были статистически недостоверны и соответствовали физиологическим константам (табл. 19-23).

   4.2.2. Патоморфология при применении имунофана - При вскрытии контрольных и получавших имунофан (0,5-50 мкг/кг) животных (крысы, собаки) у 20% крыс определялись мелкоточечные образования темно-красного цвета, расположенные субплеврально в области правого или левого легкого, у 3% крыс определялись очаги темно-красного цвета в прикорневой зоне легких. Остальные органы грудной и брюшной полости у контрольных и подопытных животных были обычных размеров, или у животных, получавших препарат в субтоксических дозах, несколько гипереми- рованы. Серозные оболочки блестящие, гладкие. Патологических изменений не обнаружено.

   Анализ данных абсолютной массы тела и внутренних органов у крыс, получавших тимогексин, показал, что относительная масса внутренних органов изменялась незначительно. Вместе с тем, у самцов (доза тимогексина 0,5 и 5 мкг/кг) отмечалось уменьшение массы тимуса (40-50%), как во время введения препарата, так и после его отмены (табл. 23), тогда как у самок во время введения тимогексина масса тимуса изменялась неоднозначно и недостоверно зависела от дозы. В отставленных опытах отмечалось отчетливое (30-40%) уменьшение массы тимуса (табл. 23).

   т « «

   Абсолютная масса тела и органов крыс-самок (в граммах), получавших имунофан

   ^щ 84

   Таблица 23.

   Микроскопические исследования органов крыс. В микропрепаратах — сердца опытных крыс (самки и самцы), кардиомиоциты имеют вытянутую форму. Четко выражена поперечная исчерченность кардиомиоцитов. Ядерный аппарат клеток представлен ядрами округлой или овальной формы со светлой кариоплазмой, с четко выраженными глыбками хроматина. Микро- циркуляторное русло без видимой патологии (дозы 0,5 и 5 мкг/кг или в состоянии спазма (доза 50 мкг/кг), в котором лишь отдельные капилляры, располагающиеся преимущественно в субэндокардиальной зоне, расширены и заполнены элементами крови.

   Легкие без видимой патологии. По ходу бронхов (у отдельных крыс) определяются незначительные инфильтраты лимфогистоцитарного характера.

   В, печени .хорошо прослеживается дольчатое строение, центральные вены несколько расширены, заполнены элементами крови. Печеночные клетки, образующие балки, имеют округлую или кубическую форму, цитоплазма отдельных гепатоцитов в состоянии зернистой дистрофии (доза 50 мкг/кг). Портальные тракты представлены тонкими прослойками соединительной ткани. Вокруг сосудов и желчных ходов- единичные лимфогистоцитарные инфильтраты. Желчные ходы и капилляры проходимы. Межбалочные синусы у крыс с дозой 0,5 мкг/кг и 5 мкг/кг несколько расширены, в единичных случаях полнокровны центральные вены, а у крыс с дозой 50 мкг/кг межбалочные синусы в состоянии ателектаза.

   В почках корковый слой, строма почки и микроциркуляторное русло без изменений. Ткани надпочечников имеют обычное строение.

   В тимусе у крыс, получавших препарат в дозе 0,5 мкг/кг, дольки, разделенные тонкими прослойками рыхлой соединительной ткани, представлены скоплениями однородных клеток округлой формы с четким ядром и узким ободком цитоплазмы. В отдельных случаях отмечается атрофия клеток, увеличение объема прослоек соединительной ткани. Микроциркуляторное русло без видимых изменений. Отмечается умеренное увеличение размеров коркового слоя тимуса за счет гиперплазии лимфоцитов. У крыс с дозой 50 мкг/кг в препаратах тимуса определяются округлые солидные образования, состоящие из мономорфных клеток округлой формы, с гиперхромным ядром и очень узким ободком цитоплазмы. Солидные образования разделены тонкими прослойками соединительной ткани. Отмечается незначительное увеличение незрелых лимфоцитов в центре солидных скоплений.

   В селезенке отмечается усиление кровоснабжения. На срезах заметно увеличивается площадь паренхимы органа, занимаемого белой пульпой, увеличивается число лимфоидных фолликулов, в некоторых наблюдается появление реактивных центров и усиление плотности лимфоцитов на периферии фолликула. Отмечается рост небольших скоплений лимфоидных клеток. Капсула органа без особенностей.

   Лимфоузлы у крыс с дозой 0,5 и 5 мкг/кг практически без изменений. Усиление базофилии коркового и мозгового вещества у крыс с дозой 50 мкг/кг, у этих же крыс в зоне коркового вещества (В-зона) отмечается усилен ние плотности расположения лимфоцитов, появление отчетливо выраженных лимфоидных фолликулов со слабо выраженными реактивными центрами и повышенной плотностью лимфоидных элементов в маргинальном зоне. Состав паренхимы - без отклонений от нормы.

   Гонады (самцы) и яичники (самки) имеют обычное строение.

   Общая гистологическая характеристика стенки желудка практически не отличается от таковой контрольных животных.

   В тонком кишечнике регистрируется усиление окраски ядер эпите- лиоцитов. В собственной пластинке слизистой, а также вокруг концевых отделов, крыс с дозой препарата 50 мкг/кг отмечается повышенное содержание клеток лимфоцитарного ряда. Сосуды подслизистой и мышечной оболочки без изменений.

   В толстом кишечнике целостность эпителиального пласта не нарушена, объем слизистых клеток эпителия несколько увеличен.

   Микроскопическое исследование органов собак. В препаратах миокарда, легких, почек, надпочечников, желудочно-кишечного тракта, семенников - отмечается нормальная гистологическая картина.

   В печени - полнокровие микроциркуляторного русла и зернистая дистрофия гепатоцитов, вследствие чего они увеличены в размерах.

   В селезенке имеется атрофия лимфоидных фолликулов, в отдельных местах - гиперплазия. Синусы расширены, заполнены кровью.

   В ткани яичников - атрофия премордиальных фолликулов, разрастание соединительной ткани, а лимфоузлов - гиперплазия лимфоидных фолликулов за счет увеличения центральных отделов. Отмечается выраженная плазматизация и макрофагальная реакция. '

   Таким образом, проведенные исследования по изучению хронической токсичности нового препарата (тимогексина) позволяют сделать следующие выводы.

   ' Имунофан, при ежедневном, одноразовом, подкожном введении крысам и собакам в течение одного месяца в терапевтической дозе (0,5 мкг/кг), не оказывал влияние на поведение животных, состояние шерстного покрова, частоту сердечных сокращений и способствовал отчетливому (статистически значимому) увеличению массы тела крыс.

   В субтоксической (50 мкг/кг) и промежуточной между терапевтической и субтоксической (5 мкг/кг) дозах иммунофан несколько снижал двигательную активность (отчетливо у крыс) и увеличивал эмоциональный фон подопытных крыс. На прирост массы тела он в указанных дозах оказывал незначительное действие. Так, масса тела крыс, получавших его в дозах 5 мкг/кг, практически соответствовала контрольной группе животных, а у группы подопытных крыс, получавших тимогексин в дозе 50 мкг/кг, прирост массы тела был отрицателен.

   Гематологическими исследованиями было выявлено у всех подопытных животных снижение содержания эритроцитов. Количество лейкоцитов и процентное соотношение их видов изменялось под действием тимогексина, неоднозначно и зависело как от дозы препарата, так и от вида и пола животных, выявленные колебания не носили патологического характера, т.к. после отмены тимогексина практически возвращались до исходного уровня.

   Биохимическими исследованиями сыворотки крови крыс и собак выявлено некоторое уменьшение (зависящее от дозы тимогексина) содержания глюкозы. Остальные показатели (белок, трансаминазы и креатинин) изменялись неоднозначно и были в пределах физиологических констант. После отмены препарата у всех подопытных животных отмечалось выравнивание практически получаемых показателей плазмы крови. Исследование отдельных фракций белков плазмы крови мышей методом электрофореза позволило выявить недостоверное и обратимое повышецие содержания альбуминов.

   Исследование функций печени и почек крысы не выявило значимых патологических изменений у опытных животных. Однако, при проведении пробы «гексеналовый сон» было обнаружено удлинение латентного периода и укорочение гексеналового сна у крыс, получавших препарат в дозе 0,5 мкг/кг, восстанавливающееся после его отмены.

   Морфологическими исследованиями внутренних органов подопытных крыс и собак не выявлено патологических изменений в сердце, легких, желудке, тонкой и толстой кишках, яичниках, семенниках, надпочечниках. Отмечалось повышение полнокровия сосудов микроциркуляторного русла ряда органов (сердца, легких, желудка, печени, селезенки) у опытных животных, получавших иммунофан в дозах 5 и 50 мкг/кг. В препаратах печени забитых животных патологических изменений также не обнаружено.

   Вместе с тем у опытных крыс и собак наблюдалось повышение количества клеток лимфоцитарного ряда в паренхиме тимуса, селезенки и лимфатических узлов, слизистой толстой кишки, появление реактивных центров в В-зоне лимфоидных фолликулов селезенки и лимфатических узлов, что указывает на определенное стимулирующее влияние препарата на лим- фоидную ткань.

   В другой серии опытов оценку общетоксических свойств имунофана проводили на белых беспородных крысах-самцах.

   При ректальном введении препарата в дозах: 12 мкг/кг (свечи массой 25 мг, содержащие 2 мкг имунофана) и 60 мкг/кг (свечи массой 125 мг, содержащие 10 мкг имунофана), что превышает терапевтическую дозу для человека соответственно в 10 и 50 раз. Контрольным животным вводили свечи- плацебо массой 125 мг.

   Ежедневные наблюдения за контрольными и подопытными животными показали, что крысы хорошо перенесли введение свечей, гибели не наблюдалось. Внешний вид животных был опрятным: шерсть гладкая, блестящая, выпадения шерсти не отмечалось. Динамика массы тела имела положительную тенденцию. При этом нарастание массы тела подопытных и контрольных крыс не различалось. Каких-либо изменений слизистых выявить не удалось, глаза не воспалены, уши и конечности без особенностей.

   Функциональных изменений на протяжении.эксперимента при визуальном наблюдении также не обнаружено, мочеиспускание не затруднено, экскрет оформлен.

   Гематологические исследования не выявили различий по показателям периферической крови между крысами, получавшими ректально свечи с имунофаном по сравнению с контрольными животными.

   Биохимическими исследованиями установлено, что все показатели у подопытных животных, получавших свечи с имунофаном, достоверно не различаются между собой и не отличаются от контрольных животных.

   Таким образом, свечи с имунофаном не вызывают существенных изменений в структуре внутренних органов животных. Отмечается лишь очаговая лимфогистиоцитарная инфильтрация в печени и гиперплазия лимфоид- ных фолликулов в толстом кишечнике, что по всей вероятности отражает фармакологическое действие препарата.

   При введении свечей с имунофаном в дозах 12 мкг/кг и 60 мкг/кг в течение месяца местно-раздражающего действия не обнаружено. При макро
   скопическом исследовании каких-либо явлений воспаления в области анального отверстия не выявлено.

   При гистологическом исследовании только в одном случае при введении свечей, содержащих 10 мкг имунофана (60 мкг/кг), отмечается очаговая лимфогистиоцитарная инфильтрация в печени и гиперплазия лимфоидных фолликулов в толстом кишечнике, что по всей вероятности отражает фармакологическое действие препарата.

   Проведенные исследованйя показали, что животные хорошо переносят ректальное введение свечей с имунофаном.

   Влияние имунофана на прирост массы белых крыс

   При хроническом (в течение 30 дней) введении свечей в дозах 12 мкг/кг и 60 мкг/кг, превышающих суточную дозу для человека, примерно в 10 и 50 раз, соответственно, не выявлено существенных изменений в гематологических, биохимических показателях крови, в структуре внутренних органов и местно-раздражающего действия. .. , - На основании полученных результатов свечи с имунофаном можно рекомендовать для применения в медицинской практике.

   Таблица 24.

   Влияние имунофана на биохимические показатели крови крыс

   Влияние имунофана на показатели крови белых крыс

   Таблица 26.

   Влияние имунофана на массу внутренних органов крыс

   . 4.23. Изучение сенсибилизирующих свойств

   Изучение сенсибилизирующих свойств препарата для коррекции им-

   мунодефицитных состояний - иммунофана, проведено на 160 морских «

   свинках, 22 белых лабораторных мышах и 9 кроликах.

   Для изучения сенсибилизирующих свойств препарата, содержащего в качестве действующего вещества синтетический гексапептид иммунофан, использовали следующие модели анафилаксии: реакция общей анафилаксии (анафилактический шок); активная кожная анафилаксия; реакция гиперчувствительности «замедленного» типа на мышах; реакция гиперчувствительности «замедленного» типа на морских свинках; реакция иммунных комплексов; конъюнктивальная проба на морских свинках, кроликах.

   Иммунофан вводили по схемам, соответствующим формированием изучаемых аллергических реакций и предложенных Минздравом России, Департаментом по внедрению новых лекарственных средств и медицинской техники, Фармакологическим комитетом в «Методических рекомендациях по оценкам аллергенных свойств фармакологических средств» (М., 1988 г.) в следующих дозах:

   -терапевтическая доза, равная 0,5 мкг/кг веса животного; -доза, в 10 раз превышающая терапевтическую (5 мкг/кг); -доза, в 100 раз превышающая терапевтическую (50 мкг/кг).

   Контрольной группе животных во всех сериях опытов вводили 0,9% физиологический раствор.

   Результаты экспериментов обрабатывали методом вариационной статистики по 1-критерию Стьюдента.

   Изучение анафилактогенной активности иммунофана проводили в реакции общей анафилаксии (анафилактический шок). Исследования прове-' дены на 24 морских свинках обоего пола, сформированных в 4 группы:

   7. гр. - контрольная, которым вводили физиологический раствор 0,1 мл на 100 г веса животного по схеме (п=6);

   8. гр. - вводили иммунофан в дозе 0,5 мкг/кг в объеме 0,1 мл на 100 г. веса животного по схеме (п=6);

   9. гр. - вводили иммунофан в дозе 5 мкг/кг в объеме 0,1 мл на 100г. веса животного по схеме (п=7);

   10. гр. - вводили иммунофан в дозе 50 мкг/кг в объеме 0,1 мл на 100 г. веса животного по схеме (п=5).

   Схема сенсибилизации: первая инъекция подкожно, две последующие внутримышечно через день в область бедра. Разрешающую инъекцию иммунофана вводили внутрисердечно на 15 день после сенсибилизирующих инъекций 2-й, 3-й, 4-й группам животных в дозах равных суммарной сенсибилизирующей дозе- 1,5, 15 и 150 мкг/кг соответственно.

   Разрешающую инъекцию вводили внутрисердечно и контрольной группе животных - стерильный физиологический раствор в объеме 0,1 мл на 100 г. веса животного. Учет интенсивности анафилактического шока проводили в индексах по Weigle W.O [Weigle W.O., Cochrane D., Dixon Р.У, J.Jmmunol, 1960. v.95. p.5].

   Изучение анафилактогенной активности имунофана изучали в реакции активной кожной анафилаксии. Исследования проведены на 41 морской свинке массой 160-410 г., обоего пола, сформированных в 4 группы:

   8. гр. - контрольная, вводили стерильный физиологический раствор в объеме 0,1 мл на 100 г. веса животного по схеме (п=9);

   9. гр. - вводили иммунофан в дозе 0,5 мкг/кг в объеме 0,1 мл на 100 г. веса животного по схеме (п=12);

   '3 гр. - вводили иммунофан в дбзе 5 мкг/кг в объеме 0,1 мл на 100 г. веса животного по схеме (п=10);

   4 гр. - вводили иммунофан в дозе 50 мкг/кг в объеме 0,1 мл на 100 г. веса животного по схеме (п= 10).

   При изучении активной кожной ' анафилаксии проводили сенсибилизацию ту же, что и при изучении общей анафилактической реакции. На 20-й день опыта на выстриженных участках спины морским свинкам вводили внутрикожно препарат в двухкратных разведениях в объеме 0,01 мл на 100 г. веса животного. Контрольной группе животных вводили внутрикожно стерильный физиологический раствор в аналогичном объеме. Затем морским свинкам внутривенно вводили по 0,5 мл 1% раствора Синего Эванса. Через 30 мин животных убивали эфиром и определяли размеры синего пятна на внутренней стороне кожи в месте введения препарата. Для контроля реактивности кожи тому же животному на другой выстриженный участок внутрикожно вводили стерильный физиологический раствор в объеме 0_f 01 мл на 100 г. веса морской свинки.

   Влияние иммунофана на реакцию гиперчувствительности «замедленного» типа проведено на 22 белых лабораторных беспородных мышах массой 16,2-30.4 г. Подопытные животные были разделены на 2 группы:

   1 гр. - контрольная, которым вводили эмульсию полного адъю- ванта Фрейнда (ПАФ) с раствором Хенкса в соотношении 1:1 (п=12);

   2 гр. - экспериментальная, которым вводили эмульсию иммунофа- на дозой эквивалентной 10 мМ раствору в ПАФ в соотношении 1:1(п=10). Иммунофан растворяли в растворе Хенкса, рН 7,5.

   Мышей сенсибилизировали однократно, внутрикожно, в основание живота эмульсией в объеме 0,06 мл. Для выявления сенсибилизации, через 5 суток мышам в подушечку задней лапы вводили 0,04 мл эмульсии. Величину отека измеряли, с помрщью инженерного микрометра МК - 0-25 через 6 ч., 22 ч., 48 ч., 72 ч. после тестирования.

   Влияние иммунофана на реакцию гиперчувствительности «замедленного» типа проведено на-30 морских свинках массой 180-360 г. Подопытные животные были разделены на 3 группы по 10 в каждой:

   14. гр. - контрольная, вводили полный адъювант Фрейнда (ПАФ) в объеме 0,5 мл;

   15. гр. - вводили иммунофан 0,01% раствор в смеси с ПАФ, в соотношении 1:1 в объеме 0,5 мл;

   16. гр. - вводили иммунофан 0,1% раствор в смеси с ПАФ в соотношении 1:1 в объеме 0,5 мл.

   Похожие диссертации на Фармакология и применение имунофана в животноводстве

   

   Фармакология и применение соединений кремния в животноводствеМатюшевский Леонид Артемович

   

   Фармакология и применение каротиноидов в ветеринарии и животноводствеКузьминова Елена Васильевна

   

   Фармакодинамика селенорганических препаратов и их применение в животноводствеРодионова Тамара Николаевна

   

   Фармако-токсикологическое обоснование применения каролина в животноводстве и ветеринарииКузьминова Елена Васильевна

   

   Фармако-токсикологическое обоснование применения янтарной кислоты в животноводстве и ветеринарииБасанкин Алексей Вадимович

   

   Фармако-токсикологическая оценка и эффективность применения цеолитсодержащих пород Тербунского месторождения в животноводствеЛедовская Татьяна Павловна

   

   Фармако-токсикология и эффективность применения минеральной воды Ильменского месторождения в животноводствеГончаров Александр Александрович

   

   Фармако-токсикологическое обоснование применения натрия гипохлорита в ветеринарии и животноводствеЖолобова Инна Сергеевна

   

   Применение раствора натрия гипохлорита в ветеринарии и животноводствеЗафириди Александр Григорьевич

   

   Фармакология и применение лозеваля в птицеводствеТаймасуков Адам Азметович