Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Инфекционные осложненния в хирургии клапанных по роков сердца: возможные пути решения проблемы 8
1.1. Инфекционный эндокардит 8
1.2. Консервация биопротезов' клапанов сердца: аспекты истории 16
1.3. Антибактериальная модификация материалов для сердечно-сосудистой хирургии 22
Глава II. Материалы и методы исследования 30
2.1. Методы химической обработки биоматериала 30
2.1.1. Методы консервации биоматериала 30
2.1.2. Методы обработки биоматериала антибактериальными препаратами 30
2. 2. Методы определения структурной стабильности консер вированного биоматерила 31
2. 2. 1. Аминокислотный анализ 32
2.2.2. Изучение физико-механических свойств ксенобиопротезов 33
2.3. Изучение процессов хемосорбции и десорбции антибактериального препарата хлоргексидина 35
2.4. Исследование антибактериальных свойств биоматериала 36
2.4.1.Изучение антибактериальной активности иммобилизо ванных препаратов методом дисков...: 36
2.4.2. Изучение антибактериальных свойств модифицированного биоматериала при инкубации в потоке инфицированной крови 37
2.5. Изучение свойств поверхности биоматериала методом электронной сканирующей микроскопии 40
2. 6. Методы статистической обработки материала 41
Глава III. Обоснование подходов к антибактериальной модификации ксенобиопротезов клапанов сердца 42
3.1. Сравнительная оценка сшивающей активности эпоксидных консервантов. Изучение аминокислотного состава консервированного биоматериала 42
3.2. Изучение возможности антибактериальной модификации биоматериала различными антибактериальными препаратами. Выбор антибактериального агента 45
3.3. Влияние концентрации хлоргексидина на эффективность модификации биоматериала 51
Глава IV. Разработка технологических параметров антибактериальной модификации биоматериала 58
4.1. Изучение процессов сорбции хлоргексидина эпоксиобрабо-танным биоматериалом 59
4.2. Изучение процессов десорбции хлоргексидина из створок биопротезов клапанов сердца 64
4.3. Физико-механические свойства и структура поверхности модифицированной биоткани 76
Глава V. Оценка эффективности разработанного метода анти бактериальной модификации биоматериала 83
Заключение 96
Выводы 108
Практические рекомендации 110
Список литературы 112
- Консервация биопротезов' клапанов сердца: аспекты истории
- Изучение физико-механических свойств ксенобиопротезов
- Изучение возможности антибактериальной модификации биоматериала различными антибактериальными препаратами. Выбор антибактериального агента
- Изучение процессов десорбции хлоргексидина из створок биопротезов клапанов сердца
Введение к работе
Актуальность работы: Инфекционный эндокардит, поражающий естественные клапаны сердца или их протезы, представляет сегодня одну из наиболее сложных и острых проблем хирургии приобретенных пороков сердца [6]. Если вопрос об активной хирургической тактике при инфекционном эндокардите сегодня практически решен, то проблема выбора протеза в таких случаях остается весьма актуальной. В последние годы резко возрос интерес к разнообразным биологическим протезам [89, 126].
Однако основная масса исследований, посвященных разработке кардиоваскулярных протезов с антибактериальными свойствами, касается синтетических сосудистых протезов или синтетической манжеты механических протезов клапанов. В качестве антибактериального агента чаще всего используют антибиотики [118, 119]. При данном подходе обычно используют биодеградируемую матрицу, способную связать значительное количество препарата с выделением его в кровоток после имплантации за счет постепенного разрушения этой матрицы ферментными или другими системами организма реципиента. Выраженность антибактериального эффекта в этом случае зависит как от объема матрицы, так и от "контролируемости" ее биодеградации, то есть, от способности выделять в течение продолжительного времени (как правило, до 3 недель) количество препарата, достаточное для бактерицидного (или бактериостатического) воздействия. Однако такой подход страдает существенным недостатком: эффект лимитирован во времени, так как депо антибиотика истощается. Ковалентная же иммобилизация антибиотиков неэффективна, так как известно, что механизм их действия связан с включением в метаболизм бактериальной клетки [118, 119].
Исследований, посвященных антибактериальной модификации биологической части биопротезов клапанов сердца, в доступной литературе нет.
Использование эпоксидных консервантов открывает широкие возможности для модификации именно биологической ткани протеза различными биологически активными веществами [33, 54], в том числе и антибактериальными препаратами. Однако основной задачей при этом является правильный выбор антибактериального агента, способного "работать" в иммобилизованном состоянии.
Цель исследования: Обоснование возможности создания биологических протезов клапанов сердца, обладающих антибактериальной активностью, на основе консервации эпоксидными соединениями с последующей модификацией.
Задачи исследования:
Провести скрининговую оценку антибактериального эффекта ряда иммобилизованных препаратов in vitro.
Разработать технологические параметры антибактериальной модификации створок биопротезов клапанов сердца, консервированных различными эпоксидными препаратами.
Оценить влияние базовой консервации и модификации антибактериальным препаратом на физико-механические параметры и структуру поверхности биологической ткани.
Исследовать антибактериальные свойства биоматериала, модифицированного в соответствии с разработанной технологией, в модельном эксперименте, приближенном к условиям реального кровотока.
Новизна исследования
впервые экспериментально доказана возможность придания антибактериальных свойств ксеногенным биологическим протезам клапанов сердца;
разработаны основные технологические параметры антибактериальной модификации биоматериала, консервированного различными эпоксидными препаратами;
разработана модель, позволяющая оценить антибактериальные свойства, придаваемые биоматериалу в результате модификации антибактериальными препаратами;
на основании полученных результатов предложено устройство для раздельной модификации поверхностей сосудистых биопротезов антибактериальным препаратом и антикоагулянтом (свидетельство на полезную модель N 12960).
Практическая значимость работы
Разработан метод количественного определения иммобилизованного на биоткани хлоргексидина.
Разработаны адаптированные для серийного производства технологические параметры антибактериальной обработки ксенобиопроте-зов, консервированных эпоксидными препаратами.
Отработана экспериментальная модель для скрининговой оценки антибактериальных свойств биоматериала при контакте с инфицированной кровью.
Результаты исследования послужили основой для разработки новых моделей биопротезов клапанов сердца.
Работа выполнена в Кемеровском кардиологическом центре (директор - член-корреспондент РАМН Л.С.Барбараш).
По теме исследования опубликовано 15 печатных работ. Результаты доложены на 11-м съезде Европейской Ассоциации кардио-тора-кальных хирургов (Копенгаген, 1997 г.), где были удостоены премии У.Лиллехая, на Всероссийском съезде ангиологов и сосудистых хирургов (1999), на I и II научных сессиях "Актуальные проблемы кардиологии и сердечно-сосудистой хирургии" (Кемерово,1997,1998).
Автор благодарит научного руководителя работы д.м.н. И.Ю.Журавлеву, выражает искреннюю признательность за творческую помощь и дружеское участие в работе ведущему научному сотруднику отдела биотехнологий Кемеровского кардиологического центра к.м.н. И.А.Климову, а также Г.Ф.Веделю, Т.М.Наймушиной (НИИ угля и угле-химии СО РАН, г.Кемерово), к.м.н. П.М.Ларионову (НИИ патологии кровообращения им.Е.Н.Мешалкина) и В.В.Шапрову (НИИ молекулярной биологии РАН, г.Новосибирск). Автор искренне благодарен сотрудникам Кемеровского кардиологического центра Т.Д.Галиной, Л.Г.Савенковой, И.М.Моисееву, к.б.н. Р. А.Мухамадиярову, к. б. н. И. Л. Гантиму-ровой за безвозмездную дачу крови для выполнения экспериментов.
Консервация биопротезов' клапанов сердца: аспекты истории
Известно, что к биологическим заменителям клапанов сердца относят как трансплантаты, так и биопротезы. Необходимо придерживаться четкого разграничения понятий "трансплантат" (в англоязычной литературе - "графт") и "биопротез". Трансплантат - это жизнеспособный орган, функция которого зависит от его способности регенерировать, не вступая в иммунологический конфликт с организмом реципиента. Биопротез, согласно классической формулировке, данной в 1969 г. A.Carpentier, лишен жизнеспособности и антигенной активности в результате химической обработки. Его функция зависит от структуры биологического материала, укрепленной химической сшивкой [103].
Можно считать, что эпоха ксенобиопротезов клапанов сердца началась 35 лет назад, когда в 1965 г. Binet применил для консервации ксеноматериала препарат "Cialit" и пересадил серию таких клапанов больным [93]. Данный метод обработки не получил широкого распространения, так как через короткие сроки после . имплантации эти клапаны подвергались выраженным деструктивным изменениям с развитием клинически выраженных дисфункций.
Новый подход к вопросам консервации ксеноаортальных клапанов был связан с применением М.O Brien и J.Clarebrough 4% формальдегида [171]. В отличие от предыдущих методов, направленных лишь на обеспечение стерильности и сохранение структуры-клапана, использование формальдегида позволило увеличить структурную стабильность и повысить прочность ткани за счет поликонденсации белков. Данный способ консервации был встречен с энтузиазмом, но клинические результаты его применения продемонстрировали высокий процент ранних дисфункций - 60% через 2 года и 100% через 4-6 лет. Деструктивные изменения ткани были связаны со свойствами самого консерванта: формальдегид, имеющий в структуре лишь одну реакци-онноспособную группу (моноальдегид), образует с коллагеном преимущественно интрамолекулярные связи, слабые и обратимые. Следствием этого является регрессирование во времени таннирующего и иммунодепрессивного эффектов формальдегидной. обработки [162, 213].
В 1969 г. A.Carpentler предложил применять для консервации биопротезов клапанов сердца глутаровый альдегид (ГА). Сначала в комплексе с метапериодатом натрия [103], а затем и самостоятельно глутаровый альдегид использовали в качестве основного сшивающего агента для придания биоткани структурной стабильности. Вплоть до настоящего времени все коммерческие модели биопротезов продолжают обрабатывать глутаровым альдегидом [86, 88, 95, 97, 143, 144, 207].
Применение консерванта должно гарантировать: стерилизующий эффект, структурную стабильность ткани ксенобиопротеза, сохранение ею основных механических свойств (прочности и гибкости), а также профилактику иммунных реакций и защиту от врастания клеток реципиента [103].
За счет двух реакционно-способных групп ГА происходит процесс поперечной сшивки коллагена, денатурация неколлагеновых белков - гликопротеинов и протеогликанов, девитализация клеточных элементов, что в целом повышает прочность ткани и делает ее биологически инертной [6].
Глутаральдегид реагирует с первичными аминами лизина, гидрок-силизина или N-терминальными остатками аминокислот, значительная часть которых при этом блокируется [134, 163]. В результате этих реакций образуются химические связи, представленные, в основном, основаниями Шиффа и пиридиновыми основаниями [213]. Данные типы связей отличаются достаточно высокой стабильностью при физиологических значениях температуры и рН [192]. Интенсивность и химические характеристики сшивки полипептидной цепи коллагена определяются длительностью экспозиции, температурой, значением рН среды, концентрацией и составом глутаральдегида (соотношением количества мономерных и полимерных форм в водном растворе последнего) [176]. Оценка клинических результатов использования ГА-обработанных биопротезов клапанов сердца в первые несколько лет после операции носит положительный характер. Процент клапаннообусловленных осложнений, как правило, ниже, чем при имплантации механических моделей или аллотрансплантатов [155].
Однако с течением времени (обычно, через 7-10 лет после операции) консервация глутаровым альдегидом приводит к патологической минерализации биоткани, следствием которой является развитие дисфункции биопротеза [95, 102, 126, 127, 170]. Высокая частота развития таких дисфункций резко ухудшает отдаленные результаты биопротезирования клапанов сердца, в связи с чем в настоящее время показания к их использованию ограничены очень узким контингентом больных [7, 32, 51, 79, 82].
Ведущая роль ГА в структурных трансформациях коллагеновой матрицы не вызывает сомнений, и, по-видимому, качество этих трансформаций определяет способность биоматериала к кальцификации. Недостатки ГА-обработанных биопротезов клапанов сердца постулировали необходимость замены традиционного сшивающего агента на новый консервант. В 1987 г. C.NoJiri с соавторами доказали в эксперименте, что эпоксидные соединения различной химической структуры могут быть использованы для создания сосудистых биопротезов малого диаметра [169]. G.Murayama с соавторами [165] исследовал иммунологические и антигенные характеристики эпоксиобратонной ткани в сравнении с ГА-обработанными образцами и пришли к выводу о том, что оба сшивающих агента эффективно уменьшают антигенные и иммуногенные ха рактеристики биоматериала. В частности, биопротезы, консервированные диэпоксидом, в значительно меньшей степени активируют систему комплемента, чем ГА-консервированные. Это благоприятно отражается и на гемосовместимости биопротезов [60].
В России исследования, посвященные возможности использования эпоксисоединений для консервации биологических клапанов сердца и сосудов, были начаты в 1988 г. в Кемеровском кардиологическом центре и завершились созданием ряда принципиально новых моделей биопротезов для сердечно-сосудистой хирургии. Это, в частности, биопротезы клапанов сердца КемКор, консервированные диглицидило-вым эфиром этиленгликоля (ДЭЗ) [68], и биопротезы артерий КемАн-гиопротез, обработанные ДЭЗ с последующей ковалентной фиксацией гепарина [69]. Эти модели в течение 8 лет прошли успешную апробацию в клиниках России [188].
Изучение физико-механических свойств ксенобиопротезов
Известно, что важнейшим требованием к предимплантационной химической обработке биоматериала является сохранение или улучшение его физико-механических свойств в результате консервации. Такие исследования были проведены ранее [46]. В настоящем исследовании было необходимо изучить влияние антибактериальной модификации на физико-механические свойства консервированного биоматериала.
Исследование проведено совместно с сотрудником научно-исследовательского института химии углеродных материалов СО РАН, с.н.с. Т. М.Наймушиной (г.Кемерово). Физико-механические испытания проведены в условиях продольного растяжения однотипно приготовленных образцов. Образцы в виде "лопаток" со стандартной длиной рабочего сегмента (L) (ГОСТ 11262-80) вырезали из биоткани с помощью специального ножа [5, 48, 79]. Эксперименты выполнены на разрывной машине "Digital Electronic Fabre Tester" тип FM-27 (Hungary). У всех образцов с помощью окуляра-микрометра измеряли толщину сегмента (h). По результатам испытаний расчитывали следующие показатели: - разрушающее напряжение при растяжении б (кг/см2) б = Р max / S , (1) гДе Ртах " разрушающая нагрузка (кг) S - площадь поперечного сечения образца (см); - относительное удлинение Е(%) Е - AL/L-100 % , (2) где ДЬ - максимальное удлинение образца до разрушения (мм); L - исходная длина образца (мм) Разрушающее напряжение при растяжении характеризует прочность биоматериала, а относительное удлинение определяет его эластичность. Были исследованы следующие серии образцов: 1. Створки, обработанные 0,625% раствором ГА; 2. Створки, обработанные 5% раствором ДЭЗ; 3. Створки, обработанные 5% раствором ВК-1; 4. Створки, обработанные 5% раствором ВК-2; 5. Створки, обработанные 5% раствором ДЭЗ + хлоргексидин + дээ; 6. Створки, обработанные 5% раствором ВК-1 + хлоргексидин+ ВК-1 7. Створки, обработанные 5% раствором ВК-2 + хлоргексидин+ ВК-2 Исследовано 140 образцов - по 20 образцов каждой группы.
Модификацию биоматериала хлоргексидином производили путем инкубации при 37С (1 серия) и -при комнатной (22-24С) (2 серия) температурах в 1% водном растворе. Динамику процессов сорбции изучали в следующих временных интервалах: 4, 8, 16 и 24 часа. Десорбционные процессы были исследованы во временных интервалах 4, 8, 24 и 48 часов в образцах, сорбировавших хлоргексидин в течение 4ч. В качестве десорбционной среды использовали дистиллированную воду.
На основании полученных результатов выстраивали кривые сорбции и десорбции хлоргексидина. При построении кривой сорбции по оси абсцисс отмечали продолжительность сорбции, по оси ординат - количество сорбированного препарата (Ксор6), мкг препарата/мг сухой ткани.
При построении кривой десорбции по оси ординат отмечали количество связанного препарата Ксвяз.= Ксорб - Кдесорб (мкг препарата/мг сухой ткани) Всего в данной серии экспериментов было исследовано 6580 образцов. В стерильные чашки Петри разливали агар (2% агар на переваре Хоттингера, содержащий 0,11-0,13% аминного азота). На поверхность застывшего и слегка подсушенного агара наливали 1 мл суспензии суточной культуры. Бактериальную взвесь равномерно распределяли по поверхности агара, а избыток удаляли пастеровской пипеткой.
Из биоматериала специальным ножом вырезали диски диаметром 5 мм. Диски отмывали от несвязанного препарата или консерванта стерильным 0,9% раствором натрия хлорида в течение 1 часа. Затем их раскладывали на подготовленные чашки Петри - по 5-6 дисков на каждую чашку на расстоянии 25 мм от центра чашки. Чашки выдерживали при температуре 37С в течение 16-18 часов, после чего учитывали зоны задержки роста культуры вокруг дисков, включая диаметр самого диска.
Методом дисков исследовали зоны подавления роста следующих культур: St.aureus, St.epidermldis haemoliticus, Ps.aeruginosa, E.coll, Streptococcus faecalis, Moraxella, Enterobacter и Citro-bacter. В данном исследовании использовали госпитальные штаммы микроорганизмов.
Изучение возможности антибактериальной модификации биоматериала различными антибактериальными препаратами. Выбор антибактериального агента
На первом этапе работы для оценки возможности антибактериальной модификации биологического материала были избраны препараты, относящиеся к различным фармакологическим классам. Так, хлор-гексидин является дезинфектантом, диоксидин - антибактериальным агентом широкого спектра действия, относящимся к классу хинокса-линов (рис.2); а лизоцим - ферментативным антибактериальным препаратом.
Методом дисков было установлено, что образцы биоматериала, как контрольные (необработанные), так и обработанные диоксидином (рН 5,54), не проявляют антибактериальной активности в отношении изученного спектра культур, зоны подавления роста отсутствуют.
Первоначально предположили, что при неизмененном рН раствора диоксидина (собственная рН 5,54), ковалентной иммобилизации препарата не происходит. Поэтому следующим этапом работы явилось исследование антибактериальных свойств биоматериала, обработанного диоксидином при различных значениях рН. Были изучены режимы обработки при рН 2,52; 8,53 и 10,94. Смещения уровня рН.в кислую и щелочную стороны достигали путем добавления 0,1 н НС1 и 0,1 н NaOH, соответственно.
Однако при бактериологическом исследовании было доказано, что данное мероприятие неэффективно: зоны лизиса культур по-прежнему отсутствовали.
При выборе диоксидина в качестве потенциального антибактериального агента исходили из того, что он может связываться со свободными эпоксидными группами в биоматериале за счет -ОН-групп [201, 202]. Можно предполагать, что отсутствие эффекта связано с потерей диоксидином своей антибактериальной активности в иммобилизованном состоянии. Однако наиболее вероятно, что -ОН-группы диоксидина не способны вступить в реакцию с эпоксидными группами (для данной реакции необходимы жесткие условия), и антибактериальный агент не может быть иммобилизован на ткань без использования какой-либо подложки или предварительной химической модифика - 48 Рис.3. Аминокислотная последовательность молекулы лизоцимации. В любом случае, на данном этапе работы изучение возможности антибактериальной модификации биоматериала диоксидином было прекращено в связи с неперспективностью использованного подхода.
На следующем этапе были изучены антибактериальные возможности иммобилизованного лизоцима. Лизоцим (мурамидаза) - фермент белковой природы, имеющий глобулярную структуру (рис.3), состоящий из одной полипептидной цепи. Относительная молекулярная масса 14307 Да. Считается, что лизоцим оказывает бактериолитическое действие, -подавляя рост, в основном, грамположительных микробов; менее чувствительны к нему грамотрицательные микроорганизмы [12].
Необходимо отметить, что полученные в данном исследовании результаты демонстрировали большую антибактериальную активность лизоцима в отношении грам-отрицательной микрофлоры, что не согласуется с данными литературы.
При использовании 1% раствора лизоцима были отмечены зоны неполного подавления, визуально проявляющиеся в виде зон "мутного" просветления на фоне сплошного роста культуры (табл.2). Это происходит, по-видимому, за счет ингибирования роста части колоний, в то время, как другая часть способна продолжать рост.
Полное растворение лизоцима наступает при приготовлении рабочих растворов 0,5% и 1% концентраций. При увеличении концентрации раствора до 2 и 5% не удается добиться полного растворения препарата (раствор непрозрачен, содержит хлопьевидные образования, демонстрирует выраженное пенообразование).
При исследовании зависимости диаметра зоны подавления роста микроорганизмов от концентрации исходного раствора лизоцима была установлена следующая закономерность. С увеличением концентрации от 0,5% до 5% зоны подавления роста St.aureus возрастали от 12 до 15,5 мм, Ps.aeruginosa от 15 до 23 мм, соответственно. Тем не менее, зоны подавления роста также имели вид "мутного" просветления, полного лизиса не было отмечено ни в одном случае.
Увеличение диаметров зон подавления роста микроорганизмов при использовании более высоких концентраций лизоцима может быть объяснен либо постепенным "вымыванием" химически несвязанного препарата, находящегося во внутренних слоях биоматериала, либо увеличением количества иммобилизованного препарата и пропорциональным возрастанием антибактериальной активности.
Наиболее выраженный антибактериальный эффект был получен при обработке биологического материала хлоргексидином (табл.2). В этих сериях были отмечены прозрачные, чистые зоны лизиса культур, дающие основание считать, что подавление роста произошло полностью по всему диаметру зоны.
Поэтому для дальнейших исследований, посвященных антибактериальной модификации, был избран хлоргексидин. Основной задачей явилось установление зависимости диаметра зон подавления роста культур от концентрации раствора ХГ, использованного для иммобилизации. Концентрация варьировала в диапазоне от 1% до 20%.
Была установлена зависимость размера зон лизиса от концентрации рабочего раствора хлоргексидина (табл.3). Так, зоны подавления роста St.aureus образцами, обработанными растворами с концентрацией 0,5%, 1% и 2%, достоверно между собой не различались. Достоверные (р 0,05) различия отмечали при использовании более высоких концентраций ХГ - от 5% до 20%.
В то же время было отмечено, что при концентрации 5% и более происходит потеря естественной консистенции створок, они становятся набухшими, ригидными, изменяется их естественный цвет. Поэтому для дальнейших исследований избрали 1% раствор хлоргексидина.
Следующим этапом явилось изучение влияния некоторых технологических режимов обработки (длительность инкубации и отмывки, рН сорбционной среды) на подавление роста микроорганизмов. Были выбраны следующие значения рН: 4,5; 6,5 (собственный рН препарата) и 8,5. Изменения рН сорбционной среды до 4,5 и 8,5 достигали путем добавления 0,1 н НС1 или 0,1 н NaOH, соответственно. Длительность сорбции составила 4 ч, длительность десорбции в воду - 4, 8 и 12 часов. Антибактериальную модификацию выполняли после базовой консервации образцов ДЭЗ, ВК-1 и ВК-2.
Изучение процессов десорбции хлоргексидина из створок биопротезов клапанов сердца
Изучая процессы десорбции, можно констатировать, что несвязанный хлоргексидин максимально (80-100 мкг/мг) десорбируется из биологической ткани в течение первых 4 ч. В дальнейшем кривые десорбции практически "выходят на плато", так как последующие временные интервалы характеризуются недостоверным изменением количеством связанного тканью препарата (рис.8-Ю). Скорость процесса десорбции не зависит от температуры. Это характерно для всех видов образцов.
Таким образом количество препарата, прочно фиксированного биоматериалом, непосредственно зависит от количественных параметров сорбции, связанных с ее температурным режимом. Оно оказалось достоверно (р 0,01) большим во всех группах эпоксиобработанных образцов, модифицируемых при 22-24С.
По-видимому, оказалась некорректной исходная теоретическая предпосылка о возможности связывания биоматериалом, консервированным ВК-1 и ВК-2, большего количества хлоргексидина. Очевидно, что количество последнего, прочно фиксированное тканью, практически эквивалентно для образцов, консервированных ДЭЭ и ВК-2, а для ВК-1-консервированных образцов существенно ниже.
Учитывая полученные ранее данные о более активном связывании гепарина ВК-1- и ВК-2-консервированными створками биопротезов [33, 46], предположили, что механизм фиксации хлоргексидина не связан с ковалентной иммобилизацией за счет свободных эпоксидных групп. Наиболее вероятный механизм - образование ионной связи между карбоксильными группами коллагеновой матрицы и иминными (аминными) группами ХГ. При этом глюконовая кислота выделяется из хлоргексидина биглюконата в свободном виде (рис.11).
Данный механизм объясняет и температурные различия в количественном связывании препарата - при 37С усиливается гидролиз образовавшихся солей [3].
С целью -более подробного изучения механизма фиксации хлоргексидина на ткани были выполнены дополнительные эксперименты по изучению процессов сорбции и десорбции ХГ нативным и глутаральде-гид-обработанным материалом (рис.12, 13).
По количеству прочно фиксированного на ткани препарата (определяемого по 48 ч десорбции) данные образцы можно выстроить в ряду: нативные ГА ДЭЗ ВК-2 ВК-1
Таким образом, максимальное количество иммобилизованного ХГ демонстрируют нативные образцы, что служит дополнительным подтверждением ионного механизма иммобилизации,
Следующей задачей явилось определение молярного соотношения "прочно фиксированный ХГ" : "карбоксильные группы коллагена". Оно не должно превышать 1 (или 100%) - в этом случае ионное связывание окажется эквимолярным, т.е. одна из двух молекул глюконовой кислоты заместится на карбоксил коллагеновой матрицы.
Температурные различия данного показателя отсутствуют для нативных образцов, составляют 17% для ГА-образцов, 20% - для ДЭЭ-образцов, и 50% - для створок, консервированных эпоксидными смесями. Эти различия, очевидно, также связаны со структурными .различиями ткани, приобретаемыми в процессе консервации различными сшивающими агентами.
Учитывая, что в производстве биопротезов клапанов сердца в настоящее время используется в качестве базового консерванта лишь диглицидиловый эфир этиленгликоля, была проведена дополнительная серия экспериментов с целью установления технологических режимов обработки биопротезов антибактериальным агентом.
Для этого на каждой точке сорбции (4, 8, 16 и 24 ч) отбирали по 30 образцов для изучения процессов десорбции - по 10 на каждую временную точку (4, 8 и 24 ч). Результаты представлены на рис.14-19.
Было установлено, что при 22-24С количество сорбированного хлоргексидина достоверно (р 0,05) выше к 8-му и 16-му часам, по сравнению с 4-м и 24-м часами (рис.14).
На основании полученных результатов установили продолжительность сорбции для разрабатываемой технологии .антибактериальной модификации - 4 ч. Несмотря на то, что в последующие 20 ч ткань может связать дополнительно от 4 до 44% хлоргексидина, меньшая продолжительность процесса облегчает его выполнение и контроль параметров в условиях серийного производства.
Все различия по количеству связанного препарата между 4 и 24-м часами десорбции были недостоверными (р 0,05) (рис.15-18). К 4 ч десорбции количество связанного хлоргексидина не различалось достоверно между сериями образцов, сорбировавших препарат в течение различного времени (р 0,05) (рис.19).
