Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. История; распространение и значение нута 8^
1.1.1. Нут - общая характеристика 8
1.1.2. Пищевая ценность семян нута 12
1.2. Белковые вещества семян бобовых культур 16
1.3. Протеолитические ферменты 24
1.3.1. Классификация и общая характеристика протеолитических ферментов 26
1.3.2. Протеолитические ферменты семян растений 1 29
1.3.3. Протеолитические ферменты семян бобовых культур 35
1.4. Белковые ингибиторы протеолитических ферментов, их роль в регуляции активности протеаз 43
1.4.1. Белковые ингибиторы пищеварительных протеаз в семенах нута различных сортов 45
2. Экспериментальная часть 48
2.1. Материалы и методы исследований 48
2.1.1. Характеристика объекта исследования и методы исследования физических и химических показателей качества семян нута 48
2.1.2. Проращивание семяннута 50
2.1.3. Определение водорастворимого белка по методу Лоури 5 Г
2.1.4. Определение фракционного состава белков 52
2.1.5. Определение активности протеаз по методу Ансона 53
2.1.6. Определение ингибирующей активности белковых ингибиторов протеаз 54
2.1.7. Определение амилозы и амилопектина 55
2.1.8. Фракционирование белков методом гель-хроматографии 56
2.1.9. Методы оценки свойств сырья для приготовления хлеба 59
2.1.10. Методы приготовления теста и хлеба. Бальная оценка качества хлеба 59
2.2. Характеристика белкового комплекса семян нута 61
2.2.1. Фракционирование белков семян нута по растворимости 62
2.2.2. Фракционирование белков семян нута методом гель- хроматографии на колонке с TSK - gel Тоуореагі HW - 55F 63
2.3. Характеристика протеолитических ферментов семян нута 68
2.3.1. Выбор условий извлечения протеаз семян нута 68
2.3.2. Определение оптимума рН протеаз семян нута 70
2.3.3. Выбор условий осаждения протеаз семян нута 71
2.3.4. Влияние температуры на активность протеаз семян нута 74
2.3.5. Влияние активаторов и ингибиторов на активность протеаз семян нута 75
2.4. Очистка протеаз семян нута и характеристика очищенных препаратов 79
2.4.1. Осаждение протеаз при подкислении 79'
2.4.2. Гель-хроматография протеаз на колонке с TSK - gel Тоуореагі HW- 55F 80
2.4.3. Схема выделения и очистки протеаз семян нута 84
2.4.4. Характеристика нейтральной протеазы нута 86
2.4.5. Характеристика щелочной^протеазы нута 87
2.5. Белковые ингибиторы протеаз из семян нута 88
2.5.1. Выделение белковых ингибиторов 88
2.5.2. Гель-хроматография протеаз на колонке с TSK - gel Тоуореагі HW-55F 89
2.5.3. Схема выделения белковых ингибиторов протеаз из семян нута 92
2.6. Действие протеолитических ферментов семян нута на белки нута и пшеницы 95
2.6.1. Действие протеолитических ферментов семян нута на белки нута 96
2.6.2. Действие протеолитических ферментов семян нута на белки пшеницы 100
2.7. Изменение активности протеолитических ферментов и их белковых ингибиторов при прорастании семян нута 102
2.8. Влияние нутовой муки на качество хлеба 107
Выводы 113
Литература 115
- Пищевая ценность семян нута
- Протеолитические ферменты семян бобовых культур
- Характеристика объекта исследования и методы исследования физических и химических показателей качества семян нута
- Влияние температуры на активность протеаз семян нута
Введение к работе
Нут {Cicer arietinum) - ценнейшая бобовая культура, известная с древнейших времен. Она широко используется в питании населения различных стран, особенно, странах Азии, в том числе и странах Среднеазиатского региона. Пищевая ценность семян нута обусловлена благоприятным сочетанием в семенах белков, жиров и углеводов, макро- и микроэлементов, витаминов и других биологически активных веществ. Зерно в зрелом виде содержит 18-31% белка, 6% жира, 46 - 48% крахмала, 84 -86% сухих веществ, 19,9% азотистых веществ, 3,8% золы.
В настоящее время рост производства зернобобовых культур в сочетании с улучшением их биохимических показателей и технологических достоинств - одна из. сложных и ответственных задач растениеводства. Изучение сложных физиологических процессов, протекающих в семени на разных этапах его развития позволят найти подходы к направленному формированию биохимических показателей качества семян. Одним из таких важнейших процессов, протекающих в семени является протеолиз запасных белков при прорастании. В нем могут принимать участие как ферменты, содержащиеся в созревших семенах, так и ферменты, синтезирующиеся de novo при прорастании.
Семена нута богаты белком, однако их протеолитические ферменты практически не изучены. В семенах нута показано наличие белковых
ингибиторов протеаз, но все они являются ингибиторами экзогенных
протеолитических ферментов. Вопрос о взаимодействии белковых ингибиторов протеаз семян нута с собственными протеолитическим ферментами, а, следовательно, и об их роли в регуляции процесса протеолиза запасных белков при прорастании семян нута остается открытым.
Цель и задачи исследования
Целью работы является изучение белкового и протеолитического
комплекса семян нута, выращенного в Таджикистане, а также выяснение
возможных механизмов регуляции их активности в покое и при прорастании.
В соответствии с целью исследования были поставлены следующие
задачи:
охарактеризовать белковый комплекс семян нута сортов «Таджикский» и «Джалалабадский», выращенных в условиях Таджикистана;
- выделить и охарактеризовать нейтральные и щелочные протеазы
семян нута;
изучить взаимодействие протеолитических ферментов семян нута с белковыми ингибиторами протеаз;
исследовать изменение активности протеаз семян нута и их белковых ингибиторов при прорастании.
Научная новизна
Впервые показано наличие в созревших семенах нута протеолитических ферментов разного типа, действующих в нейтральной и щелочной областях рН. Проведена очистка нейтральной протеазы с оптимумом рН действия 7,0, показано, что она является ферментом тиолового типа. Выделен и охарактеризован ранее не описанный в литературе фермент с оптимумом рН действия 10,0. Показано, что щелочная протеаза относится к ферментам серинового типа.
Установлено, что нейтральная и щелочная протеазы семян нута активно гидролизуют запасные белки покоящихся семян.
Впервые показано, что белковые ингибиторы в семенах нута взаимодействуют с эндогенными протеолитическими ферментами и участвуют в регуляции их активности в покоящихся и прорастающих семенах.
Практическая значимость работы
Семена нута имеют многоцелевое использование, и в разных технологических операциях состояние белково-протеиназного комплекса играет весьма существенную роль. Так, нутовая мука используется в хлебопечении и при производстве кондитерских изделий, как компонент, повышающий пищевую ценность и вкусовые качества готового продукта. Выявлена способность нейтральных протеаз семян нута гидролизовать белки пшеницы, что позволит наметить подходы к управлению процессом протеолиза в условиях тестоведения.
Разработана схема выделения нейтральных и щелочных протеаз и их белковых ингибиторов из семян нута. Получены препараты нейтральной и щелочной протеаз со степенью очистки 1132 и 547 раз соответственно.
Полученные данные могут быть использованы в селекции нута для получения семян с заданными особенностями белково-протеиназного комплекса.
Показана возможность замены пшеничной муки на нутовую в количестве 10% при выпечке хлеба, при этом происходит увеличение удельного объема формового хлеба, улучшается окраска и структура корок, сохраняются другие органолептические показатели качества.
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на III Юбилейной международной выставке-конференции «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» (Москва, 2005); V Ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ РАН - ВУЗы «Биохимическая физика» (Москва, 2005); IV Международной конференции-выставке «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» (Москва, 2006).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы.
Пищевая ценность семян нута
Нут является ценным пищевым продуктом. Это обусловлено благоприятным сочетанием в семенах белков, жиров и углеводов, макро- и микроэлементов, витаминов и других биологически активных веществ. Зерно в зрелом виде содержит 18-31% белка, 6% жира, 46 - 48% крахмала, 84 86% сухих веществ, 19,9% азотистых веществ, 3,8% золы. По питательной ценности он не уступает гороху, чечевице, а по содержанию жира даже превосходит зернобобовые культуры (кроме сои); по содержанию крахмала стоит на третьем месте среди зернобобовых культур (6, 13, 18, 33, 42, 62, 66, 89, 134).
С учетом широкого набора полезных веществ и высокой пищевой ценности его повсеместно используют в пищу в тех странах, где он наиболее распространен - в Индии, Пакистане, Узбекистане, Турции, Испании и др. В Индии роль нута особенно велика: он служит основным источником белка, так как жители этой страны в силу религиозных обычаев не употребляют мясо. Семена нута используют в приготовлении множества различных- блюд, обычно в вареном виде, реже в жареном — как лакомство. Нут широко используется в пищу народами Средней Азии и Закавказья, где из него готовят национальные блюда - супы, салаты, каши, гарниры, пирожки, добавляют в плов и др. Из жареных дробленых семян нута изготавливают брикеты с томатом и сладкие брикеты в смеси с сушеным виноградом, кунжутными семенами или грецким орехом. В России нут пока не нашел широкого применения в качестве продукта питания, однако доказана возможность его использования при изготовлении кондитерских, хлебобулочных и колбасных изделий (1, 3, 4, 6, 20).
В Волгоградском НИТИ мясо-молочного скотоводства и переработки продукции животноводства (НИТИ ММС и ППЖ) были проведены исследования с целью использования семян нута при создании продуктов лечебно-профилактического назначения. Разработана и утверждена научно-техническая документация, получены заключения Института питания РАМН и гигиеническое заключение Министерства здравоохранения РФ на нутовуго муку как пищевую добавку (6, 20). В Волгоградском НИТИ ММС и ППЖ разработано и внедрено на мясоперерабатывающих предприятиях более 20 наименований мясных изделий с использованием нутовой муки, в том числе полукопченые и вареные колбасы, паштеты, полуфабрикаты, пельмени. Биологическая ценность колбасных изделий с нутом, была на 19 - 20% выше, чем у традиционных изделий. Кроме этого, была разработана и утверждена нормативно-техническая документация на мясной продукт, в котором в качестве рецептурного ингредиента использовались пророщенные семена нута. При прорастании семян активируются ферменты и другие биологически активные вещества, происходит распад запасных веществ нута, а также синтез новых белков, активируется действие фитогормонов, повышается содержание токоферолов, каротиноидов, фосфолипидов, эссенциальных жирных кислот и т.п. Так, содержание белка в проросших семенах увеличивается в 1,7 раза, витаминов группы В - в 3 раза. Содержание эссенциальных жирных кислот достигает 80% от их общего количества (3, 4, 6).
Прибавление нутовой муки (в количестве 10 - 20%) к пшеничной,муке при выпечке хлеба и изготовлении кондитерских и макаронных изделий повышает питательную ценность и вкусовые свойства этих продуктов. Из муки нута в чистом виде или в смеси с молочным порошком готовят питательную кашу для детей (18). Семена нута могут быть использованы для производства «нутового молока». Технология предусматривает тепловую обработку ненабухших семян нута в водном растворе бикарбоната натрия при температуре кипения. Затем осуществляют измельчение набухших семян и проводят экстракцию белков и других растворимых компонентов в молочной сыворотке, содержащей моноглицериды. Полученное таким образом «нутовое молоко», может найти применение в качестве как самостоятельного продукта, так и для приготовления различных пищевых продуктов, тем- более, как показали проведенные исследования, «нутовое молоко», содержащее селен, обладает лечебно профилактическим действием, ингибирует эндогенный синтез- из нитритов и аминов N-нитрозосоединений (в частности, нитрозодиэтиламина - НДЭА), которые обладают выраженной канцерогенной активностью, и в целом улучшают систему антиоксидантной защиты организма человека (6).
Использование семян нута как источника кормового белка очень актуально и перспективно, тем более что общий недостаток кормового белка в рационах различных видов и групп животных составляет от 20 "до 35%, а в ряде случаев даже превышает этот уровень. На корм чаще всего используют темноокрашенные семена (цельные — в варенном или запаренном виде; или дробленые семена, а также нутовую муку.). В рационе с другими кормами используют для крупного и мелкого рогатого скота (19), свиней, птицы (29).
Протеолитические ферменты семян бобовых культур
Интерес к изучению семян бобовых культур, связан, прежде всего, с той ролью, которую эти культуры играют в обеспечении продовольствием, при этом пищевая ценность зерна бобовых культур определяется высоким содержанием белка, отсюда и то внимание к обмену белков у бобовых, в котором немалую роль играют протеазы.
Особое внимание исследователей привлекают такие культуры как горох {Pisum sativatum), вика (Vicia sativa), фасоль {Phaseolus vulgaris), конские бобы {Vicia /aba), маш (Phaseolus sinensis), вигна (Vigna sativa), черный горох (Vigna sinensis), соя (Glycine max) и некоторые другие.
Исследование протеолитических ферментов семян бобовых культур во многих работах ограничивается обнаружением и фрагментарными наблюдениями за изменением протеолитической активности при прорастании. Имеется относительно небольшое число работ, в которых предпринимались попытки выделить и охарактеризовать отдельные протеазы. Так, изучение протеолитических ферментов чины показало, что процесс прорастания связан, прежде всего, с повышением автолитической активности при рН 7,6, которая, по мнению авторов, характеризует протеазы, расщепляющие собственные белки. Отсутствующая в семядолях покоящихся семян эта активность появляется при набухании и резко возрастает на 2-е сутки прорастания, сохраняясь в дальнейшем примерно на одном уровне (12).
Иная картина была получена при исследовании изменения активности эндопептидаз при-прорастании конских бобов. В течение первых, 3 суток формирования корешка активность ферментов, расщепляющих азоказеин при рН 5,0; 5,5; 6,0, повышалась, а затем снижалась до 8-х суток. В течение последующей стадии роста побега активность эндопептидазы с оптимумом рН 5,0 была преобладающей. Этот фермент активировался тиоловыми реагентами и ингибировался йодацетатом, йодуксусной кислотой и п-ХМБ. Исследователи проследили судьбу нескольких белков, в том числе и запасных, при прорастании конских бобов и показали различными методами, что в течение первых 3-х суток идет модификация легумина и вицилина (119, 120).
Широкие исследования, проведенные под руководством А.ДІ Шутова и И.А Вайтрауба в 70-80-е годы 20 века, с прорастающими семенами вики позволили выделить гомогенные или близкие к гомогенным препараты протеаз, действующие на природные и синтетические субстраты, а также определить их участие в катаболизме запасных белков (74, 75, 76, 77, 78, 79, 80,81). Таким образом, изучая процесс изменения активности протеаз при прорастании, некоторые авторы отмечали значительное повышение протеолитической активности (12, 22, 101), другие наоборот считают, что в процессе прорастания не наблюдается существенных изменений активности протеолитических ферментов (85). Причиной таких противоречий, является, по-видимому, то, что в большинстве случаев величина протеолитической активности не была пересчитана на единицу исходной массы семян или на одно семя. Необходимость этого была отмечена в работах, отечественных авторов (24, 26, 32).
Протеазы из покоящихся семян бобовых изучены мало. Вероятно, это связано, прежде всего, с тем, что активность протеолитических ферментов в покоящихся семенах мала (12, 24, 65, 119), и в таких семенах практически отсутствует обмен белков. Связанные с обнаружением протеолитических ферментов в покоящихся семенах бобовых культур неудачи, очевидно, связаны с присутствием в них мощных белковых ингибиторов эндогенных протеаз.
Несмотря на это, некоторым исследователям удалось показать наличие протеолитической активности в покоящихся семенах. Так, в семенах гороха показано наличие двух белокгидролизующих систем при рН 5,0 и 7,0 (119, 120). Было отмечено, что оптимум рН протеолитической активности зависит от природы используемого субстрата. При гидролизе казеина (денатурированного нагреванием) протеазы имели оптимум рН 5,0 - 5,5, при гидролизе белков семядолей - рН 5,0, гемоглобина - рН 4,5, сывороточного альбумина — рН 3,75 — 4,0. Авторы установили, что эти ферменты являются тиоловыми протеиназами, поскольку активируются /5-меркаптоэтанолом и ингибируются йодацетатом и хлоридом ртути.
Из покоящихся семян вигны были выделены протеазы с максимальной активностью по отношению к казеину при рН 6,0, к гемоглобину - при рН 3,0 (85). Из-обезжиренной соевой муки методом ионообменной хроматографии на DEAE-целлюлозе были выделены четыре различных протеазы.- Sb S2, S3, S4 с оптимумом действия при, рН 5,0 - 5,4 при использовании казеина в качестве субстрата. Каждая протеаза дала отдельный пик насефадексе G -200 с молекулярными массами 50000 (Si), 35000 (S2), 60000 (S3 H 200000 (S4). Протеазы были классифицированы авторами как кислые (карбоксильные), поскольку ингибитор пепсина подавлял их активность на 80 - 90% (141). Кроме протеаз, гидролизующих белок в кислой зоне рН, в некоторых бобовых культурах обнаружены протеазы, действующие в нейтральной и щелочной областях рН.
Характеристика объекта исследования и методы исследования физических и химических показателей качества семян нута
Исследование ингибиторов протеиназ растений проводилось и проводится в настоящее время в связи с изучением биологических механизмов регуляции активности протеолитических ферментов. Известны три способа регуляции активности протеолитических ферментов: - образование протеаз в форме зимогенов, - локализация ферментов внутри специальных образований, окруженных мембраной (вакуоли и белковые тела в растительных клетках), - присутствие в клетках и тканях специфических ингибиторов протеолитических ферментов (43).
Еще в 40-х годах 20 века из соевых бобов впервые были выделены в кристаллическом состоянии ингибиторы трипсина и химотрипсина, получившие названия - ингибитор Кунитца и ингибитор Баумана-Бирк.
Молекулярная масса ингибитора Кунитца 21500 Да. Молекула ингибитора состоит из 181 аминокислотного остатка и содержит две дисульфидные связи в положении цис(39)- цис(86) и цис(136)- цис(145). Трипсиносвязывающий реактивный центр включает остаток аргинина, связанный пептидной связью с остатком изолейцина: арг(63) - иле(64), поэтому ингибиторы этого семейства также называют трипсиновыми ингибиторами аргининового типа.
Ингибитор Баумана-Бирк был впервые выделен также в 1946 году из семян сои. Ингибитор эффективно подавляет активность трипсина и химотрипсина, причем с одной молекулой ингибитора могут связываться молекулы обоих ферментов. Ингибитор Баумана-Бирк — первый описанный "двухглавый" (или двухцентровой) ингибитор сериновых протеиназ. Его молекулярная масса примерно 8000 Да. Молекула ингибитора состоит из 71 аминокислотного остатка. Особенностью аминокислотного состава является высокое содержание остатков цистеина (7 на одну молекулу) и отсутствие остатков глицина и триптофана. Обращает на себя внимание, что молекула ингибитора Баумана-Бирк состоит из двух частей, сходных по структуре (доменов), которые соединены между собой короткими полипептидными цепочками. Реактивный центр, ответственный за связывание трипсина локализован в первом домене и содержит пептидную связь: лиз (16) — сер(17); а реактивный центр, ответственный за связывание химотрипсина находится во втором домене и содержит пептидную связь: лей(43) — сер(44), поэтому ингибиторы этого семейства иногда называют ингибиторами лизинового типа (43, 44, 46).
Впоследствии белковые ингибиторы трипсина и химотрипсина были выделены из семян различных растений (бобовых, злаковых, пасленовых). По содержанию ингибиторов на первом месте стоят представители семейства бобовых (2, 44, 66, 117, 118, 133, 139). Кроме названных выше ингибиторов трипсина и химотрипсина, в семенах сои обнаружены ингибиторы этих пищеварительных ферментов, отличающиеся по физико-химическим свойствам (94, 132, 150), и ингибиторы протеаз насекомых и фитопатогенных микроорганизмов, а также ингибиторы эндогенных протеолитических ферментов (65).
Ингибиторы протеолитических ферментов были обнаружены в семенах других бобовых культур - нута, чечевицы, прорастающих семенах чины (10, 11, 12), черном горохе (107, 108, 151), конских бобах (145), а также в различных видах и сортах фасоли (17, 126, 131, 145 147). Впервые в 1947 г. Борчерс с сотрудниками сообщили, что в семенах нута обнаружен ингибитор трипсина в высокой концентрации. Сахони и Бхандаркар показали, что ингибитор из семян нута довольно термостабилен и устойчив к действию кислот (цит. по 11). Е.П. Абрамова и М.П. Черников (2) установили, что экстракты из нута ингибируют как трипсин, так и химотрипсин. Ингибитор образует комплексы с этими ферментами при молярном отношении 1 : 1 (139). Ингибиторы из семян нута стабильны в широком диапазоне рН от 1,0 до 10,5 в течение 24 ч при 20 С, устойчивы к повышенной температуре, вплоть до 75С, а также не гидролизуются пепсином. Ингибиторы полностью разрушаются при варке семян при температуре 100 С и поджаривании при 130 С.
В литературе отсутствуют данные по взаимодействию белковых ингибиторов из семян нута с эндогенными протеолитическими ферментами. Исследования ингибиторов из семян нута проводились с позиций улучшения пищевой ценности семян нута - их разрушения путем тепловой обработки, или селекции сортов с пониженным уровнем ингибирующей активности по отношению к пищеварительным протеиназам.
Так, анализ 42 образцов семян нута, относящихся к различным эколого-географическим группам показал, что ингибиторы трипсина обнаружены во всех образцах, при этом уровень их активности составил в среднем 6,8 ± 0,22 мг/г. По этому показателю нут занимает промежуточное положение в группе бобовых культур. Так, активность трипсина в семенах гороха и чечевицы значительно ниже - 1,3 и 2,1 мг/г, в то время как в семенах фасоли обыкновенной, лимской фасоли и чины посевной существенно выше, чем у нута: 9,0; 21,2 и 16,7 мг/г (2, 9, 10).
Активность ингибиторов трипсина у разных сортов нута сильно варьирует: диапазон составляет 4,0 — 10,2 мг/г. Интересно, что эти крайние значения принадлежат образцам одной эколого-географической группе, а именно закавказской. В других группах также наблюдается значительный диапазон колебаний активности ингибиторов: в турецкой - от 5,7 до 9,4 мг/г, в памирской - от 4,1 до 8,0 мг/г. Некоторые группы по этому показателю более однородны. Так, туркестанская, эфиопская и памирская включают в основном образцы с относительно низкой активностью ингибиторов, а иранская, индийская и афганская - с относительно высокой (11).
Уровень активности ингибиторов в семенах нута изменяется в различные годы у разных сортов в неодинаковой степени. У большинства образцов эти изменения довольно значительны, и лишь у некоторых колебания не превышают 10%. В тоже время сортовые различия при этом сохраняются (11).
Анализ, имеющихся в литературе, данных по изучению протеолитических ферментов, а также белковых ингибиторов протеиназ из семян растений показал, что исследование белково-протеиназного комплекса семян различных культур (в особенности бобовых как наиболее богатых белком), в частности нута как ценной, высокопитательной и традиционной для Среднеазиатского региона культуры, а также механизмов регуляции их активности на разных этапах жизнедеятельности семян - при созревании, в покое и при прорастании, позволит расширить научные представления о роли протеолитических ферментов в процессах клеточного метаболизма, в том числе в процессах формирования и деградации запасных белков семян.
Влияние температуры на активность протеаз семян нута
Как известно температура является одним из факторов, оказывающих существенное влияние на скорость ферментативной реакции. Важным показателем является термостабильность ферментов в отсутствии субстрата. Частично очищенные препараты протеаз, полученные путем осаждения при подкислении и перерастворенные в 0,35% растворе соды выдерживали при температуре 40, 50, 60, 70, 80 С в течение 20 мин, затем определяли активность протеаз при оптимальной температуре - 40 С - (табл. 2.7).
Данные, представленные в табл. 2.7, свидетельствуют о том; что нейтральные протеазы обладают более высокой термостабильностью, по сравнению с щелочными протеазами семян нута. Так, при выдерживании содовых растворов протеаз при 70 С в течение 20 мин нейтральные протеазы сохраняли 60% исходной активности, а щелочные - 35%. В тоже время термостатирование препаратов протеаз при температуре 40 С в условиях данного опыта не приводило к потере активности. Изучение влияния активаторов и ингибиторов позволяет получить косвенные данные о функциональных группах активного центра фермента, механизме каталитического действия, установить принадлежность протеаз семян нута к тому или иному типу ферментов, а также использовать эти сведения для разработки схемы очистки исследуемых ферментов.
На первом этапе проводили изучение влияния активаторов и ингибиторов тиоловых протеиназ. Было исследовано влияние цистеина, являющегося активатором тиоловых протеиназ и п-хлормерурибензоата (п-ХМБ) - реагента, специфически блокирующего сульфгидрильные группы. В качестве контроля использовали препарат типичной тиоловой протеиназы -папаин. Установлено, что нейтральные протеазы активируются цистеином (2 мг/мл) в два с половиной раза и подавляются п-ХМБ (2 мг/мл) и в этом отношении близки к типичной цистеиновой протеиназе - папаину. Щелочные протеазы очень слабо активируются цистеином и их активность практически не подавляется в присутствии п-ХМБ (рис. 2.11 и 2.12).
На следующем этапе изучали влияние специфических ингибиторов сериновых протеаз фенилметилсульфонилфторида (ФМСФ) и диизопропилфторфосфата (ДПФФ), которые, связываясь с остатком серина в активном центре фермента, вызывают его инактивацию. Контролем служило изменение активности трипсина - типичной сериновой протеиназы.
Проведенные исследования показали, что при экстракции нейтральных и щелочных протеаз семян нута 0,35 % раствором соды извлекается большое количество балластных белков. Для дальнейшей очистки протеолитических ферментов семян нута проводили осаждение протеаз при подкислении.
Осаждение протеаз при подкислении проводили в двух вариантах с целью удаления большего количества балластных белков.
Первый вариант предусматривал подкисление экстракта до рН 5,0, при этом в осадок переходили как нейтральные так и щелочные протеазы семян нута. На следующем этапе осадок перерастворяли в соответствующем буфере и определяли активность протеаз и содержание белка. Выход по белку составил 95%; выход по активности 98, 5%. Этот режим осаждения протеаз обеспечивал практически полное выделение ферментов и при этом 5% балластных белков удалялся.
Второй вариант осаждения - ступенчатый, предусматривал первоначальное подкисление экстракта до рН 6,0 (преимущественно осаждались нейтральные протеазы) и дальнейшее подкисление до 5,0; при этом в осадок переходили преимущественно щелочные протеазы.
Этот режим осаждения обеспечивал удаление около 50% балластных белков при рН до 6,0 и до 80% балластных белков при рН до 5,0. При этом выход по активности нейтральных протеаз составил 98,5%, щелочных -50%. Препараты частично очищенных протеаз по приведенным выше вариантам осаждения использовали в дальнейших исследованиях.
Первоначально проводили фракционирование препарата-собственных нейтральных и щелочных протеаз семян нута, полученного по варианту 1 (раздел 2.3.1). Для этого на колонку наносили 5 мл перерастворенного в фосфатном буфере рН 7,5 осадка, элюцию проводили этим же буфером, объем собираемых фракций - 4 мл. В полученных фракциях регистрировали содержание белка при 280 нм и определяли активность нейтральных и щелочных протеаз. Профили элюции представлены на рис. 2.15.
Анализ полученных результатов показывает, что нейтральные и щелочные протеазы семян нута выходят с колонки в одной области с объемом элюции 80 - 88 мл, что соответсвует молекулярной массе 70000 — 35000 Дальтон.
