Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 14
1.1 Микрофлора, выделяемая из спермы производителей сельскохозяйст венных животных 14
1.2. Влияние микрофлоры спермы на биологическое качество и оплодотворяющую способность спермиев 21
1.3. Влияние микрофлоры спермы на возникновение гинекологических болезней у самок сельскохозяйственных животных 32
1.4. Применение санирующих препаратов для деконтаминации спермы от микроорганизмов 48
2. Собственные исследования 51
2.1. Материалы и методы исследований 51
2.2 .Результаты исследований 61
2.2.1. Определение уровня инфицирования спермы хряков и производите лей различными микроорганизмами 61
2.2.2. Сравнительная оценка антибактериальных препаратов, применяемых для санации спермы производителей сельскохозяйственных жи вотных 68
2.2.2.1. Определение бактерицидного действия препаратов 68
2.2.2.2. Определение максимально безвредной дозы препаратов 70
2.2.2.3. Разработка нового антибактериального препарата для санации спермы хряков и быков-производителей 78
2.2..3.1. Определение безвредности для спермиев хряков-производителей энрофлона и гентамицина 78
2.2.3.2. Изучение бактерицидного действия энрофлона и гентамицина на штаммы микроорганизмов, выделяемых из спермы 81
2.2.3.3. Изучение синергидного бактерицидного действия энрофлоксаци-на и гентамицина сульфата на штаммах и изолятах микроорганизмов 85
2.2.3..4. Определение максимально безвредной дозы для спермиев хряков и быков и минимально бактерицидной дозы препарата ЭНРОГЕН 86
2.2,3.5.Эффективность применения нового комплексного антимикробного препарата ЭНРОГЕН для санации спермы хряков - производителей 90
2.2.3.6. Влияние препарата ЭНРОГЕН на оплодотворяющую способность спермиев хряков -производителей 93
3. Обсуждение полученных результатов 96
4.Выводы 105
5. Практическое использование научных результатов 107
6. Рекомендации по использованию научных выводов 108
7. Список литературы 109
8. Приложения
- Влияние микрофлоры спермы на биологическое качество и оплодотворяющую способность спермиев
- Применение санирующих препаратов для деконтаминации спермы от микроорганизмов
- Определение уровня инфицирования спермы хряков и производите лей различными микроорганизмами
- Изучение бактерицидного действия энрофлона и гентамицина на штаммы микроорганизмов, выделяемых из спермы
Введение к работе
Актуальность темы. Для обеспечения потребности населения в мясе и мясных продуктах важная роль отводится свиноводству, как отрасли наиболее скороспелого животноводства (Шахов А.Г., 2001; Мисайлов В.Д., 2003; Макарова Ю.В., 2007).
В Российской Федерации разведение свиней является традиционной отраслью сельскохозяйственного производства. Этому способствуют благоприятные почвенно-климатические условия для выращивания фуражного зерна, картофеля, тыквы, сахарной свеклы, а также высокая плодовитость свиней, их скороспелость, хорошая оплата корма продукцией и высокий убойный (Авдеенко B.C., 2000).
Однако наибольший эффект в свиноводстве достигается путем его интенсификации с максимальным использованием маточного поголовья (Шумский Н.И., 2002). Репродуктивные возможности свиней во многом зависят от качества хряков-производителей, используемых в технологии искусственного осеменения (Филатов А.В., 2005).
Широкое распространение применения антимикробных средств вызвало появление высокоустойчивых штаммов микроорганизмов, значительно снижающих качественные показатели спермы, что приводит к снижению оплодо-творяемости, абортам и бесплодию самок, рождению гипотрофного и мертворожденного потомства (Щербаченко Д. Ю. ,2006).
В настоящее время сложилась ситуация, когда резкое ухудшение кормления и условий содержания животных при их индустриальном разведении, явилось следствием многолетнего подрыва экономической базы отечественного животноводства, что привело к резкому возрастанию потерь продукции, почти катастрофическому проценту ослабленных животных, особенно молодняка. Большое значение придается получению здорового потомства, что будет обес-
печивать хорошее состояние их здоровья на протяжении последующей жизни и сохранение продуктивности, соответствующей их генетическому потенциалу. Однако в результате сложившихся условий содержания, кормления и эксплуатации это не во всех случаях достигается, что обусловлено возникновением у них патологических состояний, обусловленных присутствием большого числа микроорганизмов, в том числе условно - патогенных, как в сперме производителей так и в половых путях самок. Диагностические мероприятия при этих патологических процессах крайне затруднены, т.к. практически невозможно установить - какой из большого набора микробов вызвал нарушения воспроизводительной функции маток, рождение слабого или мертворожденного приплода. В этом случае необходимо применение комплексных профилактических обработок животных, улучшение их содержания и кормления проведения внеплановой дезинфекции и др.
В новых экономических условиях особую важность приобретает деятельность ветеринарного врача, направленная на предупреждение и ликвидацию различных заболеваний, снижая таким образом, экономический ущерб, причиняемый падежом, либо, выбраковкой животных, а также не дополучением качественной продукции животноводства.
Перед ветеринарными специалистами страны стоит сложная и ответственная задача повышения конкурентно способности отечественной продукции, увеличения ее поставок на внутренний рынок и экспорт. Нельзя ожидать серьезных успехов (высокие привесы, надои молока) без надежной кормовой базы и научно - поставленной племенной работы. Особая роль в выполнении задач (по улучшению процесса воспроизводства с.-х. животных, увеличение приплода), стоящих перед животноводами отводятся массовому применению искусственного осеменения. Искусственное осеменение позволяет за счет максимального использования производителей - улучшателей быстро и массово заменять малопродуктивных особей в стаде на более ценных, с высоким потенциалом продуктивности. Так, например, спермой одного хряка можно осеменить искусст-
венным методом за год более 700 - 1000 свиноматок и получить от них более 7 - 8 тысяч поросят (П.И.Корнеев с соавт.,1985).
Кроме того, в последние годы методы - хранения, замораживания, транспортировка спермы производителей получило в искусственном осеменении широкое применение в практике, как у нас в России, так и за рубежом. Метод -замораживания спермы производителей дает возможность транспортировать сперму в любую точку страны и осуществлять международный обмен
Успех искусственного осеменения во многом зависит от санитарного качества спермы с/х производителей, от сред и химических веществ, применяемых при ее разбавлении, т.к. использование инфицированной спермы может быть опасным источником распространения инфекционных болезней, ведущих к бесплодию, яловости, болезням половых органов, что в свою очередь приводит к недополучению приплода, снижению продуктивности, наносящей большой экономический ущерб сельскому хозяйству РФ (Филатов А.В., 2005).
Сперма, полученная от производителей животных и используемая при искусственном осеменении маточного поголовья, должна отвечать определенным санитарным требованиям, предусмотренными нормативными документами, а препараты, используемые для разбавления и хранения спермы должны быть безвредными, для спермиев производителей сельскохозяйственных животных.
Изучение этого вопроса шло в разных направлениях : определение степени обсемененности и видовой принадлежности выделенных микробов при контаминации ими спермы, влияния микробов на выживаемость и оплодотворяющую способность спермиев, оплодотворяемость самок, частоту заболевания полового аппарата маточного поголовья, осемененного спермой с различной степенью контаминации микробами, влияние микробов на течение беременности, рост и развитие зародышей, плодов новорожденных.
Исследования по микробной обсемененности спермы в нашей стране проводились В.К. Миловановым и И.И.Соколовской (1950), И.В.Смирновым
(1967), АЛ. Мтуденцовым (1948-1967) Д. Д. Логвиновым (1976); Г.В.Зверевой(1978), Н.Н. Михайловым (1978); Н. И. Полянцевым (1983), Н.И. Родиным (1980-1986), В.П. Гончаровым, З.И. Гришиной (1960-2005).
Проведенные исследования показали, что в сперме животных присутствует более 400 видов сапрофитных, условнопатогенных микроорганизмов и более 50 видов патогенных и токсичных грибов, а количество микробов и их видовой состав возрастает в процессе обработки и хранения спермы. При этом наиболее чаще из спермы, например хряков, выделяли различные виды стрептококков, стафилококков, микрококков, кишечной, синегнойной, сенной палочек и протея.
Наличие в сперме различных микроорганизмов приводит к понижению выживаемости и оплодотворяющей способности спермиев и, как следствие, к по-лучанию нежизнеспособного потомства. Поэтому подавление нежелательного действия микробов-контаминантов в сперме производителей является обязательным условием при искусственном осеменении маточного поголовья.
Во всех странах мира с развитым животноводством, в основе которого лежит искусственное осеменение, для предотвращения микробной контаминации спермы производителей используют санирующие препараты, включающие различный набор антибиотиков широкого спектра действия.
Следует указать, что эффективность санирующего действия любого антимикробного препарата зависит, как от видового состава, так и от количества микроорганизмов, а также от состава спермы (с содержанием желтка, глицерина, хелатона и др.) времени экспозиции разбавленной спермы при различных температурах и т.д.
Основными требованиями к санирующим веществам (антибиотики, сульфаниламидные и химиотерапевтические препараты) являются их высокая бактерицидная активность в подавлении роста микроорганизмов, в какой - то сте-
пени затормаживание обменных процессов спермиев и тем, самым, повышение их выживаемости.
Сложность в решении проблемы санации спермы состоит еще и в том, что наряду с созданием в средах бактерицидных условий, должна сохраняться оплодотворяющая способность спермиев. Кроме того, в связи с возрастающим количеством антибиотикоустойчивых рас микроорганизмов, резистентных ко многим санирующим веществам, с каждым годом усложняется выбор методов лечения животных - бактерионосителей и санации спермы.
В нашей стране на основании многочисленных исследований проведенных сотрудниками лаборатории ВГНКИ ветпрепаратов, на Красноярском заводе медпрепаратов специально для санации спермы производителей в 1967 -1969 гг. был разработан и организован выпуск комплексного препарата сперма-сан - 3 с достаточно большим спектром антимикробного действия, в состав которого входили проверенные на безвредность для спермиев пенициллин, стрептомицин и белый растворимый стрептоцид. Данный препарат широко применялся на станциях искусственного осеменения для санации спермы животных в течение более 25 лет. Однако, как было выяснено, спермасан - 3 не оказывал бактерицидного или бактериостатического действия на микоплазмы, трихома-нады, синегнойную палочку, протей, которые могут контаминировать получаемую сперму. Основным недостатком, применявшегося в нашей стране препарата спермосан - 3, является сравнительная высокая его токсичность для спермиев хряков и недостаточная бактерицидность по отношению к ряду условно-патогенных микроорганизмов хинегнойной палочке, протею, стрептококкам и др. Более эффективный препарат спермосан - ППК в России не выпускается из-за отсуствия полимиксина - М. Для снижения микробной контаминации спермы производителей был предложен препарат ГАМГТ на основе гентамицина и ампициллина, который обладает более выраженной бактерицидной активностью по отношению к микроорганизмам по сравнению с вышеуказанным пре-
паратами, но вызывает плазмокоагуляцию спермы у отдельных быков, что делает ее непригодной для криоконсервации.
В последние годы для санации спермы производителей сельскохозяйственных животных эффективно применяется комплексный препарат Полиген (полимексин Е или М +гентамицин).
Однако учитывая недостаточную высокую бактерицидность спермосана - З в отношении ряда микроорганизмов, весьма актуальной является разработка новых комплексных антимикробных препаратов из доступных компонентов и обладающих широким спектром антимикробного действия на микрофлору, присутствующую в сперме.
В связи с этим наше внимание было обращено на ряд новых антимикробных средств. Так, в настоящее время в медицинской и ветеринарной практике находят все более широкое применение антимикробные препараты, относящиеся к группе фторхинолонов.
Положительная особенность фторхинолонов проявляется в их эффективности при бактериальных и некоторых других инфекциях, вызванных микроорганизмами, устойчивыми к антимикробным препаратам других фармакологических групп. Фторхинолоны обладают высокой активностью в отношении большинства грамотрицательных бактерий, сальмонелл, эшрихий, коли, протея, стафилококков, стрептококков, синегнойной палочки, что является особенно важным с учетом контаминации спермы такими микроорганизмами. На основе фторхинолона разработан препарат энрофлоксацин для лечения послеродового эндометрита крупного рагатого скота, вызванного патогенной и условно - патогенной микрофлорой.
Другим высокоэффективным средством в отношении штаммов стафилококков, устойчивых к пенициллинам и другим антибиотикам; некоторым штаммам стрептококков, синегнойной палочки, энтеробактерий, сальмонелл, протея является гентамицин сульфат - антибиотик широкого спектра действия из группы аминоглюкозидов.
Цель и задачи исследования. Целью исследований являлась разработка нового комплексного антимикробного препарата, малотоксичого для спермиев производителей и обладающего широким спектром действия на микрофлору, выделяемую из спермы сельскохозяйственных животных.
Для реализации данной цели были поставлены следующие задачи:
Изучить уровень инфицирования спермы хряков-производителей различными видами микроорганизмов.
Провести сравнительную оценку антибактериальных препаратов, применяемых для санации спермы производителей сельскохозяйственных животных по ряду показателей (бактерицидная активность, выживаемость и оплодотворяющая способность спермиев).
Определить бактерицидное действие энрофлоксацина и гентамицина сульфата на микроорганизмы, выделяемые из спермы.
Определить синергидное бактерицидное действие энрофлоксацина и гентамицина сульфата на штаммах и изолятах микроорганизмов.
Установить максимально безвредную дозу для спермиев хряков и минимально бактерицидную дозу препарата ЭНРОГЕН.
Определить эффективность применения препарата ЭНРОГЕН для санации спермы хряков - производителей.
Изучить влияние препарата ЭНРОГЕН на оплодотворяющую способность спермиев хряков-производителей.
Разработать НТД на препарат ЭНРОГЕН и определить его экономическую эффективность при искусственном осеменении свиней.
Научная новизна. Впервые для санации спермы хряков и быков-производителей был создан комплексный препарат ЭНРОГЕН на основе гентамицина сульфата и энрофлоксацина из группы фторхинолонов, разработана технология его получения, изучены фармакологические свойства. Установлены его безопасность для спермиев и более высокая бактерицидная активность в отношении условно - патогенной микрофлоры (синегнойной и кишечной пало-
чек, стрептококков, стафилококков, протея и других бактерий) по сравнению с применяемым в настоящее время санирующим препаратом ПОЛИГЕН.
На основании результатов исследований разработана нормативно-техническая документация на препарат ЭНРОГЕН (Технические условия, инструкция по применению).
На базеЗАО «Мосагроген» г.Москва организовано производство препарата ЭНРОГЕН. Полученные серии по качеству соответствовали нормативным документам и прошли производственные испытания.
Практическая значимость заключается в том, что предложенный ком
плексный санирующий препарат ЭНРОГЕН позволяет получать сперму высо
кого санитарного и биологического качества, способствует снижению гинеко
логических заболеваний у свиноматок, а также повышению оплодотворяемости
маточного поголовья при искусственном осеменении. Полученные данные под
тверждены актами, утвержденными руководителями опытно-
производственных хозяйств и свинокомплексов Московской, Белгородской и
Воронежской областей.
На основании результатов исследований разработана нормативно-техническая документация на препарат ЭНРОГЕН (Технические условия, инструкция по применению).
На базеЗАО «Мосагроген» г.Москва организовано производство препарата ЭНРОГЕН. Полученные серии по качеству соответствовали нормативным документам и прошли производственные испытания.
Материалы исследований вошли в «Методические указания по диагностике, терапии и профилактике болезней органов размножения и молочной железы свиней», одобренные секцией патологии, фармакологии и терапии Российской сельскохозяйственной академии 24 марта 2005 г. (протокол № 1).
Материалы исследований используются в учебном процессе в Саратовском государственном аграрном университете им. Н.И. Вавилова, Воронежском государственном аграрном университете им. К.Д. Глинки, Московской государ-
ственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина студентами ветеринарных факультетов при изучении дисциплины «Ветеринарное акушерство, гинекология и биотехника размножения животных», а также на курсах повышения квалификации зооветеринарных специалистов свиноводческих хозяйств.
Материалы исследований вошли в «Методические указания по диагностике, терапии и профилактике болезней органов размножения и молочной железы свиней», одобренные секцией патологии, фармакологии и терапии Российской сельскохозяйственной академии 24 марта 2005 г., протокол № 1.
Апробация результатов диссертации. Материалы диссертационной работы доложены, обсуждены и одобрены на ежегодных научно-практических конференциях научных сотрудников и аспирантов ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ ВГНКИ, 2003-2006); на международных научно-производственных конференциях по проблемам лечения и профилактики аку-шерско-гинекологической патологии с.-х. животных (Ульяновск, 2007; Ставрополь, 2007); на XV Московском международном ветеринарном конгрессе (2007).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, в т.ч. 4 статьи - в материалах Всероссийских, региональных и республиканских научных конференций и 2 статьи - в научных журналах.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований, обсуждений полученных результатов, выводов, данных о практических использованиях научных результатов, рекомендаций по использованию научных выводов, списка использованной литературы (118 источников, в т.ч. 15 иностранных авторов) и 1 приложения. Работа иллюстрирована 17 таблицами и 7 рисунками.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Уровень инфицирования спермы хряков-производителей различными ви
дами микроорганизмов.
Сравнительные испытания различных антибактериальных препаратов, применяемых для санации спермы животных по ряду показателей (бактерицидная активность, выживаемость и оплодотворяющая способность спермиев).
Технология получения нового санирующего препарата ЭНРОГЕН и его фармако-токсикологические свойства;
Эффективность ЭНРОГЕНа при искусственном осеменении свиней.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Влияние микрофлоры спермы на биологическое качество и оплодотворяющую способность спермиев
По многочисленным литературным данным известно, что микроорганизмы, попавшие в сперму, оказывают негативное влияние на биологическое качество спермы, что сказывается неблагоприятно на воспроизводстве животных.
Микроорганизмы, попадая в сперму, находят там благоприятные условия для роста и размножения, а продукты их жизнедеятельности снижают ее качество, вызывают различные изменения в структуре спермиев, а попадая при осеменении в половые органы самок отрицательно влияют на оплодотворение и даже на развитие плода.
По данным электронно-микроскопических исследований спермиев выявлен факт адгезии микроорганизмов на поверхности спермиев. На месте их прикрепления оболочка спермиев вдавливается, прогибается, а в последующем набухает и распадается, что обусловлено воздействием ферментов микробов, а продукты их обмена приводят к гибели клеток.
А.Д. Бугров и П.Н. Скляров (2004) считают, что одним из важнейших условий при манипуляциях со спермой на всех технологических этапах работы с ней является асептичность, так как результаты многочисленных исследований указывают на определенную связь между бактериальной загрязненностью спермы и оплодотворяющей способностью животных.
В связи с этим, важным условием сохранения спермиями высокой оплодотворяющей способности является сохранение спермой минимальной степени микробного загрязнения, что регламентируется соответствующими санитарно-гигиеническими требованиями стандарта.
Далее авторы отмечают, что применение специальных мер при получении спермы, ее технологической обработке и введением в половой аппарат самок хотя и позволили в значительной степени снизить степень микробной загрязненности, но получения во всех случаях асептической спермы не обеспечивают.
Длительное изучение данного вопроса и использование различных антибактериальных препаратов и их комплексов до настоящего времени так и не позволили эффективно решить проблему. Так, большинство из применяемых препаратов либо имеют узкий спектр антимикробного действия, либо токсичны для спермиев.
И.О. Пантюхова [75] объясняет неблагоприятное влияние микрофлоры на сперму не только действием эндотоксинов, но и механическим прикреплением микробов к спермиям, что мешает нормальному движению последних.
По данным П.А. Волоскова [21], под влиянием бактерий возникают изменения в ДЬЖ ядер спермиев, что обусловливает снижение оплодотворяющих свойств гамет.
И.Ф. Заянчковский (1959) отмечает, что микробы ведут к образованию продуктов разложения веществ спермы (молочной кислоты, аммиака и др.), которые оказывают губительное влияние на спермиев. Г.В. Зверева [34, 35] на основании микробиологических, биохимических и электронно-микроскопических исследований установила механизм влияния микробов на половые клетки самцов, которое заключается в следующих видах воздействия: 1. Механическом, когда микроорганизмы оседают на отдельных час тях спермиев (головке, теле, хвосте) и нарушают активность половых клеток; 2. Химическом, когда выделяемая микробами молочная кислота, СО и другие продукты обмена веществ не только понижают выживаемость спермиев, но и приводят к их гибели. 3. Биологическом, при котором микроорганизмы, осевшие на отдельных участках головки, тела и хвоста спермия, механически переносятся ими в матку и яйцеводы, вызывая развитие острых и хронических воспалительных процессов у маток. Кроме того, микроорганизмы вырабатывают бактериолизины, бакте-риотоксины и бактериоагглютинины, которые могут вызвать агглютинацию и гибель половых клеток. Имеются сообщения, что различные виды условно-патогенных микробов образуют целый ряд токсических соединений, таких как индол, скатол, сероводород, кадаверин и др., которые отрицательно влияют на биологические свойства спермиев (Н.П. Суханов, В.Г. Балев, 1974). Отмечена взаимосвязь увеличения концентрации бактерий с ухудшением физиологических показателей спермы. Так, при внесении в сперму культур Ps. aeruginosa, E. coli, S.aureus в концентрации от 3 до ЗО млн. микробных тел/см отмечалось снижение уровня потребления спермиями кислорода и качества жизнеспособных спермиев на 6,5 - 9,7% по сравнению с контролем (К.Л. Левин, 1966). Н.Г. Балашов [2-Ю] объясняет отрицательное действие некоторых микроорганизмов на спермиев тем, что некоторые штаммы кишечной палочки, протея, сенной палочки, интенсивно расщепляющие глюкозу своими протео-литическими ферментами, расщепляют и белки, являющиеся составной частью спермиев, что приводит к необратимым структурным изменениям в них. А.В. Филатов, И.Г. Конопельцев и С.Я. Долгоаршинных [103] отмечают, что в условиях специализированных свиноводческих комплексов трудно избежать микробной контаминации эякулятов. Известные способы снижения количества микроорганизмов в сперме хряков-производителей предусматривают использование узкого спектра антибактериальных препаратов, в частности антибиотиков и сульфаниламидов. Однако эффективность их при длительном использовании снижается, вследствие появления резистентных штаммов патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, что требует постоянного их обновления. Авторы рекомендуют применение озонированной глюкозо-хелато-цитратно-сульфатной среды для эффективной санации спермы хряков-производителей, что оказывает, по их мнению, положительное влияние на воспроизводительную способность свиноматок.
Применение санирующих препаратов для деконтаминации спермы от микроорганизмов
Освобождение спермы от микроорганизмов (деконтаминация, санация спермы). Соблюдение всех ветеринарно-санитарных правил не гарантирует получения в 100% случаев спермы, свободной от микроорганизмов. Без применения санирующих веществ можно получить сперму без микроорганизмов лишь в 20%, максимум в 70% случаев. Для подавления микрофлоры в сперме применяют специальные санирующие вещества, безвредные для спермиев. Действие любого санирующего вещества зависит не только от видового состава микроорганизмов, но и от их количества.
Для подавления условнопатогенных, некоторых патогенных (вибрионов, бруцелл и др.) и банальных микроорганизмов в среды при разбавлении спермы добавляют спермосан-3. Чтобы усилить действие спермосана-3, особенно при неблагополучии станции по псевдомонозу, в среды дополнительно вводят полимиксин_М сульфат до 10ЕД на 100 мл среды. [2-10]
Создание широкой сети промышленных животноводческих комплексов поставило перед ветеринарной наукой ряд проблем, связанных с совершенствованием средств профилактики и лечения инфекционных и незаразных заболеваний сельскохозяйственных животных. (Мирзахметов Ш.Р., 2006).
Не последнее место в решении этих проблем занимает искусственное осеменение, которое, как было сказано выше, вследствие высокой бактериальной обсемененности спермы в значительной мере влияет на уровень оплодотворения маточного поголовья и получение здорового потомства. (Шипилов B.C., 1977).
Подавление нежелательного действия микробов - контаминантов в сперме производителей является обязательным условием при искусственном осеменении маточного поголовья.
Во всех странах мира с развитым животноводством, в основе которого лежит искусственное осеменение, для предотвращения микробной контаминации спермы производителей используют санирующие препараты, включающие различный набор антибиотиков широкого спектра действия.
Большое значение приобретает использование химиотерапевтических средств, позволяющих значительно снизить ущерб, причиняемый заболеваниями бактериальной этиологии. [26, 27].
Ассортимент химиотерапевтических препаратов постоянно увеличивается, что вызывает затруднения при выборе наиболее подходящего препарата. В связи с вышеуказанном, очевидно, что однозначного ответа на вопрос какой же из этих групп следует отдавать предпочтение, видимо не существует. Это обусловлено еще и тем, что ветврач, выбирая антибиотик, должен учитывать ряд факторов: допустимость, стоимость, терапевтический индекс, чувствительность микробов к нему, скорость формирования устойчивости микробов к данному антибиотику, способность антибиотика проникать через барьеры в органы и системы, степень пролонгированное их действия.
По мнению ряда исследователей, лучше назначать бактерицидные, а не-бактериостатические препараты, т.к. последние блокируют репликацию и деление клеток, не вызывая их гибели, и клетки сохраняют способность к росту и при низкой резистентности организма возможен рецидив заболевания. Препарат с бактерицидным действием вызывает гибель клеток.
Филатов А.В [102, 103] для профилактики микробной контаминации спермы хряков-производителей рекомендует санацию их препуциальной полости озонированным раствором фурацилина в количестве 100 смЗ. Данную процедуру необходимо осуществлять с интервалом 10 суток. При приготовлении озонированного раствора фурацилина исходный раствор фурацилина (1:5000) в количестве 1000 смЗ барботируют озоно-кислородной смесью с концентрацией озона 10 мг/л посредством керамического распылителя в течение 30 минут.
В целях коррекции иммунобиологической резистентности и повышения воспроизводительной способности хряков-производителей необходимо вводить калиевый иммуномодулятор в их рацион в дозе 20 мг/кг живой массы в течение 20 дней ежедневно с последующим 30 суточным перерывом.
Особое внимание необходимо уделять проблеме формирования анти-биотикоустойчивости у тех микроорганизмов, против которых эти антибиотики применяются.
Бороться с этим явлением стали сначала путем химической модификации природных антибиотиков, потом созданием полусинтетических антибиотиков, а затем и полностью синтетических, т.е. к природному ядру которых присоединяли различные концевые заместители.
Затем появились вещества, имеющие природный аналог, а далее и вещества, не имеющих природный аналогов. Из числа последних наиболее перспективными являются фторхинолоны.
Определение уровня инфицирования спермы хряков и производите лей различными микроорганизмами
Большое значение для качества получаемой спермы производителей сельскохозяйственных животных имеет плотность ее микробной контаминации, особенно патогенными микроорганизмами. Все это оказывает существенное влияние на состояние сперматозоидов и, соответственно, на их оплодотворяющую способность. Поэтому для нас представляло большой интерес выяснение данного вопроса. С целью определения степени микробной контаминации спермы нами были проведены микробиологические исследования образцов спермы от 30 хряков-доноров, принадлежащих свинокомплексу «Кузнецовский».
Сперму от хряков исследовали в 3-х кратной повторности, в осенне-зимний (ноябрь-февраль) и летне-весенний (март-июнь) периоды. Всего было исследовано 480 эякулятов.
В исследованных образцах свежеполученной и разбавленной ГХЦС средой (1:3) спермы определяли микробное число в 1 см , коли-титр и наличие условно-патогенной микрофлоры. Для этого пробы спермы разбавляли стерильным 0,9%-ным раствором хлористого натрия (физиологическим раствором) и делали последовательные десятикратные разведения 1:10 до 1:1000 см и выше (в зависимости от предполагаемого загрязнения спермы). Из приготовленных разведений спермы проводили высевы на чашки Петри с 2 % МПА с добавлением 1% глюкозы.
Посевы выдерживали в термостате при температуре 37+0,5С в течение 2-х суток, после чего производили подсчет числа выросших колоний. Результаты исследований отображены в таблице 2.
Как следует из полученных данных, представленных в таблице 1, при сравнительной оценке санитарного качества спермы, полученной от одних и тех же хряков в разное время года, установлено, что в осенне-зимний период свежеполученная неразбавленная сперма хряков имела высокое микробное число и коли-титр.
Так, в целом число микроорганизмов в исследуемых эякулятах от хряков в осенне-зимний период было на уровне 78428 ± 19237, а в весенне-летний - в 1,5 раза выше - 122268 ±31565 КОЕ в 1 см3 неразбавленной спермы. Достаточно высокий коли-титр 0,0001 имели 58,4-60,0% образцов во все периоды исследований, что также указывает на значительный уровень микробной контаминации спермы.
Разбавление спермы ГХЦС средой способствовало существенному снижению в ней количества микроорганизмов. Так, среднее микробное число по 120 исследованным пробам разбавленной спермы в осенне-зимний период со-ставило 26166 ± 7399 и в весенне-летний - 28742 ± 9674 КОЕ/см , причем количество образцов с коли-титром 0,0001 составляло 25,7% и 45,0 % соответственно. По сравнению с результатами исследований образцов свежеполученной спермы снижение микробного числа после ее разбавления ГХЦС средой было в 3,0 (осенне-зимний период) и 4,25 (весенне-летний период) раза, а количество проб с коли-титром 0,0001 - в 2,26 и 1,33 раза соответственно. Однако, несмотря на такое снижение числа микроорганизмов, микробная контаминация спермы оставалась еще достаточно высокой. Аналогичные результаты получены и по уровню контаминации спермы условно-патогенными микроорганизмами и грибами. Так, в ноябре-феврале 50,0% образцов свежеполученной и 40,0% разбавленной спермы были контаминированы условно-патогенными микроорганизмами, а в марте-июне их количество было увеличено уже до 60,8% и 50,0% соответственно.
Различие в микробной обсемененности спермы хряков в зависимости от сезона можно объяснить ухудшением общего санитарного состояния как самих производителей, так и помещений и инструментов, используемых при получении спермы, а также с ослаблением резистентности у хряков - производителей в весенний период.
С целью изыскания способов снижения микробной контаминации спермы в предыдущие годы было предложено замораживать ее в жидком азоте (-196С). Поэтому нам представлялось интересным изучить уровень микробной контаминации замороженно-оттаянной спермы, для чего нами были исследованы образцы спермы от 45 хряков-доноров, принадлежащих ГПЗ «Константинове» Домодедовского района Московской области.
Сперма была расфасована в гранулах по 1,0 см3 и доставлялась в лабораторию ВГНКИ в сосудах с жидким азотом. Сперму размораживали при комнатной температуре, разводили ГХЦС средой (1:3) и исследовали по общепринятым тестам. В сперме аналогично предыдущим опытам определяли микробное число, коли-титр и наличие условно-патогенной микрофлоры. Результаты исследования отражены в таблице 3.
Из таблицы 2 следует, что микробное число в исследованных пробах замороженно-оттаянной спермы составляло в среднем 24100 ± 2971 КОЕ/см , а 66,7% образцов имели коли-титр 0,01. Данные уровни были значительно ниже по сравнению со свежеполученной спермой: микробное число было снижено в 3,25-5,07 раз, тогда как результаты практически не отличались от уровней микробной контаминации, полученных при анализе разбавленной спермы. Однако по коли-титру улучшение качества спермы было особенно заметным. Замороженно-оттаянная сперма имела в 66,7% случаев коли-титр 0,01, тогда как в 25,8-60,0% сравниваемых образцов свежеполученной и разбавленной спермы коли-титр был 0,0001.
Аналогичные результаты получены и по снижению контаминации спермы условно-патогенными микроорганизмами и грибами. Большой интерес представляло изучение видового состава выделенной из спермы микрофлоры, так как от этого во многом зависит подбор компонентов антибиотического пре- парата для ее санации. Идентификацию микроорганизмов проводили в соответствии с методами, изложенными в разделе «Материалы и методы». Результаты проведенных исследований представлены в таблице 3.
Как можно видеть из данных таблицы 4, при анализе образцов как све-жеполученной, так и разбавленной ГХЦС средой спермы чаще всего выделяли бактерии группы кишечной палочки (БГКП) - 100,0% и 100,0%, дрожжеподоб-ные грибы - 75,0% и 61,6% образцов соответственно. В 24,1% образцов свеже-полученной и 15,0% - разбавленной спермы была обнаружена Ps.aeruginosa, в 26,6% и 20,0% - сенная палочка (Bac.subtilis) соответственно. Доля других микроорганизмов (стрептококков, стафилококков, протея) была на уровне от 4,2 до 12,5%. Ни в одном случае не были выделены St.aureus. Немаловажным также являлось выяснение наиболее часто регистрируемого видового состава микроорганизмов, присутствующих в сперме животных в ассоциации. С этой целью нами были проанализированы результаты исследований образцов спермы от хряков. Данный анализ позволил установить, что если БГКП чаще всего встречаются в ассоциации, то Ps.aerugmosa присутствовала в монокультуре у 35,7% образцов эякулятов.
Таким образом, полученные данные показывают, что независимо от сезона года качество спермы по микробиологическим показателям остается достаточно низким, причем основную массу содержащихся в сперме микроорганизмов составляют грамотрицательные бактерии (БГКП, Ps.aeruginosa, протей) и дрожжеподобные грибы. Кроме того, несмотря даже на разбавление спермы и замораживание, качество спермы по микробиологическим показателям остается недостаточно высоким. Все это свидетельствует о важности проведения санации спермы различными антимикробными препаратами не только перед проведением осеменения, но и перед ее замораживанием, что позволит избежать негативного влияния контаминированной спермы на уровень оплодотворения маточного поголовья.
Изучение бактерицидного действия энрофлона и гентамицина на штаммы микроорганизмов, выделяемых из спермы
После установления безопасных концентраций энрофлона и гентамицина следующим этапом исследований являлось определение их минимальной бактерицидной дозы в отношении штаммов культур условно-патогенных микроорганизмов, чаще всего контаминирующих сперму производителей и взятых как по отдельности, так и в ассоциации. В опытах были использованы 2-х суточные агаровые культуры следующих микроорганизмов: Ps.aeruginosa, E.coli, P. vulgaris а и Str. faecalis. Из данных микроорганизмов при помощи оптического стандарта мутности готовили одномиллиардную микробную взвесь, из которой затем путем последовательных разведений в физиологическом растворе получали взвесь, содержащую 50 тыс. микробных клеток в 1 см .
Для приготовления ассоциации микроорганизмов, чаще всего встречающейся в сперме, их смешивали в соотношении 1-1. Вначале для определения бактерицидного действия этих антимикробных средств их вносили в среды, предназначенные для разбавления и хранения спермы, и в физиологический раствор в различных дозах, которые готовили на стерильном физиологическом растворе методом последовательных разведений. После приготовления растворов в них вносили по 1,0 см3 одномиллиардной взвеси культуры микроорганизмов, что обеспечивало микробную нагрузку 200 тыс. микробных клеток в 1 см3 среды. Контролем служили пробы сред с внесением взвеси культур микроорганизмов, но без добавления препаратов.
Опытные и контрольные пробы выдерживали в течение 2 часов при комнатной температуре (20-22С) и делали высевы на питательные бактериологические среды: 2%-ный МПА с 1% глюкозы, МПБ и МПА без глюкозы.
Посевы инкубировали в термостате при температуре 37±0,5С в течение 36 час, а при отсутствии роста микроорганизмов в посевах - до 10 суток. При наличии роста микроорганизмов проводили их идентификацию (окраска мазков по Граму, высев выросших колоний на элективные питательные среды, проведение специфических реакций и т.д.) по общим методическим правилам исследований.
При изучении бактерицидных свойств гентамицина его вносили в среды в концентрации от 12,5 до 600 мкг/ см3. Результаты проведенных исследований представлены в таблице 10. Как видно из данных, представленных в таблице 10, минимальные бактерицидные дозы гентамицина для E.coli находи-лись в пределах 300 мкг/см (бактериостатическая - 200 мкг/см ), Ps.aeraginosa -350 мкг/см (300 мкг/см ), Str. faecalis - 400 мкг/смЗ (350,0 мкг/ см3); на протей и ассоциацию микроорганизмов гентамицин оказывал только бактериостатическое действие в дозах 350-500 мкг/см среды.
Анализ данных, представленных в таблице 12, показывает, что минимальные бактерицидные дозы энрофлона для E.coli находились в пределах 200 мкг/см (бактериостатическая - 100-150 мкг/см ), Ps.aeruginosa -300 мкг/см (150-250 мкг/см ), стрептококка - 250 мкг/см (100-200 мкг/см ); протея - 250 мкг/см (100-200 мкг/см ), а ассоциации микроорганизмов - 300 мкг/см3 (200-250 мкг/см3).
При сравнении бактерицидной активности изучаемых антимикробных соединений видно, что минимально бактерицидная доза энрофлона для E.coli, Ps.aeruginosa, Proteus vulgaris a, Str. faecalis и ассоциации микроорганизмов была значительно выше по сравнению с гентамицином.
Таким образом, проведенные исследования показали, что среды, используемые для разбавления и хранения спермы хряков, не оказывали существенного влияния на бактерицидную активность санирующих препаратов по сравнению с физиологическим раствором.
Учитывая бактерицидные концентрации энрофлона и гентамицина, нами была изучено синергидное действие данных антимикробных средств с целью снижения их суммарной концентрации в препарате и повышения бактерицидного действия в отношении микроорганизмов, контаминирующих сперму хряков и быков. Для этого нами были испытаны бактерицидные и бактериостатические свойства различных соотношений энрофлона и гентамицина для выбора наиболее оптимального. Данные вещества в концентра-циях от 12,5 до 150 мкг/см смешивали в соотношениях 1:1,3:1, 1:3, 1:6. Результаты проведенных исследований приведены в таблице 13. Данные определения оптимального соотношения гентамицина и энрофлоксацина в препарате ЭНРОГЕН, представленные в таблице 12 показали, что оптимальными их соотношениями являются 1:1 и 1:3. Важно также отметить, что подбор оптимальных соотношений антибиотиков в комбинированном препарате целесообразно проводить при низких концентрациях на уровне бактериостатических, т.к. при более высоких концентрациях можно не уловить их сочетанное бактерицидное действие на микрофлору. Так, при соотношении гентамицина и энрофлоксацина в препарате ЭНРОГЕН в общей дозе 12,5 мкг/см среды он уже проявляет бактериостатическое действие на кишечную палочку, а в дозе 25,0 мкг/см3 при том же соотношении гентамицина и энрофлоксацина бактерицидную, что не наблюдается при соотношении гентамицина и энрофлоксацина 3:1 и 1:6 в той же дозе.
После отработки состава комплексного антимикробного препарата для санации спермы хряков были проведены исследования по определению его максимально безвредной дозы для спермиев. Для этого в разбавленные ГХЦС средой сперму хряков вносили различные концентрации разработанного препарата ЭНРОГЕН и изучали абсолютную выживаемость и выживаемость спермиев в часах. Всего было выполнено 4 опыта Результаты проведенных исследований представлены в таблице 14.
