Введение к работе
Актуальность проблемы.
«Трансплантация органов, одно из чудес двадцатого века, продолжает спасать и улучшать жизни сотен тысяч пациентов по всему миру», - так справедливо записано в итоговом документе Стамбульского саммита (2008), посвященного проблемам трансплантологии.
Результаты аллотрансплантации трупной почки (АТТП) с каждым годом улучшаются, что закономерно обусловлено интенсивным развитием трансплантационной иммунологии, разработкой эффективных методов иммунодепрессии, совершенствованием хирургической техники, диагностики и лечения возникающих осложнений.
Вместе с тем на современном этапе развития трансплантологии, очевидно, что почечный аллотрансплантат (ПАТ), к сожалению, в разные сроки после операции утрачивает свою функцию. При этом различные по патогенезу осложнения и изменения в трансплантированной почке клинически могут проявляться однотипно, как правило, снижением или прекращением ее функции.
Своевременная и точная диагностика изменений, развивающихся в почечном аллотрансплантате и обусловливающих нарушение его функции, занимает важнейшее место в клинической трансплантологии, определяет лечебную тактику и прогноз (Ватазин А.В. и соавт., 2000; Шумаков В.И. и соавт., 1998; Abele R. И соавт., 1992; Thorogood F.J. и соавт., 1999). Однако большинство определяемых клинических, инструментальных и лабораторных признаков не являются строго специфичными для верификации причин почечной дисфункции, включая острое отторжение ПАТ, острый канальцевый некроз, инфекционные, хирургические и урологические осложнения, токсичность ингибиторов кальциневрина, других лекарственных средств и т.д. (Арзуманов СВ. и соавт., 2005; Сандриков В.А., Садовников В.И., 2001; Шумаков В.И. и соавт., 2006; Dalton R.S. et al., 2005; Danovitch G.M., 2001; Tinckam K.J. et al., 2004).
Общепризнанно, что морфологические методы исследования являются наиболее достоверными в дифференциальной диагностике не только патологических, но и функциональных процессов, протекающих в пересаженной почке. В то же время целый ряд морфологических изменений не всегда являются строго специфичными для того или иного вида осложнений. Это имеет особое значение при комбинированных поражениях пересаженного органа, например, при ишемическом повреждении и острой реакции отторжения, или ишемическом и нефротоксическом повреждении ПАТ циклоспорином А, такролимусом и др.
В этой связи особое значение принадлежит совершенствованию методов морфологического исследования иммунокомпетентных клеток реципиента и оптимизации мониторинга иммунного статуса. К интенсивно разрабатываемым способам диагностики относятся клеточные анализаторы на основе новейших оптических компьютерных лазерных систем (Автандилов Г.Г., 2008; Тычинский В.П., 2007; Popescu G. et al., 2008; Rappaz В. et al., 2005).
В 1995 году Василенко И.А. и соавт. для витальной оценки морфофункционального состояния клеток периферической крови, в том числе и иммунокомпетентных клеток, предложили использовать метод компьютерной лазерной фазовой морфометрии (КФМ). Первые результаты применения КФМ для оценки иммунного статуса реципиентов почечного трансплантата оказались весьма обнадеживающими (Ватазин А.В. с соавт., 2006; Метелин В.Б. с соавт., 2004, 2007). Вместе с тем предварительные исследования показали, что необходимость определения целого комплекса размерных показателей лимфоцитов, проведения многоуровневого математического анализа и сложность интерпретации полученных данных в определенной степени ограничивают возможности метода, тем более для экспресс-диагностики ранней дисфункции почечного трансплантата.
В этой связи разработка новых методических подходов к анализу морфофункционального состояния иммунокомпетентных клеток на основе витальной компьютерной фазометрии непосредственно ядерных структур лимфоцитов может иметь не только научное значение для детального исследования патогенетических звеньев реакции отторжения трансплантированного органа, но и весьма важный практический результат для оперативной оценки иммунореактивности и прогнозирования состояния реципиента, а также построения индивидуализированных лечебно-реабилитационных программ, сравнения эффективности различных видов терапии, своевременного выявления осложнений, побочных и/или неблагоприятных эффектов лечения.
Все сказанное касается раннего посттрансплантационного периода. Вместе с тем, несмотря на значительный прогресс клинической трансплантологии, 5-летняя выживаемость трансплантированной почки составляет лишь около 70%, а 10-летняя - 52% (Столяревич Е.С. с соавт., 2001; Томилина Н.А. с соавт., 2003).
По общему признанию, среди причин, ограничивающих срок жизни ПАТ, главную роль играет хроническая трансплантационная нефропатия (ХТН).
В качестве возможных факторов, приводящих к ХТН, специалисты рассматривают возраст и пол реципиента; характер начальной функции трансплантата и ранние кризы отторжения; уровень креатинина плазмы на момент биопсии; выраженность артериальной гипертонии, протеинурии и гематурии; а из морфологических проявлений - выраженность тубуло-интерстициального склероза, присутствие хронической трансплантационной гломерулопатии и гломерулосклероза, васкулопатии и наличие морфологических признаков отторжения (Багдасарян А.Р. с соавт., 2003; Балакирев Э.М. с соавт., 2003; Мойсюк Я.Г. с соавт., 2003; de B.Edwardes M.D. et al., 2004; Fine L.G. et al., 2000; Nankivell B.J. et al., 2001). Значимость ряда из них уже достоверно определена в многочисленных исследованиях (Столяревич Е.С. с соавт., 2001, 2003; Шумаков В.И. с соавт., 2000; Elster Е. et al., 2004). Роль других, особенно в эру современной иммуносупрессии, продолжает обсуждаться и пересматриваться. При этом одной из главных
причин нарушения функции и потери почечного аллотрансплантата многие авторы считают процесс отторжения пересаженного органа (Ким И.Г., 1999; Томилина Н.А. с соавт., 2003; Kreis N.A., Ponticelli С, 2001; Mauiyyedi S. et al., 2001; Paul L.C., 2001).
Наиболее ярким доказательством влияния иммунных факторов на развитие ХТН являются данные, демонстрирующие связь между острым и хроническим отторжением (Cosio F.G. et al., 1997; Baeten D. et al., 2004). Некоторые авторы в рамках ХТН даже выделяют самостоятельную нозологическую форму, имея ввиду исключительно антигензависимый процесс, морфологическим проявлением которого является фибропролиферативный васкулит и хроническая трансплантационная гломерулопатия (Kreis N.A., Ponticelli С, 2001; Mautyyedi S. et al., 2001).
He вызывает сомнения, что пункционная биопсия остается основным методом верификации ХТН. Однако, неспецифичность морфологических признаков в классификации Banff, а также выраженная полиморфность клинической картины и особенностей течения ХТН диктуют необходимость разработки и клинического применения новых оригинальных методов, включая изучение функциональной активности иммунокомпетентных клеток.
В связи со сказанным, исследование динамики морфометрических характеристик иммунокомпетентных клеток методом витальной КФМ на различных этапах посттрансплантационного периода позволит, на:наш взгляд, в определенной мере конкретизировать некоторые механизмы действия иммунных факторов в патогенезе острого и хронического отторжения ПАТ, изучить их взаимосвязь с неспецифическими причинами и морфологическими проявлениями дисфункции пересаженной почки, что и явилось основанием для выполнения настоящего исследования.
Цель исследования.
Разработать и внедрить в клиническую практику экспресс-метод витальной компьютерной фазовой морфометрии клеток крови, включая денситометрию ядерного хроматина, для дифференциальной доклинической диагностики дисфункций почечного аллотрансплантата в раннем и в отдаленном посттрансплантационном периоде.
Задачи исследования.
Для реализации цели исследования были поставлены следующие задачи:
1. изучить особенности морфофункционального состояния клеток крови (лимфоцитов, нейтрофилов, эритроцитов, тромбоцитов) и динамики их изменений в процессе проведения заместительной почечной терапии и в раннем посттрансплантационном периоде на этапе индукции иммуносупрессии;
2. разработать прогностически значимый критерий (индекс функциональной активности лимфоцитов) доклинической диагностики острой реакции отторжения почечного аллотрансплантата.
3. определить возможности фазовой морфометрии в оценке
функциональной активности иммунокомпетентных клеток для
дифференциальной диагностики дисфункций почечного трансплантата
иммунного и неиммунного характера в раннем послеоперационном периоде;
-
провести сравнительный анализ структуры хроматина интерфазных ядер лимфоцитов практически здоровых добровольцев, денситометрических параметров ядер лимфоцитов при их активации in vitro, а также in vivo у пациентов в раннем посттрансплантационном периоде;
-
изучить изменения функциональной активности лимфоцитов на основе денситометрических показателей морфофункционального состояния их ядерных структур после проведения противокризовой терапии для оценки эффективности программ иммуносупрессии;
6. провести сравнительный анализ данных компьютерной морфометрии
лимфоцитов, клинико-лабораторных исследований и результатов
пункционной биопсии при хронической трансплантационной нефропатии;
7. определить степень информативности данных компьютерной
морфометрии лимфоцитов в диагностике хронического отторжения
трансплантата.
Научная новизна.
Работа открывает новое научное направление в трансплантологии, позволяющее на основе витальной компьютерной фазовой морфометрии иммунокомпетентных клеток, включая денситометрию ядерного хроматина лимфоцитов, оценить их функциональную активность, прогнозировать развитие криза отторжения на доклинической стадии, дифференцировать причины дисфункции почечного аллотрансплантата иммунного и неиммунного характера, оценить эффективность противокризовой терапии.
Впервые изучены особенности морфофункционального состояния живых клеток крови (лимфоцитов, нейтрофилов, эритроцитов, тромбоцитов) и динамика их изменений в процессе проведения заместительной почечной терапии и в раннем посттрансплантационном периоде на этапе индукции иммуносупрессии. Это позволило создать базу данных для разработки прогностически значимого критерия функциональной активности лимфоцитов - индекса активности клеток (ИАК) (Патент РФ на изобретение «Способ диагностики отторжения почечного аллотрансплантата» № 2348932, 2009) для доклинической диагностики острой реакции отторжения почечного аллотрансплантата.
Впервые определены морфометрические изменения
иммунокомпетентных клеток в раннем послеоперационном периоде при развитии дисфункции почечного аллотрансплантата иммунного и неиммунного характера, что позволило своевременно начать патогенетически детерминированное лечение.
В экспериментах in vitro изучены денситометрические параметры ядер лимфоцитов периферической крови при переходе клеток от состояния покоя к активной пролиферации. Определены качественные и количественные
показатели функционального состояния клеточных ядер, являющихся маркерами метаболической и пролиферативной активности лимфоцитов.
Впервые методом компьютерной фазовой морфометрии выявлена
функциональная гетерогенность ядер циркулирующих лимфоцитов до и
после аллотрансплантации почки в раннем посттрансплантационном
периоде. Для оценки морфофункционального состояния
иммунокомпетентных клеток на основе витальных денситометрических параметров предложен показатель функциональной активности ядер лимфоцитов.
Впервые изучены особенности ядерного полиморфизма циркулирующих Т- и В-лимфоцитов у больных с признаками острой реакции отторжении почечного аллотрансплантата до и после проведения противокризовой терапии.
На основе результатов проспективного и ретроспективного анализа установлены и количественно оценены особенности изменений клеточного звена иммунитета при хронической трансплантационной нефропатии. Практическая значимость.
Внедрение когерентной фазово-интерференционной микроскопии и компьютерной морфоцитометрии, включая денситометрию ядерного хроматина лимфоцитов, в клиническую практику позволило оценить функциональную активность иммунокомпетентных клеток, прогнозировать развитие криза отторжения на доклинической стадии, дифференцировать причины дисфункции почечного аллотрансплантата иммунного и неиммунного характера, своевременно начать патогенетически детерминированную терапию и оценить эффективность противокризовой терапии.
Полученные данные о динамике морфофункционального статуса клеток крови у больных с хронической почечной недостаточностью в терминальной стадии (ТХПН) представляются важными не только для теоретической, но и для практической медицины, в том числе клинико-лабораторной диагностики, поскольку позволяют объективизировать оценку состояния различных систем организма на этапе предтрансплантационного ведения пациентов, как в соответствии с общими принципами реконвалесценции, так и их индивидуальными особенностями.
Изучение морфометрических изменений иммунокомпетентных клеток в раннем послеоперационном периоде при развитии дисфункции почечного аллотрансплантата иммунного и неиммунного характера позволило своевременно начать патогенетически детерминированное лечение и предупредить развитие тяжелых поражений трансплантата вплоть до его потери.
Использование разработанного индекса активности клеток для субпопуляций лимфоцитов позволило на доклинической стадии распознавать начало острой реакции отторжения, и тем самым, уменьшить частоту потерь пересаженных органов в раннем послеоперационном периоде, а также улучшить отдаленные результаты трансплантации.
Разработанные дифференциально-диагностические цитологические критерии реактивных изменений ядер лимфоцитов на основе исследования морфоденситометрических характеристик хроматина и особенностей ядрышково-ядерного соотношения расширили возможности витальной компьютерной морфометрии в оценке функционального состояния ядер лимфоцитов. Предложенный показатель ядерной активности лимфоцитов (FA) является ранним и объективным маркером их пролиферативного потенциала.
Проведение мониторинга денситометрических показателей ядер циркулирующих лимфоцитов обеспечивает своевременное выявление изменений иммунореактивности реципиентов с пересаженной почкой в раннем послеоперационном периоде, что в свою очередь позволяет проводить уточняющую экспресс-диагностику острой реакции отторжения почечного аллотрансплантата, прогнозировать результаты лечения, оценивать эффективность противокризовой терапии и, таким образом, улучшить результаты трансплантации.
Показано значение метода компьютерной морфометрии в комплексном обследовании реципиентов при выявлении признаков поздней дисфункции почечного аллотрансплантата.
Практическое применение полученных сведений позволило разработать и предложить рациональные подходы к профилактике, ранней диагностике и лечению хронической трансплантационной нефропатии с целью снижения темпов ее прогрессирования и улучшить, таким образом, отдаленные результаты трансплантации почки.
В целом, результаты проведенных исследований способствуют оптимизации тактики ведения больных после аллотрансплантации трупной почки (АТТП) в раннем и позднем посттрансплантационном периоде. Внедрение результатов в практику.
Полученные результаты внедрены в практическую деятельность отделения хронического гемодиализа с пересадкой почки ГУ МОНИКИ им. М.Ф.Владимирского. Материалы исследования и результаты используются в преподавании на кафедре эфферентной медицины, клинической и оперативной нефологии ФУВ МОНИКИ.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 29 печатных работ, среди которых 9 работ опубликовано в журналах, рекомендуемых ВАК, получен 1 патент на изобретение.
Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на: III Российском конгрессе по патофизиологии с международным участием «Дизрегуляционная патология органов и систем», Москва, 2004; 6-й Российской конференции «Современные проблемы антимикробной химиотерапии» и 11-й научной конференции Европейского общества химиотерапии инфекционных заболеваний, Москва, 2004; VI съезде научного общества нефрологов. Москва, 2005; V Конгрессе РААКИ, Москва, 2007; Научно-практической конфереции Центрального Федерального округа РФ
«Актуальные вопросы гемафереза, хирургической гемокоррекции и диализа», Москва, 2009; II Московской региональной научно-практической конференции (с международным участием) «Цитоморфометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты», Москва, 2009; совместной научно-практической конференции отделения хронического гемодиализа с пересадкой почки, отделения хирургической гемокоррекции и детоксикации и кафедры Эфферентной медицины, клинической и оперативной нефрологии, Москва, 2009.
Объем и структура диссертации.
