Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Анализ научно-технической литературы, нормативно-технической документации и других материалов, относящихся к методам получения водорода 8
1.1 Биологические методы получения водорода с использованием энергии света или органических субстратов 8
1.2 Получение водорода из СО и воды с помощью каталитических процессов. 12
1.3 Выделение водорода высокой чистоты из газовых смесей 18
1.4 Роль водорода в энергетике 30
1.5 Синтез-газ как сырье для получения водорода 32
1.6 Анаэробные микроорганизмы, использующие монооксид углерода в кач естве субстрата . 36
1.6.1 Термофильные гомоацетатные бактерии, способные к росту за счет окисления СО. 39
1.6.2 Термофильные СО-использующие метанобразующие археи 41
1.6.3 Термофильные СО-использующие сульфатредуцирующие бактерии и археи 42
1.7 Биохимия анаэробного окисления СО 45
1.7.1- СО-дегидрогеназа и ацетил-КоА-синтаза... 46
1.7.2 №-СООН/АС8 ферментные комплексы; 47
1.7.3 Каталитический цикл окисления СО в активном центре СО- дегидрогеназ 49
1.8 Известные методы микробиологической переработки синтез-газа 50
Выводы по главе 1 ...52
Глава 2 Экспериментальная часть. Методики проведения исследований ... 53
2.1 Методики выделения микроорганизмов из природных источников и культивирования их в статических условиях. 53
2.2 Методики определения величины расхода газа и состава газообразных и жидких метаболитов микроорганизмов ..56
2.3 Световая микроскопия. 59
2.4 Электронная микроскопия 59
2.5 Выделение и анализ ДНК... ..59
2.6 Определение состава полярных липидов ...59
2.7 Хромато-масс-спектрометрическое определение жирнокислотного состава клеток 60
2.8 Лабораторные установки 61
Выводы по главе 2 1 63
Глава 3 Результаты и обсуждение экспериментальных исследований 64
3.1 Выделение новых микроорганизмов являющихся биокатализаторами реакции водяного газа 64
3.2 Исследование фенотипических и филогенетических характеристик выделенного штамма СО-потребляющих микроорганизмов 65
3.3 Исследование некоторых хемотаксономических характеристик выделенного штамма СО-потребляющих микроорганизмов 70
3.4 Осуществление биотехнологического процесса получения водорода путем культивирования термофильных микроорганизмов в непрерывном режиме 72
3.4.1 Ферментация монооксида углерода с помощью бактерий SET IS-9 на установке для культивирования термофильных карбоксидотрофных микроорганизмов в исполнении 1 72
3.4.2 Ферментация монооксида углерода с помощью бактерий SET IS-9 на установке для культивирования термофильных карбоксидотрофных микроорганизмов в исполнении 2 81
3.4.3 Ферментация монооксида углерода с помощью бактерий С. hydrogenoformans Z-2901 на установке для культивирования термофильных карбоксидотрофных микроорганизмов в исполнении 3 83
3.4.4 Ферментация монооксида углерода с помощью бактерий SET IS-9 88
3.4.5 Ферментация модельной газовой смеси 25 % СО + Н2 с помощью бактерий SET IS-9T 92
3.5 Исследование влияния заражения культуры на жирнокислотный состав клеток СО-потребляющих микроорганизмов 96
Выводы по главе 3 98
Заключение 99
Список использованных источников 100
Публикации 115
- Анаэробные микроорганизмы, использующие монооксид углерода в кач естве субстрата
- Методики определения величины расхода газа и состава газообразных и жидких метаболитов микроорганизмов
- Исследование фенотипических и филогенетических характеристик выделенного штамма СО-потребляющих микроорганизмов
- Ферментация модельной газовой смеси 25 % СО + Н2 с помощью бактерий SET IS-9T
Введение к работе
В современном мире бурное развитие промышленности породило проблемы, связанные с истощением ископаемого углеводородного сырья, прежде всего, нефти. Следствием использования ископаемых топлив являются серьезные экологические проблемы, главной из которых является глобальное потепление.
В качестве альтернативных топлив наибольшее значение приобрели биоэтанол, биобутанол и биодизелыюе топливо (метиловые или этиловые эфиры жирных кислот), а также водород. Значительным недостатком первых трех топлив является использование сельскохозяйственной продукции в качестве сырья для их производства.
В качестве сырья для производства водорода может служить синтез- газ, который в свою очередь может быть получен конверсией природного газа или попутного нефтяного газа, газификацией углеродсодержащих бытовых или промышленных отходов, а также низкосортных каменных углей, запасы которых значительно превосходят запасы ископаемых углеводородов.
Водород широко используется в химической, нефтехимической, нефтеперерабатывающей и других отраслях промышленности для производства аммиака, метанола, моторных топлив, для процессов гидроочистки, гидрокрекинга и т. д.
Объем мирового производства водорода составляет 50 млн. тонн и растет на 5-10% в год. Более 90% водорода и синтез-газа (Нг и СО), производимого и используемого ,в промышленности, получают методами паровой, паровоздушной, пароуглекислотной или парокислородной каталитической конверсии углеводородного сырья.
Традиционные термокаталитические методы переработки синтез-газа в водород осуществляются при высоких температурах и давлениях, а также требуют тщательной сероочистки сырья, что приводит к снижению энергоэффективности процесса. Микробиологические методы по своей сути лишены этих недостатков, что особенно актуально в свете последних разработок в области плазмохимической переработки природного газа.
Анаэробная ферментация синтез-газа микроорганизмами, изучаемыми в данной работе, представляет собой микробиологическую реакцию водяного газа, в результате которой монооксид углерода, содержащийся в синтез-газе, окисляется водой до углекислого газа с образованием эквимолярного количества водорода. Высокой степени конверсии при этом способствует низкая температура процесса. Остаточная концентрация СО в газовой фазе может снижаться до нескольких млн"1, таким образом, полученный водород после очистки от углекислого газа удовлетворяет высоким требованиям по чистоте и пригоден для использования в низкотемпературных СО- чувствительных топливных элементах с протон-проницаемыми мембранами.
Объект исследования диссертагрш — культуры термофильных микроорганизмов, способных катализировать реакцию водяного газа, а также образцы воды, обрастаний и осадков из гидротерм Исландии, Байкальской рифтовой зоны и полуострова Камчатка.
Предметом диссертационного исследования выступают ферментативно катализируемая реакция водяного газа, системы конверсии газов, содержащих монооксид углерода.
Основной целью настоящего исследования явилась разработка метода получения водорода из СО-содержащих газов с использованием в качестве катализатора культур карбоксидотрофных гидрогеногенных микроорганизмов.
Для достижения поставленной цели в диссертации решены следующие основные задачи:
1. Выделение новых штаммов микроорганизмов, способных к эффективной трансформации монооксида углерода с получением водорода.
Разработка методики непрерывного культивирования микроорганизмов, способных к трансформации монооксида углерода с получением водорода.
Разработка методики контроля чистоты культуры микроорганизмов в условиях непрерывного культивирования в нестерильных условиях.
Определение конверсии и производительности по водороду биореакторов барботажного типа.
Проведение процесса микробиологического получения водорода в течение длительного времени для подтверждения стабильности культуры микроорганизмов.
Научная новизна представленной работы заключается в исследовании микробиологически катализируемой реакции водяного газа в реакторах барботажного типа.
Впервые определены зависимости конверсии и производительности по водороду от величины расхода газа для биореакторов барботажного типа с использованием различных штаммов микроорганизмов в качестве биокатализаторов.
Выделен новый штамм микроорганизмов SET IS-9, являющийся биокатализатором реакции водяного газа и обладающий сопоставимыми с лучшими известными штаммами гидрогеногенных микроорганизмов скоростью роста и биокаталитической активностью.
По результатам фенотипических и филогенетических исследований выделенный штамм микроорганизмов SET IS-9 отнесен к новому виду бактерий рода Carboxydothermus.
Впервые показана возможность продолжительной генерации водорода в лабораторной установке при использовании в качестве биокатализатора выделенного штамма микроорганизмов SET IS-9.
Впервые определены хемотаксономические характеристики видов рода Car boxy dothermus, применимые для экспресс-идентификации представителей рода и для контроля чистоты культуры микроорганизмов.
Публикации и апробация результатов работы. По материалам диссертации опубликовано 6 работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.
Основные результаты исследований были представлены в докладах и презентациях на российских и международных научных конференциях: XVI Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2009 г.), а также на VIII Всероссийской конференции молодых ученых, специалистов и студентов «Новые технологии в газовой промышленности».
Благодарности. Автор выражает глубокую признательность научному руководителю проф., д.х.н. В.А. Винокурову и д.б.н. Т.Г. Соколовой за постоянное внимание и большую помощь в работе и обсуждении результатов.
Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам лаборатории гипертермофильных микробных сообществ ИНМИ РАН имени С.Н. Виноградского. Отдельную благодарность автор выражает к.б.н. A.B. Лебединскому за ценные советы и конструктивную критику. Искренняя благодарность всем коллегам, принимавшим участие в различных этапах работы: к.б.н. Т.В. Колгановой (Центр Биоинженерии РАН), д.м.н. Л.В. Диденко (НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН), к.х.н. О.В. Поповой, А. Бердыевой и Д. Шариповой (РГУ нефти и газа имени И.М. Губкина).
Отдельная благодарность асп. М.С. Котелеву, без которого эта работа не могла бы быть выполнена, за неоценимую помощь и поддержку.
Работа выполнена при поддержке Федеральной Целевой Программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 20092013 годы».
Анаэробные микроорганизмы, использующие монооксид углерода в кач естве субстрата
Синтез-газ может быть получен газификацией органического сырья: угля, кокса, нефти и газа [45,46], из биомассы [47], или промышленных и бытовых твердых отходов [48]. Синтез-газ состоит преимущественно из смеси водорода, монооксида углерода, углекислого газа и небольших количеств других газов, таких как метан, азот, сероводород [49]. Он может быть использован как топливо или в качестве сырья в химическом производстве для получения широкого спектра продуктов, например, метанола и уксусной кислоты [45,46].
Синтез-газ может быть получен в результате прямой газификации — процесса, при котором кислород или воздух используются для парциального окисления каменного угля. Парциальное окисление угля - это процесс экзотермический. При проведении косвенной газификации в качестве окислителя используется водяной пар, это делает процесс эндотермическим и лимитированным скоростью подвода тепла, но при этом он более выгоден с точки зрения термодинамики. Состав получаемого синтез-газа зависит от состава используемого сырья, а также от условий проведения процесса. Содержание СО в синтез-газе растет вместе с увеличением отношения количества углерода к количеству водорода в молекулах веществ, используемых для переработки [45]. Например, процессы паровой газификации чистого углерода (каменного угля) и метана могут быть представлены в виде реакций:
Как видно из приведенных уравнений, паровая конверсия природного газа теоретически дает более низкое содержание монооксида углерода в продуктах, чем газификация угля. Условия проведения процесса также влияют на состав получаемого синтез-газа и определяют температуру отводимых из реактора продуктов [45,46]. В таблице 3 представлен характерный состав синтез-газа, получаемого газификацией различных ископаемых топлив:
Газификация твердых отходов, как правило, является более сложным процессом из-за того, что углеродсодержащие материалы имеют переменный состав. Доведение сырья до некоторой степени гомогенности весьма желательно для проведения процесса газификации с приемлемой эффективностью [46]. Для газификации пригодны не все виды твердых отходов, т.к. их стоимость их подготовки может сделать весь процесс нерентабельным. Для переработки газификацией пригодны следующие типы твердых отходов: отходы бумажных фабрик, смешанные отходы пластмасс, отходы деревообрабатывающей промышленности и сельскохозяйственные стоки. Значительные отличия процессов газификации нефтегазового сырья и биомассы не позволяют совместить их аппаратно. Так, для газификации ископаемых топлив предпочтительна косвенная газификация водяным паром, в то время как для переработки биомассы целесообразнее использовать метод парциального окисления воздухом. Получаемый синтез-газ является низкосортным по причине высокого содержания в нем азота и низкой теплотворной способности. Использование чистого кислорода значительно повышает качество продукта, но также повышает себестоимость производимого газа. В работе итальянских специалистов по газификации [50] был исследован комбинированный процесс пиролиза и паровой конверсии древесной биомассы при температурах выше 950 С. В результате такого процесса получался синтез-газ с высокими содержаниями водорода (20-50 %) и СО (15-30 %), что доказывает высокий потенциал биомассы как сырья для- производства синтез-газа. Другой интересный метод переработки биомассы в газообразные энергоносители - это газификация под действием воды в сверхкритических условиях. Он может проводиться с использованием влажной биомассы без предварительной осушки и характеризуется высокой степенью превращения при низких температурах. Вещество в сверхкритическом состоянии находится при температуре и давлении выше критической точки, для воды эта точка соответствует температуре 374 С и давлению 22 МПа. В сверхкритических условиях вода проявляет промежуточные свойства между своим жидким состоянием и паром, при этом она способна растворять многие вещества, нерастворимые в воде при нормальных условиях. Это и приводит к ускорению отдельных химических реакций и в целом увеличивает эффективность процесса газификации [52]. Синтез-газ, получаемый в циркуляционных газификаторах с кипящим слоем при атмосферном давлении с использованием различных отходов в качестве сырья, например, таких, как опилки, солома, очистки от какао обычно содержит около 10% СО, 7% Н2, 16% С02, 2.8% СН4, а также более 60% Ы2 [48]. С переходом от одного типа сырья к другому это соотношение сильно не изменяется, за исключением случая, когда используются органические бытовые отходы, при этом полученный продукт содержит ещё меньше СО и Н2, и ещё больше 1Ч2. % В работе [51] определяли состав синтез-газа и производили расчет и моделирование процессов газификации, дающих 16-20% СО в осушенном продукте и около 14% Н2. Другое исследование, проведенное группой ученых из Нидерландов, было посвящено исследованию газификации широкого спектра различных твердых отходов. Как правило, отходы, поступающие на газификацию, имеют «отрицательную» стоимость, т.к. в противном случае они должны быть утилизированы захоронением или сжиганием, что в свою очередь тоже стоит денег. Типичные потоки отходов, пригодные для газификации должны включать в свой состав макулатуру, опилки, солому, органические бытовые отходы, органические отходы пищевой промышленности, а также осадки сточных вод [51], отходы сельскохозяйственных культур, например, сахарной свеклы [53] и навоз [54]. Осадки от сточных вод, навоз, как правило, перерабатываются с затруднениями из-за высокого содержания в них азота, серы, тяжелых металлов, и высокой зольности. Для проведения процесса газификации осадков сточных вод необходимо смешивать их с другими отходами для достижения необходимой теплотворной способности получаемого синтез- газа. Тем не менее, данный тип отходов является перспективным ресурсом для процессов газификации [55], с учетом того, что объем сточных вод имеет тенденцию увеличиваться [56]. Несмотря на большое число исследований, проводимых в направлении газификации биомассы, до сих пор не удается преодолеть затруднения, связанные с тем, что подобные процессы становятся экономически целесообразными только при масштабной схеме производства синтез-газа и энергии [57]. Для их реализации требуется не только постоянный поток подходящих по составу твердых отходов, но и дополнительная очистка получаемого синтез-газа.
Методики определения величины расхода газа и состава газообразных и жидких метаболитов микроорганизмов
Последние кристаллографические исследования С-кластеров СО- дегидрогеназ с Н20 и "CN-лигандами показывают, что обнаруживаемый ранее сульфидный мостик между атомами железа и никеля в С-кластере СО- дегидрогеназы С.hydrogenoformans не играет каталитической роли и служит лишь для обеспечения сохранности активного центра фермента до его вступления в каталитический цикл [134].
Переработка синтез-газа с помощью микроорганизмов считается перспективной, начиная с 90-ых гг. прошлого века. Исследования, направленные на использование пурпурных бактерий для получения водорода из синтез-газа, проводились Национальной Лабораторией Возобновляемых Источников Энергии (ЫКЕЬ) [135]. Однако, технико- экономический анализ показал, что применение микробиологически катализируемой реакции водяного газа как самостоятельного процесса не выдерживает конкуренции с традиционными термохимическими технологиями из-за необходимости сооружения весьма объемных биореакторов (что обусловлено проблемами массопереноса). С другой стороны, применение биореакторов с пурпурными бактериями было сочтено перспективным для периодического получения водорода ввиду возможности более быстрого запуска таких установок и возможности работы при различной производительности (в отличие от каталитических конвертеров).
Из разработок, дошедших до стадии пилотной установки, на настоящий момент известны лишь процессы получения этанола из синтез- газа с помощью некоторых мезофильных бактерий. Первым таким проектом была пилотная установка в г. Файетвилле (Арканзас, США), принадлежащая компании Bioengineering Resources, Inc. [136].
По схожей принципиальной схеме работает и другой проект - Coskata, Inc. [137]. В процессе Coskata, по-видимому, используются те же микроорганизмы, а отличие достигается за счет использования биореакторов с полыми волокнами, через которые подается синтез-газ. Рост микроорганизмов осуществляется на внешних стенках этих волокон. Также новшеством является и первопорационная технология отделения этанола.
Следует отметить, что использование термофильных быстрорастущих (время удвоения менее 2 ч) микроорганизмов является перспективным не только с точки зрения более интенсивного метаболизма и поддержания чистоты культуры, но и с позиций отделения пизкокипящих жидких продуктов. Впрочем, термофильных СО-потребляющих продуцентов этанола на данный момент не известно.
Реакция водяного газа, в настоящее время применяющаяся главным образом для переработки продуктов конверсии природного газа и продуктов газификации угля, является важным этапом процессов получения водорода из органического сырья.
Термокаталитические методы проведения этой реакции не позволяют осуществлять процесс при малой или изменяющейся в широких пределах производительности ввиду малой устойчивости традиционных каталитических систем к циклам «пуск-останов» и сложности компактного аппаратурного оформления двухстадийного процесса.
Микробиологические способы переработки синтез-газа, несмотря на ряд предпосылок (низкие температура и давление, возможность изменения скорости подачи сырья в широких пределах), обуславливающих их привлекательность в технологическом отношении, остаются малоизученной областью исследований. Возможными причинами этого являются физиологические особенности микроорганизмов, являющихся биокатализаторами реакции водяного газа (высокая чувствительность к кислороду, специфические требования к микроэлементному составу среды), а также ингибирующее действие и малая растворимость в воде целевого субстрата - монооксида углерода.
Достижения последних лет в выделении новых СО- трансформирующих микроорганизмов и выяснения структуры и механизма действия участвующих в процессах биологической переработки монооксида углерода ферментов позволяют надеяться на бурное развитие исследований в области микробиологических процессов переработки СО, в том числе, в водород, в ближайшее время.
Объектами исследований служили образцы воды, обрастаний и осадков из гидротерм Исландии, Байкальской рифтовой зоны и полуострова Камчатка, а также культуры термофильных карбоксидотрофных микроорганизмов.
Культивирование накопительных и чистых культур гидрогеногенных СО-окисляющих прокариот проводили в анаэробно приготовленной жидкой среде в атмосфере, содержащей 100 % СО. Базовая минеральная среда №1 для культивирования пресноводных карбоксидотрофов имела следующий состав (г/л): МН4С1 - 0,66; MgCl26H20 - 0,16; СаС12-2Н20 - 0,10; КС1 - 0,33; КЫ2РО4 - 0,33; 1ЧаНСОз - 0,50. В среду добавляли 1,0 мл/л раствора витаминов, 1,0 мл/л раствора микроэлементов №1. Среду восстанавливали добавлением Иа28-9Н20 (1,0 г/л). В ряде случаев в среду вносили дрожжевой экстракт (0,2 г/л).
В опытах по непрерывному культивированию на лабораторной установке в исполнении 1 использовалась среда №2: ЫН4С1 - 1,50 г/л, М804-7Н20 - 0,20 г/л, СаС12-2Н20 - 0,02 г/л, КН2Р04 - 0,10 г/л, К2НР04 - 0,50 г/л, ИаС1 — 0,50 г/л, добавлялся также резазурин до заметного голубого окрашивания. В среду добавляли 1,0 мл/л раствора витаминов, 1,0 мл/л раствора микроэлементов №1 или №2. В качестве восстанавливающего агента использовался дитионит натрия, добавляемый малыми порциями до достижения значения ОВП ниже -350 мВ.
Исследование фенотипических и филогенетических характеристик выделенного штамма СО-потребляющих микроорганизмов
Для получения дополнительного подтверждения отнесения штамма SET IS-9 к новому виду было произведено определение некоторых хемотаксономических характеристик видов рода Carboxydothermus. В соответствии с предложениями ведущих микробиологов, с 2010 года жирнокислотный состав и состав полярных липидов включены в число характеристик, требуемых для валидного описания новых таксонов. Кроме того, с помощью современных методик возможно осуществить экспресс- определение липидного состава микроорганизмов менее чем за 20 минут, что уже в ближайшем будущем позволит производить экспресс-идентификацию микроорганизмов на основании хемотаксономических характеристик.
Был определен состав полярных липидов клеток штамма SET IS-91 и двух видов рода Carboxydothermus. Межвидовые отличия состава полярных липидов незначительны. Полярные липиды исследованных представителей рода Carboxydothermus представлены, главным образом, единственным фосфолипидом. Прочие полярные липиды (3-5 веществ) образуются клетками в значительно меньшем количестве и детектируются с помощью фосфорномолибденовой кислоты только на грани разрушения пластинки ТСХ. Состав полярных липидов не позволяет однозначно судить о чистоте культуры и об отнесении исследуемого штамма к конкретному виду в пределах рода Carboxydothermus.
Был определен жирнокислотный состав клеток штаммов SETIS-91, состав клеток микроорганизмов может быть использован для различения видов в пределах рода, а также для контроля чистоты культур микроорганизмов. Результаты жирнокислотного анализа клеток приведены в таблице 6 (при удельном содержании какого-либо компонента менее 1 % оно указано как «следы»).
Из таблицы 6 видно, что жирнокислотный состав клеток бактерий довольно сильно зависит от условий культивирования. Тем не менее, межвидовые отличия в данном случае оказываются существенней: штамм SET IS-9 по сравнению с прочими видами рода характеризуется более высоким содержанием миристиновой и пальмитиновой жирных кислот (Сн-.о и Ci6:o), и в то же время менее высоким содержанием г«о-пентадекановой и шгаег/зо-пентадекановой жирных кислот (С]5оиз и С150 антеизо). Приведенные отличия штамма SET IS-91 превосходят различия между известными видами рода Carboxydothermus и могут служить подтверждением отнесения штамма SET IS-9 к новому виду в пределах рода. SET IS-9 на установке для культивирования термофильных карбоксидотрофных микроорганизмов в исполнении 1 Культивирование штамма SET IS-9 осуществлялось на лабораторной установке для культивирования карбоксидотрофных бактерий в исполнении 1. Использовалась среда для культивирования №2 в количестве 7,5 л с добавлением раствора микроэлементов №1 или №2 из расчета 1 мл/л среды. Биореактор термостатировали при температуре 65 С. Осуществляли продувание коммуникаций рабочим газом в течение 5 минут для удаления из них воздуха. Затем реактор со средой продували аргоном в течение 15 минут для удаления следов воздуха из газового тракта и замещения газовой фазы. В среду в противотоке азота вносили дитионит натрия до достижения потенциала -350 мВ (что примерно соответствует 150 мг Na2S204). Засев реактора осуществляли в противотоке азота. После внесения посевного материала газовая фаза замещалась на рабочий газ, и осуществлялась выдержка реактора в статическом режиме в течение 12 часов. Далее включали барботаж и перемешивание, отбор проб культуральной жидкости производили каждые 6 часов. Первые опыты по проведению культивирования микроорганизмов в биореакторе осуществляли на ранней версии установки, газовые коммуникации которой были собраны на основе силиконовых шлангов и стеклянных вакуумных кранов. Первые два раза вносили в качестве восстановителя дитионит натрия, объем посевного материала составил в первый раз 30 мл, во второй - 150 мл, рабочий газ - смесь 25 % СО + Н2. В обоих случаях спустя 6-8 часов после замены газовой фазы и выдержки биореактора в статическом режиме, окислительно-восстановительный потенциал среды поднимался до значений -150... 100 мВ, появлялось розовое окрашивание индикатора, что указывало на окисление среды. Опыты прекращали, т.к. известно, что при таких значениях ОВП микроорганизмы не способны к росту. Анализируя полученные результаты после первой попытки, было сделано предположение о том, что объем посевного материала в 30 мл недостаточен для того, чтобы микроорганизмы успели в условиях биореактора пройти лаг-фазу и начать активно восстанавливать среду, нейтрализую остаточную диффузию кислорода через резиновые уплотнения. Вторую попытку запуска биореактора предприняли, взяв для засева 150 мл посевного материала, выращенного на чистом СО. За 6 часов до засева бутыль с посевным материалом термостатировали при 65 С для того, чтобы активировать микроорганизмы, и без охлаждения вносили в ферментер. Через 6 часов также наблюдалось окисление среды, и опыт был прекращен. На этот раз было сделано предположение, что дитионит натрия не обеспечивает необходимой редокс-буферности системы. Для проверки данного предположения был поставлен ряд экспериментов по сравнению восстанавливающей способности суфильфида и дитионита натрия. В герметичные культивационные сосуды общим объемом 65 мл помещался раствор, близкий по составу и концентрации к ферментационной среде, фосфатный буфер обеспечивал значение рН, равное 6,86, также добавляли индикатор окислительно-восстановительного потенциала (резазурин). Содержимое двух сосудов тщательно продувалось аргоном с целью удаления растворенного кислорода, также под током аргона внутрь вносили 10 мг дитионита натрия в один сосуд и 10 мг нонагидрата сульфида натрия во второй. Сосуды термостатировали при 65С. Таким же образом проводили опыты при внесении в раствор 50 мг дитионита, 50 мг сульфида, а также минимального количества этих веществ, необходимого для обесцвечивания резазурина. Стоит отметить, что дитионит натрия восстанавливает среду мгновенно, в то время как сульфид натрия требует некоторой выдержки и нагревания до 45-50С. Во всех трех опытах обнаружили, что в сосудах с дитионитом натрия окрашивание индикатора восстанавливалось в течение 15-25 минут после начала инкубирования. Растворы, содержащие сульфид даже в минимальной концентрации, оставались бесцветными на протяжении нескольких дней. Данный факт указывает на то, что в случае дитионита натрия повышение окислительно- восстановителыюго потенциала обусловлено не диффузией кислорода через резиновую пробку сосудов, а химическими изменениями самого восстановителя.
Ферментация модельной газовой смеси 25 % СО + Н2 с помощью бактерий SET IS-9T
После стабилизации численности клеток на уровне 2,6-108 кл/мл были проведены эксперименты по определению зависимости конверсии и производительности реактора по водороду от расхода газа. Ромбовидные отметки на рисунке 24 обозначают действия, предпринятые в ходе ферментации. Через 51 час после начала ферментации было произведено добавление сульфида, витаминов и дрожжевого экстракта в реактор из расчета 0,1 г нонагидрата сульфида натрия, 0,25 мл раствора витаминов и 0,1 г дрожжевого экстракта на 1 л среды. На следующий день было отмечено увеличение численности клеток в реакторе до 5,1-10 кл/мл. Была проведена еще одна серия экспериментов по определению зависимости конверсии и производительности реактора по водороду от расхода газа. Через 88 часов после начала ферментации реактор был остановлен. По результатам измерений расхода газа и определений состава газа на выходе из реактора были рассчитаны условное время контакта, конверсия и производительность реактора по водороду. Результаты вычислений приведены в таблице 9.
Результаты определения зависимости конверсии и производительности биореактора по водороду от расхода газа показаны на рисунке 25. Белыми знаками на рисунке показаны значения, полученные для концентрации клеток в реакторе, равной 2,6-10 кл/мл. Черными знаками на рисунке показаны значения, полученные при концентрации клеток в реакторе, равной 5,1 108 кл/мл.
Как видно из рисунка 25, максимальная конверсия монооксида углерода, равная 48,3 %, была достигнута при минимальном испытанном расходе, равном 3,1 мл/мин. Максимальная производительность биореактора по водороду достигается при расходах газа свыше 85,1 мл/мин. Предпочтительный режим работы биореактора, таким образом, предусматривает проведение процесса при расходах газа от 3,1 до 85,1 мл/мин, что соответствует условным временам контакта от 161 мин до 5,88 мин. Из рисунка 10 также видно, что повышение концентрации клеток микроорганизмов с 2,6-10 до 5,110 кл/мл (т.е., почти в два раза) не оказывает существенного влияния на характеристики процесса, что является свидетельством лимитирования реакции процессами массопереноса и возможности дальнейшего увеличения производительности и конверсии за счет совершенствования аппаратурного оформления процесса. Следует отметить также, что во всех проведенных экспериментах производительность реактора по водороду переставала увеличиваться при увеличении расхода газа свыше примерно 80 мл/мин. Это говорит о том, что межвидовые отличия микроорганизмов не оказывают существенного влияния на характеристики процесса и может служить дополнительным свидетельством лимитирования реакции процессами массообмена. Отмеченное снижение конверсии и производительности реактора по водороду при использовании в качестве субстрата газовой смеси 25 % СО + Н2 говорит о необходимости совершенствования конструкции реактора с целью интенсификации массообмена для получения на выходе газа с низким содержанием монооксида углерода либо о предпочтительности проведения процессов доочистки газов от СО путем осуществления микробиологической реакции водяного газа в периодическом режиме. Процесс культивирования термофильных карбоксидотрофных микроорганизмов в непрерывном режиме на установке в исполнениях 2 и 3 проводился в нестерильных условиях в течение длительного времени (до 128 ч для С. кусЬ епо/огтат 2-2901 и до 201ч для БЕТ 18-9). Стабильность концентрации клеток и визуальная однородность культуры во время культивирования, подтверждаемые микроскопией проб из реактора, говорят о том, что процесс микробиологического получения водорода из СО содержащих газов не требует предварительной стерилизации биореактора и поддержания асептических условий во время культивирования, что повышает энергоэффективность биотехнологического процесса и выгодно отличает его от аналогов с применением мезофильных микроорганизмов. Выдерживание биологического раствора с клетками штамма 8ЕТ18-91 при температуре 4 С в течение суток привело к появлению в культуре подвижных палочкообразных клеток, превосходящих по длине и толщине клетки SET IS-9 , в том числе спорообразующих. Был определен жирнокислотный состав клеток такой загрязненной культуры. В таблице 10 т приведен жирнокислотный состав клеток штамма SET IS-9 при культивировании в статических условиях, при культивировании в реакторе, а также при заражении культуры. Как видно из таблицы 10, появление гидроксилированных жирных кислот может свидетельствовать о заражении культуры микроорганизмов рода СагЪохус1о1кегт118. Метод определения жирнокислотного состава клеток микроорганизмов, использующихся в качестве биокатализаторов реакции водяного газа, может служить для контроля чистоты культуры. Выводы по главе 3 1. Выделен новый штамм термофильных карбоксидотрофных т гидрогеногенных микроорганизмов SET IS-9 , отнесенный к новому виду "Carboxydothermus islandicus" на основании результатов микробиологических и филогенетических исследований. 2. Впервые исследован жирнокислотный состав клеток бактерий рода Carboxydothermus; выявлены межвидовые различия, которые могут служить для различения видов в пределах данного рода. 3. Впервые исследованы зависимости конверсии и производительности биореактора по водороду при культивировании бактерий Carboxydothermus hydrogenoformans Z-2901 и SET IS-9 . Установлено, что производительность ПО водороду может достигать 2,0 М водорода/(м реакторл Ч) при условном времени контакта менее 5,13 мин для бактерий Carboxydothermus hydrogenoformans Z Т X 2901 и менее 4,80 мин для бактерий SET IS-9 . 4. Впервые показано, что степень конверсии и производительность по водороду изменяются несущественно при изменении концентрации клеток микроорганизмов в реакторе с 2,6-10 до 5,1 10 кл/мл, что говорит о лимитировании реакции процессами массопереноса и, следовательно, о возможности дальнейшего увеличения производительности и конверсии за счет совершенствования аппаратурного оформления процесса. 5. Впервые показано, что осуществление реакции водяного газа с помощью бактерий рода Carboxydothermus возможно в нестерильных условиях в течение свыше 200 ч без потери активности биокатализатора и загрязнения культуры. 6. Показано, что обнаружение гидроксилированных жирных кислот при определении жирнокислотного состава клеток микроорганизмов рода СагЬохуЛоЖегтш может свидетельствовать о заражении культуры посторонними микроорганизмами.
