Содержание к диссертации
Введение
Глава 1.Обзор литературы 11
1.1.Возрастные особенности иммунной системы у людей старшего возраста 12-18
1.2 Проблемы хирургической коррекции клапанов сердца
у больных старшего возраста с приобретенными пороками 18-21
1.3. Особенности течения послеоперационного периода у кардиохирургических больных старшего возраста 21-24
1.4.Влияние хирургической травмы на состояние иммунной системы 24-30
1.5. Иммунокоррегирующая терапия у больных при операциях на сердце 30-38
Глава 2. Материал и методы исследования.
2.1. Характеристика больных с ППС старшего возраста, и групп сравнения 38-40
2.2. Иммунологическое обследование больных 40-47
2.3. Статистическая обработка результатов 47
ГЛАВА 3. Состояние иммунной системы у больных старшего возраста с приобретенными пороками сердца в период подготовки к хирургической коррекции клапанов сердца .47-59
ГЛАВА 4. Влияние ИК на формирование иммунной недостаточности у больных старшего возраста при протезирование клапанов сердца 59-65
ГЛАВА 5. Сопряженность развития осложнений в послеоперационном периоде с нарушением основных звеньев иммунной системы у больных с приобретенными пороками сердца 65
5.1.Анализ течения раннего послереанимационного периода у больных старшего возраста с приобретенными пороками сердца 65-70
5.2 Нарушение иммунного реагирования у больных старшего возраста с приобретенными пороками сердца в раннем послеоперационном периоде 70-90
5.3.Анализ течения послереанимационного периода у больных старшего возраста с приобретенными пороками сердца 90-93
5.4. Нарушение иммунного реагирования у больных старшего возраста с приобретенными пороками сердца в послереанимационном периоде 93-99
ГЛАВА 6. Коррекция вторичных иммунодефицитов у больных старшего возраста при протезировании клапанов сердца .
6.1..Эффективность превентивной иммунокоррекции 99-101
6.2. Иммунокоррекция вторичных иммунодефицитных состояний с оценкой индивидуальной чувствительности к иммуномодуляторам 101-113
7.3аключение. Обоснование иммунокоррекции при протезировании клапанов сердца у больных старшего возраста 113-116
8. Выводы 117-118
9.Практические рекомендации 119-120
10.Список литературы 120-134
- Особенности течения послеоперационного периода у кардиохирургических больных старшего возраста
- Иммунологическое обследование больных
- Влияние ИК на формирование иммунной недостаточности у больных старшего возраста при протезирование клапанов сердца
- Нарушение иммунного реагирования у больных старшего возраста с приобретенными пороками сердца в раннем послеоперационном периоде
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ.
Сердечно-сосудистая патология занимает ведущее место среди
заболеваемости и летальности лиц пожилого и старческого возраста, процент которых в последнее время в экономически развитых странах быстро возрастает и в ближайшие годы практически удвоится (Шабалин В.Н., 2001-2003 и др.; Гос. доклад о состоянии здоровья населения РФ 2002; Gavazzi G., Krause К.Н. 2002г; Gatti A. et.al.,2002).
В структуре сердечно-сосудистых заболеваний лиц пожилого возраста основными являются коронарная болезнь сердца, приобретенные пороки со склеротическими и атеросклеротическими изменениями на клапанах сердца.
Совершенствование хирургической техники, анестезиологического и реанимационного пособия, углубление представлений о патологических процессах старение позволило не только увеличить число кардиохирургических операций у пожилых больных, но и расширить возрастные показания к хирургическому лечению.
Как показано отечественными и зарубежными авторами, развивающийся с возрастом дисбаланс иммунной системы, опосредованный инволюцией тимуса, в отличии от многих других систем практически связан со всеми наиболее опасными болезнями старшего возраста.
Поэтому многими исследователями старение рассматривается, как Т-клеточный иммунодефицит, сопровождающийся ослаблением реакций иммунитета и часто изменением их характера. В результате развиваются аутоиммунные, онкологические процессы и хроническое течение заболеваний, что составляет основу полиморбизма в старости (Серова Л. Д. 2002; Ярилин А. А. 2003; Globerson А. 2000).
Вместе с тем иммунная система человека имеет значительный запас прочности, который создается в процессе формирования защитных сил организма с момента рождения (Globerson А. 2000).
6 Накоплены данные о возрастных изменениях иммунного реагирования и патогенетической роли нарушений иммунного статуса в развитии кардиопатологии, в том числе формирований приобретенных пороков сердца и послеоперационных осложнений (Ярилин А.А. 2003; Сускова B.C. 2004, 2006; Ding A., et al. 1994; Geerge A. et al., 1996; Laux J.et al., 2000; Marik P. et al., 2001; Chakrjvarti B. et al., 2002). У большинства больных пожилого возраста, поступающих на хирургическую коррекцию пороков сердца, имеется высокий риск инфекционных осложнений в послеоперационном периоде, вследствие чего возрастает частота ранней органной дисфункции и полиорганной недостаточности. Это связано с несостоятельностью противоинфекционной защиты, выраженным дисбалансом иммунной системы, которые обусловлены формированием основного заболевания и возрастным иммунодефицитом.
Выявленная полиморбидность снижения противоинфекционной защиты на фоне иммунодефицитных состояний повышает риск развития ранней органной дисфункции и полиорганной недостаточности, а также инфекционных осложнений в послеоперационном периоде, что требует изучения и разработки систематизированного подхода и иммунокоррекции больных старших возрастных групп.
В настоящее время эта проблема у кардиохирургических больных, в том числе с приобретенными пороками сердца и сочетанием их с ишемической болезнью сердца, остаётся в центре внимания и требует дальнейшего совершенствования предоперационной подготовки больных, особенно старших возрастных групп, включая дооперационную коррекцию иммунной системы с определением индивидуальной чувствительности к иммуномодуляторам. Важным является и разработка объективных критериев оценки эффективности иммунокоррекции у таких больных, особенно после операций, выполненных в условиях искусственного кровообращения. Эти вопросы у больных с приобретенными пороками сердца старшей возрастной группы остаются недостаточно изученными, что и определило актуальность и
задачи настоящего исследования.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
Цель исследования - определить характер иммунных нарушений у больных старшего возраста на разных этапах лечения при протезировании клапанов сердца в условиях искусственного кровообращения и разработать тактику коррекции иммунной недостаточности с применением метода оценки индивидуальной чувствительности к иммуномодуляторам для повышения эффективности лечения и профилактики послеоперационных осложнений.
Для достижения цели поставлены следующие задачи:
- изучить тип и степень нарушений иммунного статуса у больных
старшего возраста с приобретенными пороками сердца до операции и
обосновать применение превентивной иммунокоррекции при подготовке их к
операции;
оценить влияние искусственного кровообращения при протезировании клапанов сердца на формирование иммунной недостаточности у больных старшего возраста;
оценить сопряжённость развития осложнений в послеоперационном периоде с нарушением основных звеньев иммунной системы у больных с приобретенными пороками сердца и больных с сочетанной клапанной патологией и ишемической болезнью сердца;
разработать тактику коррекции вторичной иммунной
недостаточности с использованием оценки индивидуальной чувствительности к иммуномодуляторам при лечении послеоперационных осложнений;
- оценить эффективность иммунокоррекции в комплексной терапии
послеоперационных осложнений на разных этапах протезирования клапанов
сердца у лиц старшего возраста.
Научная новизна.
1. Показано, что нарастающая в процессе формирования приобретенных пороков сердца и особенно при сочетанной патологии сердца иммунная недостаточность у лиц старше 65-ти лет усугубляется развитием физиологического иммунодефицита, обусловленного возрастной инволюцией тимуса. Отмечается снижение уровня тимических гормонов и тимусзависимых субпопуляций лимфоцитов, что повышает риск послеоперационных осложнений при протезировании клапанов сердца.
2. Впервые у больных с клапанной патологией сердца изучены компенсаторные возможности Т-клеточного иммунитета (CD4+8+, CD3+4"8", CD4+45RO+, CD3+45RA+), играющих ведущую роль в компенсации физиологического иммунодефицита у больных старшего возраста. Подтверждена возможность использования их для диагностики и прогноза тяжести послеоперационного течения.
3. Впервые у больных с ППС и сочетанной патологией сердца старшего возраста исследовано в динамике влияние гипотермического ИК на ключевые звенья иммунитета (ранних мигрантов из тимуса, иммунорегуляторных субпопуляций, экспрессии активационных маркеров), а также цитотоксического потенциала, продукции цитокинов и функции АГ-презентирующих клеток.
4. Выявлена четкая зависимость восстановительного периода после ИК
от исходного состояния адаптационно-приспособительных реакций и
антиген-специфического ответа: при выраженном иммунодефиците до
операции отмечается слабая активация тимусзависимых иммунных реакций,
на фоне которых дополнительные травмы, кровопотеря приводят к
усугублению имеющихся дисфункций иммунной системы, в том числе по
механизму апоптоза.
5. Иммунокоррекцию у больных старшего возраста рекомендуется
проводить иммуномодуляторами заместительного типа, тимическими гормонами и цитокиновыми препаратами.
6. Показано повышение эффективности иммунокоррекции путем индивидуального подбора иммуномодуляторов, которое проявлялось устойчивой коррекцией иммунного дисбаланса в более ранние сроки с нормализацией клинического статуса. Практическая значимость.
Выявленная зависимость нарастания иммунных нарушений при операциях с искусственным кровообращением от исходного состояния иммунного статуса больных с ППС старше 65 лет указывает на необходимость иммунокоррекции при подготовке их к операции с целью профилактики послеоперационных осложнений.
Сохраняющийся иммунодефицит у больных с ППС и особенно у больных с сочетанной патологией сердца старшего возраста, оперированных в условиях искусственного кровообращения, служит основанием для проведения иммунокорегирующей терапии в качестве терапии сопровождения в комплексном лечении больных с оценкой индивидуальной чувствительности к иммуномодуляторам и последующей реабилитационной иммунокоррекции.
3. Иммунологические исследования при возрастном иммунодефиците у кардиохирургических больных старшего возраста должны включать дополнительную панель определения компенсаторных субпопуляций (CD4+8+, CD3+4T, CD4+45RO+, CD3+45RA+), играющих ведущую роль в компенсации физиологического иммунодефицита у больных старшего возраста, и применять их для диагностики и прогноза тяжести послеоперационного течения.
4. При назначении иммунокорегирующей терапии у кардиохирургических больных в протокол предоперационной подготовки и послеоперационного лечения должен быть включен хемилюминесцентный
тест оценки индивидуальной чувствительности к иммуномодуляторам. Контроль эффективности иммунокоррекции необходимо осуществлять на всех этапах в комплексном лечения кардиохирургических больных.
РЕАЛИЗАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ
Результаты исследования нашли применение в практической деятельности клинических отделений ФГУ «Научно-исследовательского института трансплантологии и искусственных органов Росмедтехнологий», и могут быть использованы в других кардиохирургических клиниках страны.
Материалы научных исследований используются в педагогической деятельности на кафедре трансплантология и искусственные органы ГОУ ВПО МГМСУ.
АПРОБАЦИЯ ДИССЕРТАЦИИ
Апробация диссертации состоялась 07 мая 2007года на заседании межлабораторной научной конференции лаборатории иммунодиагностики и иммунокоррекции, лаборатории стволовых клеток и лаборатории вспомогательного кровообращения и искусственного сердца ФГУ «НИИ Трансплантологии и искусственных органов Росмедтехнологий» и 19 июня 2007года на заседании кафедры трансплантологии и искусственных органов ГОУ ВПО МГМСУ Росздрава. Материалы и основные положения диссертации доложены на: II Всероссийском съезде трансплантологии и искусственных органах, на IX, X, XI Всероссийских съездах сердечнососудистых хирургов, на 7-ht Symposium of World artificial organ, immunology and Transplantation society (Waits).Russia., St-Petersburg.
Особенности течения послеоперационного периода у кардиохирургических больных старшего возраста
Кардиохирургическая операция и ее составляющие (экстракорпоральное кровообращение, анестезия, операционная травма, кровопотеря, переливание аллогенной крови) вызывает сложные нарушения гомеостаза и срыв компенсаторных механизмов, что является причиной развития послеоперационных осложнений, особенно у больных старшего возраста [81,82]. Операция на сердце теоретически относиться к категории «чистых», однако на практике они сопряжены с высоким риском развития послеоперационных инфекционных осложнений. Это связано со спецификой кардиохирургического вмешательства, которое имеет высокоинвазивныи характер. Также среди механизмов инфицирования выделяют эндогенный путь, ключевую роль в запуске которого играет искусственное кровообращение (ИК). Отмечено, что в условиях операций с ИК имеет место реализация практически всех возможных патогенетических механизмов бактериальной транслокации (нарушение гемодинамики, сопровождающееся ухудшением мезентериального кровотока, стресс, гипоксия, гипотермия, гипопротеинемия и др.) [167, 172,190, 194,203,204].
Инфекционные процессы осложняют течение послеоперационного периода у 13-25% пожилых больных из совокупной группы пациентов кардиохирургического стационара [1, 88]. При коррекции клапанной патологии у больных старшего возраста в условиях искусственного кровообращения инфекционные осложнения развиваются в 16-25,4 % [66, 67]. Влияние на частоту возникновения инфекционных осложнений оказывает прежде всего длительность периода искусственного кровообращения, объем интраоперационной кровопотери, продолжительность оперативного вмешательства, его кратность [16].
Для группы инфекционных осложнений, таких операционная травма у пожилых пациентов служит провоцирующим фактором для возникновения инфекционных осложнений, таких как ангиогенный, бронхолегочный, урологический сепсис, инфекционный эндокардит клапанного протеза. Помимо ранее указанных факторов в развитии инфекционных осложнений существенное значение имеет характер послеоперационного пособия: длительность катетеризации сосудов и полостей, продолжительность ИВЛ и пребывания больного в отделении интенсивной терапии [138, 160].
Подробные данные о частоте ранних осложнений у больных старшего возраста [138] получены в результате анализа течения послеоперационного периода в зарубежных кардиохирургических стационарах [132], основанного на исследовании историй болезни у 2419 больных в возрасте от 60 до 87 лет. Показано, что при операциях на сердце у каждого из 924 больных (38,2% от общего числа) имелись клинически значимые осложнения. Частота осложнений распределилась следующим образом: суправентрикулярные нарушения ритма-34%, цереброваскулярные осложнения и эмболии -12%, послеоперационное кровотечение, потребовавшее реторакотомии -10%, дыхательная недостаточность -7%, пневмонии-5%, почечная недостаточность -5%, блокады сердца-4%, переоперационный инфаркт миокарда -4%, синдром низкого выброса -3%, внутрибаллонная контрпульсация-2%. Другие осложнения составили 14% и включали гастроэнтерологические осложнения, послеоперационный психоз, расхождение грудины, перикардит, РДС-синдром, гиповолемический шок, инфекции мочевых путей. Причем, при всех типах операций на сердце происходит двукратное увеличение риска осложнений у больных, достигших 80 лет, по сравнению с менее пожилыми пациентами.
Основными факторами, повышающими риск госпитальной летальности в кардиохирургии у больных старших возрастных групп считают, хронические неспецифицеские заболевания легких, послеоперационный инфаркт миокарда, внутриаортальная баллонная контрпульсация (ВАБК), прогрессирование застойной сердечной недостаточности, почечную недостаточность и болезни периферических сосудов [11, 167, 172, 190].
Частота летальности у больных старшего возраста по данным National Cardiovascular Network [133, 136] в зависимости от типа вмешательства на сердце представлена в таблице 1.1
Из таблицы 1. видно, что сочетание аортокоронарного шунтирования и протезирования клапанов сердца во всех возрастных группах сопровождалось существенным увеличением риска летальности. Почти для всех кардиохирургических вмешательств с увеличением возраста пациентов возрастал риск оперативной летальности [132].
Прогресс в области анестезиологии и интенсивной терапии, достигнутый за последние годы, позволил пересмотреть и расширить показания к кардиохирургическому лечению больных старших возрастных групп, что выдвигает на первый план новые проблемы к оценке функциональных резервов и операционного риска. Учет этих обстоятельств требует проведения определенной предоперационной подготовки [13, 96, 123, 124].
Таким образом, у большинства больных пожилого возраста, поступающих на хирургическую коррекцию пороков сердца, имеется высокий риск инфекционных осложнений в послеоперационном периоде, развитие ранних органных дисфункций и полиорганной недостаточности, что связано с несостоятельностью противоинфекционной зашиты, в первую очередь обусловленной состоянием иммунной системы.
У кардиохирургических больных старшего возраста в результате хирургической травмы развивается дисфункция иммунной системы [33]. Причинами ее возникновения обьлно является высокая инфицированность микроорганизмами, с которыми не может справиться даже полноценно функционирующая иммунная система. При этом отмечается недостаточность или неэффективность проводимой антибактериальной терапии [57, 59, 67, 103, 104], а также массивная деструкция тканей.
Несмотря на непрерывное совершенствование антибактериальной терапии и кардиохирургической техники, инфекционные осложнения, являющиеся одним из основных клинических проявлений иммунной недостаточности, остаются главной причиной летальности у кардиохирургических пациентов с серьезными повреждениями [103, 104], особенно у больных старшего возраста. Эти изменения касаются всех параметров иммунной системы:
Иммунологическое обследование больных
Введение имунофана в схему комплексной терапии хирургических больных с инфекционно- гнойным осложнениями (7-10 инъекций 1 раз в сутки, в случае необходимости - до 20 инъекций с интервалом 1 день) позволяет снизить гиперпродукцию ФНО в 10-20 раз по отношению к исходному уровню. Применение имунофана в комплексном лечении особенно тяжелых осложнений позволило существенно снизить летальность [27, 56]. Так, летальность у больных с септической пневмонией и перитонитом, не получавшим имунофан, составила 80 и 78%, при применении же в комплексном лечении этих больных имунофан снижает летальность до 33 и 50%.
Экстракорпоральная иммунофармакотерапия имунофаном активирует ранние этапы антителогенеза и увеличивает синтез иммуноглобулинов [27,43]. Среди иммуномодуляторов с преимущественным активирующим действием на моноциты и нейтрофилы выделяются ликопид, полиоксидоний и колониестимулирующий факторы. Применение инъекционной формы ликопида (0,125 мг каждый день внутримышечно в течение 10 дней) показало его высокую клиническую эффективность при лечении осложнений после операций а магистральных и коронарных артериях, парапротезных свищей, медиастинитов, трофических и воспалительных явлений в области сосудистых протезов, при осложнениях после торакальных операций. Эффективной дозой для терапии является доза 10 мг 1 раз в день в течение 10 дней.
Полиоксидоний стимулирует функциональную активность трех важнейших субпопуляций фагоцитов: подвижных макрофагов тканей, циркулирующие фагоциты кров и оседлые фагоциты ретикуло-эндотелиальной ткани [29, 111]. Это проявляется в повышенной способности фагоцитов поглощать и переваривать микробы, в образовании активных форм кислорода, повышении миграционной способности нейтрофилов. Полиоксидоний также обладает способностью снижать при совместном введение токсичность ряда лекарственных средств. Взаимодействие полиоксидония с нейтрофилами и моноцитами ведет к изменению их функциональной активности, проявляющееся в усилении синтеза цитокинов и фагоцитоза. Помимо иммуномодулирующего эффекта, полиоксидоний обладает выраженным детоксикационным, антиоксидантным и мембраностабилизиующим эффектами. Препарат эффективен для лечения больных с генерализованными формами хирургической инфекции: сепсис, перитонит, абсцессы и инфильтраты, гнойно - воспалительные процессы. Полиоксидоний назначают внутримышечно, используя дозы от 6 до 12 мг. Курс введения полиоксидония - от 5 до 7 инъекций, через день или по схеме 1-2-5-8-11-14 дни введения препарата [29].
По мнению ряда авторов включение иммуномодулирующих препаратов в комплексную терапию хирургических больных, протекающих на фоне вторичной иммунной недостаточности, особенно у лиц пожилого возраста, оказывает положительное влияние на эффективность лечения [8,10, 14,23,96,100,217].
Особенности иммунной системы человека, многообразии нарушения ее функций, а также все увеличивающийся арсенал иммунотропных средств диктуют необходимость индивидуального подбора или чувствительности к иммуномодулятору. Для разработки метода индивидуального подбора иммуномодулятора in vitro мы использовали люминолзавсимую хемилюминесценцию (ХЛ) нейтрофилов цельной крови, (было проведено более 2000 исследований)[72, 80,106, 107]. Для оценки чувствительности к иммуномодуляторам при назначении иммунотерапии рядом авторов предложено использовать метод люминолзависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ) нейтрофилов. Нейтрофил это клетка иммунной системы, наиболее быстро реагирующая на различные раздражители и стимуляторы, в т.ч. и медикаментозные, кроме того, нейтрофилы полифункциональные клетки иммунной системы, инициируют весь каскад иммунных реакций, представляют антигены Т-лимфоцитам, уничтожают чужеродные антигены, усиливают приток иммунокомпетентных клеток в очаг воспаления, а также стимулируют репаративные и гемопоэтические процессы [21, 66].
Полиморфоядерные нейтрофилы обладают максимальной светимостью среди всех фагоцитирующих клеток, способных при активации генерировать активные формы кислорода (АФК)[27, 21]. Наиболее чувствительным методом оценки образования (АФК) является метод люминолзависимой хемилюминесценции [41, 63, 66].
Генерация (АФК) - супероксида аниона (О), перекиси водорода, гидроксила аниона (ОН") и синглетного кислорода гранулоцитарно -макрофагальными клетками (ГМК) в системе цельной крови осуществляется при их сложенных кооперативных взаимодействиях с другими факторами крови [ 72, 106, 107, 206] и относиться к числу ранних молекулярных событий при контакте ГКМ с внешним сигналом. Это сопровождается эффектом хемилюминесценции, характеризующим их функциональную активность.
Исследование показали, что исследование ФАН по ХЛ-тесту и индивидуальный подбор иммуномодуляторов по этому методу позволяют оценить перспективы проведения иммунотерапии (иммунокоррекции, иммуномодуляции и иммунореабилитации). Кроме того, этот тест позволяет выбрать иммуномодулятор с оптимальным влиянием на фагоциты/нейтрофилы и исключить применение препаратов, вызывающих индивидуальные реакции подавления ФАН. Тест позволяет подбирать индивидуальные дозы иммуномодулятора, мониторировать проводимую иммунокоррекцию и оптимизировать схему терапии, определяя частоту введения того или иного препарата по продолжительности ответа на него.
В настоящее время эта проблема у кардиохирургических больных, в том числе с приобретенными пороками сердца и сочетанием их с ИБС, остаётся в центре внимания и требует дальнейшего совершенствования предоперационной подготовки больных, особенно старших возрастных групп, включая дооперационную коррекцию иммунной системы и определением индивидуальной чувствительности к иммуномодуляторам. Важным является и разработка объективных критериев оценки эффективности иммунокоррекции у таких больных, особенно после операций, выполненных в условиях искусственного кровообращения. Эти вопросы у больных с приобретенными пороками сердца старшей возрастной группы остаются мало изученными, что и определило актуальность и задачи настоящего исследования.
Влияние ИК на формирование иммунной недостаточности у больных старшего возраста при протезирование клапанов сердца
Гуморальное звено иммунитета оценивали по относительному и абсолютному содержанию В-лимфоцитов (СБ19+кл.), концентрации иммуноглобулинов классов G,A,M в сыворотке крови методом радиальной иммунодиффузии в геле (Manchini G. et al.,1965), а также сывороточному уровню низкомолекулярных (6% ПЭГ) иммунных комплексов (ЦИК) (Федосеева В.Н. 1993г).
Уровень иммуноглобулинов трех основных классов IgG, IgA, IgM определяли с использованием моноспецифических сывороток методом радиальной иммунодиффузии в геле (Manchini G.) в модификации лаборатории основанной на принципе партигенов.
Принцип метода количественного определения иммуноглобулинов заключается в том, что исследуемые образцы сыворотки или плазмы помещают в лунки агара, который содержит антитела к иммуноглобулинам одного из классов (IgG, IgA, IgM) в известной концентрации. Иммуноглобулины образца диффундируют из лунок в агар, при взаимодействии с соответствующими антителами образовывают кольца преципитации, размер которых находиться в тесной зависимости от содержания в образце иммуноглобулинов соответствующего класса.
Для определения циркулирующих иммунных комплексов брали 3 пластиковые пробирки. В первую наливали 2,7 мл боратного буфера, во вторую 2,7 мл 4% ПЭГ, в третью 2,7 мл 6% ПЭГ , в четвертую пробирку капали 0,6 мл боратного буфера и добавляли 0,3 мл испытуемой сыворотки крови и перемешивали. Затем из четвертой пробирки по 0,3 мл разведенной боратным буфером испытуемой сыворотки добавляли в первую, вторую и третью пробирки и оставляли при комнатной температуре на 1 час. Содержимое пробирок через 1 час переносили в специальные кюветы и производили измерение на спектрофотометре при длине волны 450 нм. Содержание крупномолекулярных циркулирующих иммунных комплексов определяли по разнице значений, полученных при измерении на спектрофотометре испытуемой сыворотки с 4% ПЭГ и испытуемой сыворотки с боратным буфером. Содержание низкомолекулярных циркулирующих комплексов рассчитывали по разнице значений полученных при измерении испытуемой сыворотки с 6% ПЭГ и испытуемой сыворотки с боратным буфером (В.Н. Федосеева 1993г).
Фагоцитарную активность нейтрофилов крови определяли по фагоцитозу убитой взвеси Staph.Aureus и бактерицидности в спонтанном и индуцированном NST -тесте спектрофотометрическим методом при длине волны 650 нм (Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 1995г).
В окрашенных мазках подсчитывали число фагоцитирующих клеток на 100 нейтрофилов ( фагоцитарный индекс, ФИ, %), количество микробных тел, поглощенных в среднем одним нейтрофилом ( фагоцитарное число, Ф.Ч., микробных тел). После этого высчитывали интегральный показатель - АПФ ( абсолютный фагоцитарный показатель) - количество микроорганизмов, поглощенных нейтрофилами одного мкл крови. Высчитывали также индекс завершенности фагоцитоза (ИЗ), характеризующий переваривающую способность нейтрофилов. Для этого из фагоцитарного числа 1-часового фагоцитоза вычитали фагоцитарное число 2-х часового фагоцитоза, полученную разницу делили на фагоцитарное число, в результате чего получали индекс завершенности фагоцитоза, выраженный в процентах.
Цитокиновый - (интерлейкиновый) статус (TNFa, IL2, IL4,IL6,IL8,IL10, INF-гамма) оценивали твердофазным методом ИФА с использованием отечественных наборов (фирмы «Цитокин» С.-Петербург) для количественного анализа интерлейкинов человека в образце крови.
В наборе использован «сэндвич» - вариант твердофазного иммуноферментного анализа. Для реализации этого варианта использованы два моноклональных антитела с различной эпитопной специфичностью к ИЛ.
На первой стадии анализа ИЛ, содержащийся в калибровочных и исследуемых пробах, связывается с антителами, иммобилизованными на внутренней поверхности лунок. На второй стадии анализа иммобилизованный ИЛ взаимодействует с коньюгатом антител-биотина. На последний стадии в лунку вносят авидин-пероксидазу. Количество связывающегося конъюгата прямо пропорционально количеству ИЛ в исследуемом образце.
Во время инкубации с субстратной смесью происходит окрашивание раствора в лунках, степень окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся меченных антител. После измерения оптической плотности раствора в лунках спектрофотометрическим методом с длиной волны 450 нм на основании калибровочной кривой рассчитывается концентрация ИЛ в определяемых образцах.
Индивидуальную чувствительность к иммуномодуляторам оценивали люминолзависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ) лейкоцитарной суспензии с использованием фотометра/люменометра LUCY-2(ANTHOS) Австрия.
Для получения лейкоцитарной суспензии гепаринизированную кровь отстаивали с 3% раствором желатина. Популяции мононуклеаров и нейтрофилов периферической крови получали с помощью центрифугирования на двойном градиенте плотности фиколла-верографина 1,077 и 1,093 соответственно (Лимфоциты. Методы, 1990). Контроль чистоты выделенных клеточных фракций осуществляли микроскопическом анализом микропрепаратов, окрашенных по Романовскому-Гимза. Фракция полиморфноядерных лейкоцитов состояла из 98-99% нейтрофилов, лимфоциты составляли 1-2%.
При постановке ХЛ-теста проводилась инкубация (60 минут при 37С) лейкоцитарной суспензии в конечной концентрации, создаваемой в крови при введении разовой терапевтической дозы препарата. В качестве зонда (усилителя свечения) использовали люминол («Sigma»,CIIIA), в качестве активатора «респираторного взрыва» применяли зимозан («Sigma»,CIIIA). (Владимиров Ю.А.,1989). Интенсивность хемилюминесценции рассчитывали с помощью программного обеспечения, что позволяло провести сравнительную оценку в условных единицах (у.е.) интенсивности свечения хемилюминесцентной реакции фотометром/люменометром с диапазоном спектральной чувствительности в режиме люминесценции 300-700нм.
Нарушение иммунного реагирования у больных старшего возраста с приобретенными пороками сердца в раннем послеоперационном периоде
У больных старшего возраста с ППС и сочетанной патологией, основным заболеванием в 65% случаев является ревматические пороки сердца, поэтому наблюдается активация гуморального звена по Т- хелперзависимому типу иммунному ответу (Th-2). Эти данные представлены в таблице 5.2.7.
Недостаточность в клеточном звене иммунной системы компенсируется фагоцитарно-макрофагальным звеном иммунной системы, которое несет антимикробный потенциал (таб.5.2.1). В старшей возрастной группе фагоцитарно-макрофагальная система имеет свои особенности, которые проявляются увеличением количественных показателей. Лейкоцитоз в раннем послеоперационном периоде происходит за счет увеличения количества нейтрофилов, но функционально клетки макрофагально-фагоцитарной системы слабоактивные. Это проявляется снижением фагоцитарной функцией (поглотительной), которая компенсируется оксидативной активностью нейтрофилов связанной с продукцией свободно-радикального кислорода и продукцией перекиси (бактерицидность клеток). Повышение оксидазной активности вызывает деструкцию клеток и тканей организма, приводя к их повреждению, что требует изучения резервных возможностей нейтрофилов.
Из таблицы 5.2.8. видно, что фагоцитарная активность нейтрофилов снижена в группе больных с летальным исходом: (% фагоцитоза и фагоцитарное число - 36,0 и 2.8% соответственно), в группе с осложненным послеоперационным периодом переведенных в отделения - 63,0 и 4,3%, а в группе с неосложненным послеоперационном периодом показатели умеренно снижены: % фагоцитоза- 66,0 и (Ф-Ч.) 4,8, что характерно для пожилого возраста. Абсолютный фагоцитарный показатель повышен у всех групп за счет нейтрофильного лейкоцитоза. Метаболическая (оксидативная) активность нейтрофилов отмечалась следующим образом: у всех групп пожилых больных повышена спонтанная продукция свободно - радикального кислорода( NST-тест), индуцированная NST- снижена у больных с летальным исходом - (153 у.е. к спонтанной 391 у.е.), и у больных с осложненным послеоперационным периодом -(255 у.е. к 207 у.е. спонтанной). У больных с неосложненным послеоперационным периодом наблюдалась повышение показателей, как спонтанной NST (326 у. е.), так и индуцированной (555 у.е.), что отразилось на показателе индекса стимуляции (1,7), отражающей сохранность резервной функции нейтрофилов. У больных со сниженными этих показателями, (это больные с летальным исходом, ИС - 0,4 у больных с осложненным послеоперационным периодом и переведенных в отделения ИС-1,3, что указывает на истощение как функциональных, так и резервных (восстановительных) возможностей клеток нейтрофильного ряда!
Проведенные исследования показали, что у пожилых больных снижение антимикробного потенциала происходит за счет снижения функциональной фагоцитарной активности, увеличения количества клеток нейтрофилов не компенсирует антимикробный потенциал, а повышение метаболической (оксидазной) активности нейтрофилов оказывает деструктивное действие на клетки и ткани, повышая интоксикацию организма.
Таким образом, проведенное нами иммунологическое обследования больных старшего возраста с приобретенными пороками сердца и сочетанной патологией с учетом патогенетических принципов расстройств основных звеньев иммунной системы показали, что основным составляющими развитияе осложнений в раннем послеоперационном периоде у больных старшего возраста на фоне имеющейся дисфункции иммунной системы, в частности вторичного иммунодефицита Т-клеточного звена, является иммунодепрессия, которая развивается после кардиохирургических операций и ее составляющих (анестезия, экстракорпоральное кровообращение, операционная травма, алогенное переливание крови). Специфическая иммунодепрессия выражается в: 1.Резком снижении содержания количества лимфоцитов, в том числе с фенотипом субпопуляций Т-лимфоцитов, подвергающимися как прямым повреждением (некробиоз), так и программированной гибели клеток (апоптоз).2. Блокаде антигенраспознающих структур иммунокомпетентных клеток избытком антигенов (иммунопаралич). З.Иммуносупрессией после активации для Т-клеток, и блокадой для В-клеток бактериальными суперантигенами. 4. Ареактивности зрелых эффекторных лимфоцитов. 5. Супрессивных эффектах регуляторных Т-лимфоцитов (хелперов), провоспалительных цитокинов и специфических супрессорных факторов в отношение специфичных к антигенам лимфоидной клонов. Факторами вызывающими неспецифическую иммунодепрессию являются: 1 .Супрессивные эффекты неспецифических регуляторных факторов общей активации (глюкокортикоиды, катехоламины, простагландины). 2.Супрессивные эффекты факторов компенсаторного противовоспалительного ответа (провоспалительные цитокины), направленные на различные клетки иммунореактивности. 3. Иммуносупрессия, противодействующая поликлональной активации лимфоцитов.4. Эндотоксиновая толерантность мононуклеарных фагоцитов. Анализ состояния иммунной системы у больных старшего возраста с приобретенными пороками сердца с септической полиорганной недостаточностью в раннем послеоперационном периоде проводили у 2-х групп больных: 1 группа - выживших больных с переводом в профильное кардиохирургическое отделение, и 2 группа - больных с летальным исходом.
Оценивали защитно-компенсаторные механизмы иммунной системы, ответственные за адаптацию и выживаемость больных старшего возраста. Мониторинг осуществлялся на 5-е, 10-е, 15-е сутки, и перед переводом в отделение или летальным исходом (таблице 5.2.9). Больные 1 и 2 группы находились в отделение ОРИТ от 19 до 23 суток, в связи с развитием полиорганной недостаточности, которая проявлялась дисфункцией по 4-5 органам и системам (миокардиальная, дыхательная, почечно-печеночная, энцефалопатия), и осложнялась сепсисом.
Иммунологическое обследование выявило: у всех больных лейкоцитоз нейтрофильного типа с относительной лимфопенией на 5 сутки после операции, который расценивался как защитная реакция. Однако у 2-й группы больных с (летальным исходом), лейкоцитоз имеет более высокие показатели до (44500 в мкл), по сравнению с 1-ой группой (с переводом в отд.) - 16400 (в мкл).
