Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 9
1.1. Гуминовые кислоты различного происхождения: их состав и свойства 9
1.2. Природа биологической активности гуминовых кислот 21
1.3. Химическая модификация гуминовых кислот 2д
1.4. Области использования гуминовых препаратов 32
2. Объекты исследования 40
3. Методики анализа и эксперимента 50
3.1. Стандартные методы исследования 50
3.1.1. Технический анализ торфа 50
3.1.2. Элементный анализ 50
3.1.3. ИК-спектроскопия 51
3.1.4. Электронная спектроскопия 51
3.1.5. Препаративная тонкослойная хроматография (ТСХ) 51
3.1.6. Структурно-групповой анализ 52
3.1.7. Атомно-абсорбционный анализ 52
3.1.8. Определение сорбционной способности гуминовых препаратов по отношению к ионам тяжелых металлов 53
3.1.9. Выделение гуминовых кислот 53
3.1.10. Выделение фульвокислот 54
3.1.11. Выделение гиматомелановых кислот 54
3.1.12. Определение молекулярной массы 54
3.1.13. Функциональный анализ 54
3.1.14.0пределение галогенов в гуминовом препарате 55
3.1.14.1. Поглощение хлора и брома 55
3.1.15. Определение биологической активности гуминовых препаратов 56
3.1.15.1.0пределение биологической активности дрожжевым тестом 56
3.1.15.2. Оценка биологической активности по влиянию на ранний онтогенез огур
цов 56
3.1.16. Определение антибактериальной активности 57
3.2. Применённые методы химической модификации гуминовых кислот 58
3.2.1. Восстановление гуминовых кислот хлоридом олова (II) в щелочной среде (гидроксостаннитом натрия) 58
3.2.2. Восстановление гуминовых кислот тетрагидроборатом натрия 59
3.2.3. Карбоксилирование гуминовых кислот 60
3.2.4. Гидробромирование гуминовых кислот 61
3.2.5. Хлорметилирование гуминовых кислот в присутствии апротонной кислоты 62
3.2.6. Хлорметилирование гуминовых кислот в присутствии протонной кислоты 62
3.2.7. Алкилирование 2,4-пентандиона хлорметилированными гуминовыми препаратами 63
3.2.8. Ацилирование гуминовых кислот хлорангидридом индолил-3-укусной кислоты 64
4. Обсуждение результатов эксперимента 66
4.1. Модификация гуминовых кислот хлоридом олова (II) в щелочной среде (гидроксостаннитом натрия) 68
4.1.1. Влияние продолжительности восстановления гуминовых кислот хлоридом олова (II) в щелочной среде на выход гуминовых препаратов, их структурные параметры и биологическую активность
4.1.2. Влияние температуры обработки гуминовых кислот хлоридом олова (II) в щелочной среде на выход гуминовых препаратов, их структурные параметры и биологическую активность 70
4.1.3. Влияние концентрации восстановителя на выход гуминовых препаратов, их структурные параметры и биологическую активность 72
4.2. Модификация гуминовых кислот тетрагидроборатом натрия 76
4.2.1. Влияние продолжительности восстановления гуминовых кислот тетрагидроборатом натрия на выход гуминовых препаратов, их структурные параметры и биологическую активность 76
4.2.2. Влияние концентрации тетрагидробората натрия на выход гуминовых препаратов, их структурные параметры и биологическую активность 77
4.3. Карбоксилирование гуминовых кислот 83
4.4. Модификация гуминовых кислот бромоводородной кислотой
4.4.1.Влияние продолжительности обработки гуминовых кислот бромоводородной кислотой на выход гуминовых препаратов, их структурные параметры и биологическую активность Sfi
4.4.2. Влияние концентрации бромоводородной кислоты на выход гуминовых препаратов, их структурные параметры и биологическую активность 89
4.4.3. Влияние температуры обработки гуминовых кислот бромоводородной кисло той на выход гуминовых препаратов, их структурные параметры и биологическую активность
4.5. Взаимодействие гуминовых кислот с 1,3-дикарбонильным соединением 94
4.5.1. Влияние продолжительности процесса хлорметилирования гуминовых кислот в присутствии апротонной кислоты (ZnCb) на структурные параметры гуминовых препаратов 95
4.5.2. Влияние продолжительности процесса хлорметилирования гуминовых кислот в присутствии протонной кислоты (НС1) на структурные параметры гуминовых препаратов
4.5.3. Результаты взаимодействия продуктов хлорметилирования гуминовых кислот в присутствии апротонной кислоты с 1,3-дикарбонильным соединением 98
4.5.4. Результаты взаимодействия продуктов хлорметилирования гуминовых кислот в присутствии протонной кислоты с 1,3-дикарбонильным соединением 99
4.5.5. Ионообменные свойства исходных гуминовых кислот и продуктов их химиче ской модификации 101
4.6. Влияние условий ацилирования гуминовых кислот хлорангидридом индолил-3-укусной кислоты на выход гуминовых препаратов, их элементный состав и биологическую активность 105
4.7. Антибактериальная активность гуминовых препаратов 111
4.8. Оценка биологической активности гуминовых препаратов по влиянию на ранний онтогенез огурцов 114
Выводы 119
Литература
- Химическая модификация гуминовых кислот
- Определение сорбционной способности гуминовых препаратов по отношению к ионам тяжелых металлов
- Влияние продолжительности восстановления гуминовых кислот хлоридом олова (II) в щелочной среде на выход гуминовых препаратов, их структурные параметры и биологическую активность
- Влияние температуры обработки гуминовых кислот бромоводородной кисло той на выход гуминовых препаратов, их структурные параметры и биологическую активность
Введение к работе
Гуминовые кислоты (ГК) - важнейшая составная часть органической массы каустобиоли-тов, представляющие собой смесь высокомолекулярных веществ сложного строения, замещенных различными функциональными группами, каждая из которых выполняет строго определенную роль. ГК являются эффективными комплексообразователями, стимуляторами роста растений и животных, источником широкого набора биологически активных веществ. Основной показатель плодородия почвы - содержание гумуса, важнейшей составной части ее органического вещества. Гуминовые вещества, имея уникальный химический состав, являются мощными катализаторами биохимических процессов, протекающих в почве, ее физиологической активности, способствуют росту, численности споровых бактерий, плесневых грибов, актиномицетов, целлюлозных бактерий, повышают адсорбционную способность почвы по отношению к тяжелым металлам, радионуклидам, пестицидам, температуру и увлажненность почв. Весьма перспективным для производства гуминовых удобрений, а также гуминовых препаратов (ГП) с широким спектром физико-химических и биологических свойств является привлечение торфов, запасы которых в РФ составляют 40% от мировых (150 млн.га или 190 млрд. т.).
Торфяные гуминовые удобрения и препараты на их основе ускоряют рост растений, сокращают период их развития, повышают урожайность, активизируют процессы синтеза белковых и фосфоросодержащих соединений, углеводов, дыхания и размножения клеток, накопления биомассы за счет интенсивного использования питательных элементов; положительно влияют на состояние животных, увеличивая их привесы и плодовитость, оказывают значительный эффект на размножение и рост белковых дрожжей. Многосторонняя физиологическая активность препаратов на основе органического вещества торфа позволяет успешно использовать их в самых различных областях: сельское хозяйство, животноводство, рыбоводство, птицеводство, медицина, техника. Основу органического вещества торфа составляют ГК (до 80 мае. %), в которых сконцентрирован широкий набор индивидуальных соединений. Их природное сочетание и определяет высокую физиологическую активность и сорбционную способность по отношению к различным металлам исходных торфов и препаратов на основе торфа.
На сегодняшний день отсутствуют общепризнанные теории, объясняющие механизм действия ГК, что обусловлено ограниченностью сведений об их химическом составе. Остается невыясненным, какие фрагменты в структуре ГК, кроме активных кислых групп, оказывают влияние на их биологическую активность. Обострение экологической обстановки, необходимость производства чистой сельскохозяйственной продукции ставят задачу поиска природных биологически активных соединений и сорбентов. В связи с этим становится необходимым создание среднестатистической структурной модели ГК торфа, отражающей основные особенности их химического
строения с привлечением современных физико-химических методов анализа. На первый план выходит проблема изучения химического состава ГК, повышения их биологической и сорбциошюй активности методами химической модификации, непосредственного тестирования каждого полученного препарата, установление взаимосвязи функционального состава с их свойствами. В связи с этим разработка новых способов целенаправленной модификации торфяных ГК и изучение зависимости их свойств от химического состава для создания научных основ современных процессов получения ГП и повышения эффективности их действия, представляет не только практическое, но и теоретическое значение.
Актуальность исследования. Торф - уникальное природное образование, его свойства привлекают внимание исследователей разных стран. В России сосредоточено 40% мировых запасов торфа, поэтому весьма актуальным является вопрос о его эффективном комплексном использовании. По запасам торфа в Центральной России лидирует Тверская область, где в последнее время наблюдается экономический подъем торфодобывающей отрасли, что позволит обеспечить гуми-новыми материалами близлежащие регионы.
Как известно, ГК, являющиеся по своей природе полифункциональными высокомолекулярными органическими соединениями, обладающие биологической активностью и сорбционной способностью, используются в сельском хозяйстве, ветеринарии, фармакологии, экологии. Однако, несмотря на широкое их применение, ещё недостаточно изучены структура и химический состав ГК, не установлены количественные зависимости между такими свойствами ГК как биологическая активность, сорбционная способность и их структурой. Известно, что биологическая активность ГК зависит от содержания карбоксильных групп, фенольных гидроксилов. Введение в структуру ГК отсутствующих в них галогенов (бром и йод), важных для живых организмов, позволило бы расширить сферы их применения, а повышение биологической активности привело к сокращению расхода гуминовых препаратов (ГП). Исследования в этом направлении проводятся, однако, иногда условия превращений слишком жесткие, что приводит к расщеплению структуры исходных ГК.
В связи с этим представляется актуальным проведение исследований по химической модификации ГК торфяного происхождения в относительно мягких условиях с использованием реагентов, улучшающих их разносторонние свойства и расширяющих спектр применения ГК, установление связи между их химическим строением и свойствами.
Исследования являлись составной частью НИР, проводимой в НИ РХТУ им. Д.И. Менделеева с 1997 г. в соответствии с Государственной научно-технической программой «Наукоемкие химические технологии» и научным направлением кафедры химии и технологии основного органического и нефтехимического синтеза НИ РХТУ «Поиск новых синтетических и природных биологически активных соединений».
Цель работы Определение принципиальной возможности получения модифицированных ГП на основе торфяных ГК путем их химической модификации с сохранением основной структуры с целью повышения их биологической и сорбционной активности и расширения областей применения; выявление характера общих закономерностей связи молекулярной структуры ГК с их биологической и сорбционной активностью на примере торфяных ГК.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
Выбор методов химической модификации ГК.
Разработка методов синтеза, выбор условий получения ГП и их анализ для выявления изменений в структуре ГК.
Установление основных закономерностей протекания процессов синтеза ГП.
Предположение структурной модели торфяных ГК, учитывающей основные особенности их химического строения.
Проведение биологического тестирования ГП.
- Оценка сорбционной способности ГП.
Научная новизна:
Предложена иллюстративная модель структурной единицы ГК торфа, полученная на основе экспериментальных данных о составе и строении.
Разработаны новые и использованы традиционные методы направленной химической модификации, позволяющие для усиления заданных свойств изменять функциональный состав исходных ГК при практически постоянной молекулярной массе, избегая деструкции. Применен комплекс методов, включающий восстановление хлоридом олова (II) в щелочной среде, тетрагидро-боратом натрия; карбоксилирование; гидробромирование; ацилирование хлорангидридом индо-лил-3-уксусной кислоты, дающий возможность увеличить количество фенольных и карбоксильных групп и ввести в структуру ГК фрагменты, повышающие их ростостимулирующее действие (атомы брома и индольные циклы) для увеличения биологической активности.
Впервые проведена модификация ГК 1,3-дикарбонильным соединением с предварительным хлорметилированием для увеличения их сорбционных свойств.
Практическая значимость работы:
Разработанные методики направленной химической модификации ГК позволяют сформулировать основные принципы получения высокоэффективных ГП улучшенного качества. Экспериментально подтверждена ответственность отдельных функциональных групп, присутствующих в составе ГК за их биологическую активность и сорбционную способность.
Показано усиление ростостимулирующей активности ГП в отношении микроорганизмов дрожжей, семян растений по сравнению с ГК.
Установлено, что синтезированные ГП обладают антибактериальной активностью в отношении ряда микроорганизмов (Е. coli, St. aureus, С. Diphtheria, грибов Candida, S. Enteritidis). Это позволяет рекомендовать их для использования в качестве питательных сред и селективных добавок в них для выращивания отдельных видов бактерий, а также в перспективе для лечения стафилококковых инфекций и стафилококкового бактерионосительства у людей.
Показано, что ГП с повышенной сорбционной способностью могут быть применены в качестве сорбентов тяжелых металлов для очистки промышленных стоков химических производств.
Разработан комплекс методов химической модификации торфяных ГК для исследования структуры и свойств твердых горючих ископаемых.
Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на научно-технических конференциях молодых ученых и аспирантов, конференциях профессорско-преподавательского состава НИ РХТУ им Д.И. Менделеева (г.Новомосковск, 2002-2005); конференциях «Успехи в химии и химической технологии» (г.Москва, 2003, 2005); Международной научно-практической конференции «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промьшшенности» (г.Санкт-Петербург, 2005).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 научные статьи и тезисы 6 докладов.
Химическая модификация гуминовых кислот
Окисление углей азотной кислотой при температуре 110С в течение 48 ч [92] привело к получению смеси бензолкарбоновых кислот и нитрофенолов в количестве до 20%. Таким образом, при проведении окисления в жёстких условиях наряду с нитрованием наблюдается деструкция ГК.
Замечено, что после проведения обработки ГК азотной кислотой часть продуктов нитрования приобретает способность растворяться в воде и азотной кислоте [93]. Авторы объясняют это увеличением числа карбоксильных групп.
При проведении нитрования с целью получения ГП с максимальным содержанием азота [94], в качестве реагента использовали нитрующую смесь. При этом у модифицированных препаратов содержание гидроксогрупп возрастало на 10%, а максимальное количество азота составило 3,54 %.
Авторами [95] проведено окисление иркутских сапропелитов и бурых углей азотной кислотой. Выявлено, что часть органического вещества сапропелита, подверженная окислительной деструкции в мягких условиях, представлена очень однородными полиметиленовыми структурами. Для окисления органического вещества бурого угля требуются более жёсткие условия, так как для буроугольных ГК характерно наличие конденсированных циклических структур разной степени ароматичности, замещённых короткими углеводородными радикалами и функциональными группами. Окислению, в основном, подвергались бурые угли или выделенные из них ГК. Работ по окислению торфяных ГК значительно меньше.
Модификацию торфяных [96-98] и буроугольных [99-103] ГК проводили с целью увеличения их биологической активности. Их обрабатывали азотной кислотой разной концентрации (от 0,5 до 56 % мае.) в течение 0,5 - 6 ч. в диапазоне температур 20 - 80С. Изучение влияния параметров процесса показало активную окисляющую роль азотной кислоты, что привело к снижению молекулярной массы образующихся ГП и увеличению содержания в них фенольных, хиноидных, карбоксильных групп, а, как следствие, - повышению биологической активности полученных препаратов.
Другим реагентом, используемым для окисления ГК, является пероксид водорода, обладающий более мягким действием по сравнению с азотной кислотой.
Авторы [13,104, 105] окисляли торфяные ГК пероксидом водорода в щелочной среде. Показано, что в результате окисления происходит деструкция молекул с уменьшением систем полисопряжения и образованием низкомолекулярных водорастворимых продуктов. Сравнение химической структуры и физико-химических свойств ФК и водорастворимых веществ гумусовой природы позволило найти принципиальные отличия строения их систем ароматического полисопряжения. Сделан вывод, что до выделения из торфа ФК могут быть связаны с ГК посредством сложно-эфирных связей. Нагревание продуктов окисления ГК до 100С в течение 1-4 ч. приводит к конденсационным процессам с образованием новых высокомолекулярных веществ.
В работе [97] показана возможность использования пероксида водорода для получения модифицированных ГП, которые обладают повышенной биологической активностью, что коррелирует с числом кислородсодержащих функциональных групп и молекулярной массой.
Торфяной ГП, отличающийся способностью ингибировать рост фитопатогенных грибов, получали методом пероксиднощелочиого гидролиза в присутствии катализатора [106]. Для увеличения его фунгицидной способности его модифицировали микроколичествами солей цинка, меди, железа совместно с марганцем.
Таким образом, окисление, как метод химической модификации ГК используется давно, и преследует различные цели: увеличение выхода ГК, определение структурных фрагментов, составляющих их структуру, повышение биологической и физиологической активности препаратов на их основе. Однако, Дашицыреновой А.Д. [107] высказано предположение, что метод окисления, повышая выход ГК, ухудшает их целевое качество (физиологическую активность), в первую очередь, за счет нитрования ароматического кольца и алкилирования ароматических гидроксильных групп. Предложено для повышения выхода ГК использовать механоактивацию каустобиолитов.
Весьма распространенным методом модификации ГК является галогенирование. Описаны эксперименты по хлорированию, йодированию и бромированию торфа, бурых углей и извлечённых из них ГК. При галогенироваиии, как и следовало ожидать, происходит глубокий распад твёрдых каустобиолитов, разрушение их химической структуры, вследствие чего невозможно выделение химически неизменных органических составляющих [108].
Хлорирование торфяных ГК в виде взвеси в растворе хлора в четырёххлористом углероде приводит к повышению содержания хлора до 17%, тогда как количество кислородсодержащих групп увеличивается незначительно [\Щ.[ A J1 -1 ї Анализ исследований по хлорированию торфов и углей привёл Лазарова Л. и Ангелову Г. [ПО] к выводам, что угли содержат значительное количество сорбированного хлористого водорода, который можно отделить промывкой водой или дегазированием при высокой температуре; хлорированный уголь содержит хлор с различной прочностью связи. Отмечено, что глубина хлорирования и увеличение растворимости продуктов хлорирования возрастают в присутствии катализатора - кислоты Льюиса - SbCb. Очевидно, хлор замещает водород в ароматических циклах.
Описана реакция ГК с хлорноватистой кислотой [111] в присутствии аммонийного иона. Продуктом реакции является хлористый цианид, выход которого увеличивался при увеличении количества добавляемой хлорноватистой кислоты, максимальный выход наблюдался при соотношении аммонийного иона и хлорноватистой кислоты в водной смеси 2:3. Поскольку аммонийный ион и ГК обычно содержатся в природных водах, образование хлористого цианида наблюдалось в пробах сырой воды при добавлении одной хлорноватистой кислоты.
В работе [112] представлены результаты исследований, проводившихся с целью определения промежуточных продуктов, образующихся при реакции хлора и ГК в водной среде при величине рН=7,2. Установлено, что взаимодействие хлора и ГК в этих условиях приводит к образованию ряда соединений, которые могут рассматриваться как исходные для образования хлороформа и бутандиовой кислоты. При высоких дозах хлора обнаружено образование большого количества новых соединений, в том числе хлорзамещё нных ароматических кислот. При низких дозах хлора образуется ряд соединений, содержащих трихлорметильную группу. Эти соединения могут превращаться в хлороформ и бутандиовую кислоту путём реакций окисления и гидролиза.
Японскими авторами [113] исследовано влияние длительности реакции хлорирования ГК и кислотности среды на образование ди- и трихлоруксусньгх кислот, хлороформа. Показано, что конкурирующее образование трихлоруксусной кислоты и хлороформа зависит от кислотности среды.
Ещё в конце XIX в. Фишер [114] установил, что угли при взаимодействии с бромом вступают в реакции как присоединения брома, так и замещения водорода на бром, у окисленных углей реакционная способность в этих процессах значительно ниже. Кроме реакций присоединения и замещения водорода, имеет место дегидрирование, которое особенно активно протекает при повышении температуры.
Исследователи [115] проводили хлорирование ГК в присутствии различных количеств брома. В выделенных продуктах реакции методом газожидкостной хроматографии совместно с масс-спектроскопией идентифицированы тригалогенметаны.
Модификацию торфяных и буроугольных ГК методами хлорирования, бромирования и йодирования растворами галогена в четырсххлористом углероде проводили для увеличения физиологической активности ГК [116-118]. Наиболее реакционноспособными оказались торфяные ГК. Максимальное содержание хлора, брома и йода в них составило 11,1; 19,6 и 2,23 % мае, соответственно. Замечено, что увеличение температуры процесса и времени галогенирования значительно повышает содержание фенольньгх и хиноидных групп, что можно объяснить окисляющим действием галогена, число карбоксильных групп незначительно снижается. Содержание двойных связей в модифицированных ГК резко снижается и доходит до нуля уже при времени реакции более 2 ч, что, несомненно, указывает на присоединение галогенов по ненасыщенным участкам макромолекул. По сравнению с хлором и бромом, внедрение йода в молекулу ГК весьма несущественно, причём повышение времени йодирования до 15 ч вызывает уменьшение содержания его доли в ГП. Испытание на физиологическую активность показало, что она наибольшая у йодированных препаратов, несмотря на невысокую массовую долю йода в модифицированных ГП.
Определение сорбционной способности гуминовых препаратов по отношению к ионам тяжелых металлов
Структурно-групповой анализ торфа проводили для определения содержания в торфе битумов, водорастворимых и легкогидролизуемьгх веществ, ГК, ФК, целлюлозы, лигнина последовательной обработкой навески сухого торфа бензолом (извлечение липидов); 2%-ной соляной кислотой (извлечение моно- и полисахаридов); 1%-ным раствором NaOH (извлечение ГК); 80%-ной серной кислотой (гидролиз целлюлозы до глюкозы); негидролизуемый остаток - лигнин [210].
Анализ использовался для определения содержания металлов в пробах модельных растворов и реальных стоков для выявления сорбирующей способности ГК и модифицированных препаратов на их основе. Определение тяжелых металлов в образцах проб проводится методом абсорбционной спектрометрии с пламенной атомизацией. Этот метод позволяет из одной вытяжки последовательно профотометрировать большое количество металлов при относительно низких пределах обнаружения.
Анализ проводился на атомно-абсорбционном спектрофотометре «Сатурн». В качестве детектора системы регистрации использованы фотоэлектронные умножители (ФЭУ), которые обладают достаточной чувствительностью в широкой области спектра. Для учета неселективного поглощения при определении Cd и РЬ используют дейтериевую лампу для коррекции фона.
Содержание металлов в жидких образцах рассчитывается по формуле: Х = (С,-Со)ЛУУ2,где Сі - концентрация металла в исследуемой вытяжке, найденная по калибровочному графику (мкг/см3); Со - концентрация металла в «холостой» пробе, найденная по калибровочному графику (мкг/см3); Vi - объем колбы, в которой находится проба (см3); Уг - объем жидкого образца, взятого на анализ (см3) Анализ использовался для выявления изменений сорбционной способности модифицированных ГП по сравнению с исходными ГК. Модельный раствор содержал один вид катионов.
Модельные растворы, содержащие 0,001 М соли тяжелых металлов (ZnSO,», C11SO4, MnSO.4, РЬ(КОз)2 и CdCh), перемешивали в колбах Эрленмейра с помощью магнитной мешалки в течение 6 ч с навесками ГК (ГП) массой 0,4 г. Объемы модельных растворов составляли 100 мл. Среда растворов солей - слабокислая (р№4,9-6,2). Затем осадки ГП отфильтровывались под вакуумом на фильтре Шотта, а фильтраты вышеперечисленных солей исследовали методом атомно-адсорбционной спектроскопии для установления остаточной концентрации металлов. Адсорбированное количество металла рассчитывалось по разности между концентрацией его в исходном растворе и после опыта.
ГК выделяли последовательной троекратной обработкой торфа, предварительно освобожденного от битумов, водорастворимых и легкогидролизуемых веществ, 1%-ным водным раствором щелочи (NaOH) (из расчета 150 мл щелочи на 1 г навески сухого торфа) при 90-95С в течение 1 часа. Все три порции гуматов объединяли, а остаток торфа промывали водой, промывные воды добавляли к гуматам.
Образовавшиеся гуматы натрия подкисляли 10%-ным раствором соляной кислоты (примерно 20 мл кислоты на 1 л гуматов) до сильно кислой среды на универсальную индикаторную бумагу. Выпавший осадок ГК отфильтровывали под вакуумом (возможно отделение центрифугированием) через взвешенный фильтр «синяя лента», тщательно отмывали дистиллированной водой до отрицательной реакции на хлорид-ионы, сушили в вакуумном сушильном шкафу при температуре 60-65С до постоянной массы.
При подкислении гуматов натрия 10%-ным раствором соляной кислоты до сильно кислой среды ГК выпадают в осадок, отделение которого позволяет получить раствор ФК. Далее ФК адсорбировали на смоле AD-8, промывали водой и ацетоном. Затем адсорбированные ФК растворяли 0,1 М раствором гидроксида натрия, пропускали через катионит КУ-2 в Н+-форме и высушивали в вакуумном сушильном шкафу при температуре 60-65 С до постоянной массы.
Осадок ГК, отделённый от ФК, экстрагировали в аппарате Сокслета этанолом. Из экстракта на роторном испарителе отгоняли растворитель, ГМК высушивали в вакуумном сушильном шкафу при температуре 60-65С до постоянной массы.
Молекулярная масса определялась методом криоскопии по Расту в камфаре и 2,4,6-трибромфеноле [211]. Для определения средней молекулярной массы ГК и ГП применяли сильное разбавление (в 100 раз) и тщательное растирание с камфарой или 2,4,6-трибромфенолом. Таким образом достигалась гомогенизация смеси ГП с растворителем и образование «твердого раствора». Применение метода криоскопии к определению молекулярной массы ГК показано также в [4, 49].
Следует заметить, что определенная методом криоскопии молекулярная масса ГК по результатам разных исследователей, составляет 1000-1800 [49], полученные другими способами значения молекулярной массы порядка 50-500 000 и выше объясняются их повышенной способностью к комплексообразованию и образованию линейных и глобулярных ассоциатов, которые и принимаются за молекулы [48].
Влияние продолжительности восстановления гуминовых кислот хлоридом олова (II) в щелочной среде на выход гуминовых препаратов, их структурные параметры и биологическую активность
В таблице 4.1.1.1 приведены структурные параметры и биологическая активность ГП, полученных в результате обработки ГК хлоридом олова (II) в щелочной среде. Анализ данных показывает, что при проведении реакции в контакте с воздухом происходит превращение хиноидных фрагментов молекул ГК в фенольные (содержание фенольных групп возрастает от 3,86 в исходных гуминовых кислотах до 5,12 мэкв/г при времени реакции 6 часов), одновременно снижается содержание хиноидных групп от 2,34 до 1,48 мэкв/г. При этом практически не восстанавливаются карбоксильные группы. Содержание кетонных групп уменьшается значительно (от 0,28 до 0,07 мэкв/г), они, очевидно, превращаются в спиртовые гидроксогруппы. Йодное число (показатель, характеризующий непредельность) изменяется от 0,27 до 0,20 мэкв/г, видимо за счёт частичного восстановления алифатических непредельных структурных фрагментов. Средняя молекулярная масса в ходе реакции убывает (от 1400 до 1210), причём продолжительность процесса восстановления практически не влияет на этот показатель. Очевидно, кислород воздуха способствует расщеплению структуры исходных ГК, хотя его окисляющее действие в условиях данного процесса весьма незначительно.
Тест на биологическую активность исходных ГК и восстановленных ГП дал положительный результат. Она увеличилась примерно на 14% при проведении реакции восстановления на воздухе.
Как и следовало ожидать, проведение процесса восстановления в тех же условиях в атмосфере оксида углерода (IV) не только привело к повышению эффективности восстановления хиноидных групп, но и к росту числа карбоксильных групп. Это связано с протекающим параллельно карбоксилированием ароматических ядер ГК. Фенольные гидроксилы, являющиеся электронодо-норными заместителями, облегчают протекание реакции электрофильного замещения, к которым относится карбоксилирование. Так при времени реакции 4 ч содержание фенольных групп возрастает до 5,52 (против 4,90 мэкв/г в атмосфере воздуха), в свою очередь число хиноидных групп убывает до 1,06 против 1,62 мэкв/г, а доля карбоксильных групп изменяется от 2,73 в исходных ГК до 3,42 мэкв/г. Фактор БА соответственно тоже возрос на 16 % после восстановления ГК в атмосфере оксида углерода (IV) в течение 4 ч. Атмосфера оксида углерода (IV) позволяет провести восстановление и карбоксилирование практически без изменения молекулярной массы ГК. Сред няя молекулярная масса ГП, полученных в атмосфере воздуха уменьшается, а в атмосфере СОг -возрастает, очевидно, за счёт внедрения карбоксильных групп. Выход ГП уменьшается по мере увеличения времени восстановления. Так, при времени восстановления 2 и 4 ч выход на воздухе составлял 88-89%, в атмосфере диоксида углерода - 95-96%, а при проведении процесса в течение 6 ч на воздухе выход упал до 82%, видимо, за счет увеличения количества водорастворимых фрагментов. В атмосфере диоксида углерода выход ГП выше, что можно объяснить окисляющим действием кислорода воздуха на лабильную структуру ГК и образованием некоторого количества низкомолекулярных продуктов, которые при осаждении ГП остаются в водной фазе.
Результаты изучения влияния температуры на процесс восстановления гуминовых кислот представлены в таблице 4.1.2.1. Эксперименты проводились в одинаковых условиях при температурах 20, 40 и 60С на воздухе и в атмосфере оксида углерода (IV). Повышать температуру выше 60С нежелательно, поскольку ГК не являются термически стабильными соединениями. Закономерности восстановления и карбоксилирования ГК, описанные выше, сохранились. Естественно, что по мере роста температуры, реакция восстановления была более энергична: проведение процесса при 20 С вызывает увеличение числа фенольных групп до 4,76 на воздухе и 5,31 мэкв/г в атмосфере оксида углерода (IV); а при 60 С содержание фенольных групп возрастает до 5,29 и 5,65 мэкв/г соответственно. Хиноидные группы при 20 С уменьшаются до 1,79 на воздухе и 1,10 мэкв/г в атмосфере оксида углерода (IV). Этот факт позволяет утверждать, что в атмосфере СОг реакция восстановления протекает более полно, при этом возрастает содержание карбоксильных групп на 24 % по сравнению с исходными ГК при температуре 20С, на 30% при 40С и на 41% при 60С, что указывает на протекание процесса карбоксилирования. Количество кетонных групп уменьшается, причём при 60 С они восстановились практически полностью: 0,04 мэкв/г на воздухе и полное их отсутствие в атмосфере оксида углерода (IV). Очевидно, кетонные группы восстанавливаются до спиртовых гидроксогрупп. Максимальное уменьшение йодного числа составляет 25%, что связано с восстановлением кратных связей алифатических фрагментов ГК. Значение показателя непредельности не оказывает заметного влияния на фактор БА. Наибольшая активность, испытанная дрожжевым тестом, характерна для ГП с максимальным содержанием фенольных и карбоксильных групп, то есть, полученных в условиях восстановления при 60С на воздухе и в атмосфере диоксида углерода. В то же время низкая термостабильность ГК отражается на молекулярной массе ГП: при проведении реакции в контакте с воздухом она убывает до 1090 при 60 С и даже в атмосфере оксида углерода (IV) - до 1140 при 60 С. На деструкцию ГК указывает и низкий выход ГП при поведении процесса при 60 С - 76% на воздухе и 80% - в атмосфере оксида углерода (IV). Очевидно, для получения оптимального результата по БА при сохранении средней молекулярной массы, восстановление надо проводить в диапазоне от 20 до 40 С и желательно в атмосфере оксида углерода (IV).
Показано, что увеличение концентрации восстановителя свыше соотношения ГК/8пСІ2=5/1 незначительно влияет на функциональный состав ГП. Так, содержание фенольных групп при обработке SnCb в щелочной среде при массовом соотношении rK/SnCb=10/l составляет 4,22 мэкв/г, при массовом соотношении 5/1 - 4,70 мэкв/г, а при увеличении массы восстановителя в 10 раз относительно начального, оно составляет 4,83 мэкв/г. Содержание хиноидных групп в последнем случае уменьшается за счёт восстановления от 2,00 до 1,70 мэкв/г; кетонных групп - от 0,26 до 0,16 мэкв/г, доля карбоксильных групп и йодное число остаются практически неизменными. Мо пекулярная масса ГП понизилась до 1230, то есть на 12 % от средней молекулярной массы исходных ГК.
Увеличение содержания фенольных групп, понижение молекулярной массы ГП вызывает рост их биостимулирующей активности, которая возросла на 11,3 % по сравнению с контролем (
Влияние температуры обработки гуминовых кислот бромоводородной кисло той на выход гуминовых препаратов, их структурные параметры и биологическую активность
Показано, что гуматы модифицированных ГП обладают более высокой БА, чем исходных ГК во всех случаях и, за некоторым исключением, чем чистый гетероауксин. Проявленная активность препаратов, безусловно, зависит от способа химической модификации исходных ГК. Сравнивая препараты, восстановленные гидроксостаннитом и тетрагидроборатом натрия в среде диоксида углерода, можно заметить, что наибольшие абсолютные величины значений физиологических параметров роста характерны для ГП, восстановленного тетрагидроборатом натрия, что согласуется с различием в функциональном составе этих препаратов: ГП (№5) более обогащен фе-нольными и карбоксильными группами, чем ГП (№4). Ещё большей эффективностью обладает ГП, полученный гидробромированием в среде аргона, очевидно из-за присутствия необходимого для жизнедеятельности живых организмов микроэлемента - брома. Самой высокой БА обладают ГП, модифицированные ацилированием производным индола. Несколько неожиданным явился факт, что индолсодержащие ГП в концентрации 0,001 мае. % обладают большей БА, чем чистый гетероауксин. Наилучшие результаты по приросту показателей величины корня, стебля и листьев относительно контроля (дистиллированной воды) получены для индолсодержащего ГП (№7), синтезированного в условиях эксперимента 5 (табл. 4.6.1), что согласуется и с результатами элементного анализа (табл. 4.6.2). Для этого препарата прирост длины корня относительно контроля составляет 51%; стебля - 87%; листьев - 52%.
Для выявления влияния модифицированных ГП на дальнейший рост и развитие огурцов сорта «Нежинский» 9-суточные проростки семян, культивированные в вышеописанных средах, высаживают в почвогрунт, предназначенный выращивания рассады, в пластиковые горшки диаметром 90 мм. Каждые 3-4 дня растения поливают соответствующим раствором (см. примечание к табл. 4.8.1). По истечении 40 суток у растений производят замер длины корневой системы и стеблей; массы корневой системы, стебля и листьев. И в этом случае наибольшей активностью характеризуются индолсодержащие препараты, из которых максимальный эффект обнаружен для пре парата, полученного в условиях синтеза 5 (табл. 4.6.1). Длина корня растения, обработанного раствором натриевой соли этого ГП увеличилась в 4,2 раза; стебля - 1,9 раза; массы корня - 4,7 раз; стебля - 4,9 раза; листьев - 3,5 раза по сравнению с растением, которое поливали дистиллированной водой.
Таким образом, результаты эксперимента по химической модификации торфяных ГК показали, что увеличение содержания фенольных групп в структуре ГК положительно влияет на их БА. Рост числа фенольных гидроксилов ка примерно на 50% позволяет на 23,6 %повысить БА синтезированных препаратов, испытанную дрожжевым тестом. Для процессов восстановления хи-ноидных фрагментов ГК в фенольные эффективными являются селективные восстановители -хлорид олова (II) в щелочной среде и тетрагидроборат натрия. При использовании этих восстановителей карбоксильные группы исходных ГК практически не восстанавливаются.
Выполнено карбоксилирование исходных ГК и восстановленных ГП, сделана попытка совмещения процессов восстановления и карбоксилирования в одной стадии синтеза. Установлено, что карбоксилирование предварительно восстановленных ГП более эффективно, чем совмещение этих процессов в одной стадии, и позволяет увеличить количество карбоксильных групп в 1,5 раза для случая восстановленных тетрагидроборатом натрия ГП, что приводит к увеличению биологической активности, определенной дрожжевым тестом, на 11,3 % по сравнению с исходными гуми-новыми кислотами. На основании анализа экспериментальных данных выбраны условия осуществления этих процессов: - при восстановлении хлоридом олова (II): продолжительность процесса -2 ч, температура - 20-40 С, массовое соотношение ГК/SnCb = 2/1; - при восстановлении тетрагидроборатом натрия: продолжительность процесса 1 ч, массовое соотношение TK/NaBHt = 10/3, температура процесса 25С.
Увеличения содержания фенольных гидроксилов, формирующих уровень БА синтезированных ГП, удается достичь путем обработки исходных ГК бромоводородной кислотой. При этом в структуру ГК внедряются атомы брома, максимальное содержание которого составляет 2,63 %мас. На основании анализа экспериментальных данных выбраны условия проведения этого процесса: концентрация НВг - 40%, время обработки 0,5-1 ч при температуре 20С в атмосфере инертного газа аргона. В этих условиях наблюдается повьшіение уровня БА полученных ГП при испытании дрожжевым тестом на 18 % при практически неизменном значении молекулярной массы.
Введение 1,3-дикарбонильного соединения в структуру предварительно хлорметилирован-ных ГП увеличивает содержание кетонных групп в 2,7 раза по сравнению с исходными ГК. Установлено, что данная модификация ГК приводит к увеличению сорбционньк свойств полученных
ГП. Выявлено, что наилучший результат получен при использовании хлорида цинка в качестве катализатора реакции хлорметилирования ГК в течение 7 ч. Проведено испытание полученных препаратов на растворах солей тяжелых металлов. Сорбционная емкость, определённая в статиче-ских условиях, по отношению к катионам РЬ , Си , Cd , Zn составила, соответственно 99,5; 90,4; 90,6 и 92,1 %. Проведены эксперименты по очистке реальных стоков ОАО «НАК «Азот».
Выполнено биологическое тестирование полученных ГП с использованием микроорганизмов дрожжей, а также бактерий Е. coli, St. aureus, С. Diphtheria, дрожжеподобных грибов рода Candida, S. Enteritidis. Выявлено, что более выраженной БА обладают препараты, характеризующиеся высоким содержанием фенольных и карбоксильных групп. Максимальным ингибирующим действием на бактерии обладает индолсодержащий гуминовый препарат, при введении которого в питательные среды угнетается рост золотистого стафилококка, кишечной палочки и грибов Candida. Это свойство данного препарата дает перспективы практического использования его в системе здравоохранения для санации стафилококкового бактерионосительства у людей и лечения стафилококковых инфекций.
Выявлено стимулирующее влияние гуминовых препаратов, модифицированных восстановлением, карбоксилированием, гидробромированием и введением индолсодержащих фрагментов на рост и развитие растительных организмов на примере семян огурцов.
