Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Основные микробиологические пороки, возникающие в процессе созревания твердых сыров 12
1.2. Мицелиальные грибы - инициаторы микробной порчи поверхности твердых сыров 15
1.3. Микотоксины мицелиальных грибов,
поражающих поверхность твердых сыров 19
1.4. Проблема бактериофагии в сыроделии 21
1.5. Способы и средства антимикробной
защиты поверхности твердых сыров 23
1.5.1. Физические методы обеззараживания и защиты поверхности твердых сыров 24
1.5.2. Химические средства для защиты поверхности твердых сыров 27
а) Дезинфицирующие средства 27
б) Антимикробные вещества, используемые для непосредственной защиты поверхности твердых сыров 29
1.5.3. Биологические методы защиты поверхности твердых сыров 33
1.6. Применение полимерных покрытий в технологии твердых сыров 37
1.7. Состояние и перспективы использования в пищевой
индустрии защитной упаковки на основе биополимеров 39
1.8. Хитозан - как основа для получения защитных покрытий 43
Заключение к литературному обзору 48
Глава 2. Организация эксперимента. объекты и методы исследования 49
2.1. Схема эксперимента 49
2.2. Объекты исследования 49
2.3. Состав используемых питательных сред
для выделения микроорганизмов 53
2.3.1. Для выделения и идентификации мицелиальных грибов 53
2.3.2. Для выделения бактериофагов и культивирования молочнокислых бактерий 54
2.4. Методы исследования 54
2.4.1. Методы выделения и идентификации мицелиальных грибов 54
2.4.2. Определение микробной обсемененности методом «смывов» 55
2.4.3. Определение микробной обсемененности воздуха в производственных помещениях сыродельных предприятий 55
2.4.4. Изучение фунгицидной активности методом «аппликаций» 55
2.4.5. Определение фунгицидной активности методом «капель» 56
2.4.6. Микроскопия мицелиальных грибов на поверхности сыра 56
2.4.7. Методы исследования бактериофагов 57
2.4.8. Методы исследования пленок 59
2.4.8.1. Определение паропроницаемости 59
2.4.8.2. Деформационно-прочностные характеристики 59
2.4.8.3. Стойкость пленок к проколу 59
2.4.8.4. Изменение массы пленок при контакте с водой 59
2.4.8.5. Определение поверхностной энергии пленок 59
2.4.8.6. Определение газопроницаемости 59
2.4.8.7. Исследование структуры пленок методом электронной микроскопии 60
2.4.9. Физико-химические методы исследования 60
2.4.9.1. Определение активной кислотности 60
2.4.9.2. Определение массовой доли влаги 60
2.4.9.3. Определение степени зрелости сыра 60
2.4.10. Методы исследования липидов твердых сыров 61
2.4.10.1. Определение массовой доли жира 61
2.4.10.2. Определение кислотного и перекисного чисел 61
2.4.10.3. Получение метиловых эфиров жирных кислот 61
2.4.10.4. ГЖХ-исследования 61
2.4.11. Исследование аминокислотного состава 62
2.4.12. Изучение структурно-механических показателей 62
2.4.13. Определение органолептической оценки сыров 63
2.4.14. Определение экономической эффективности 63
2.4.15. Статистическая обработка экспериментальных данных 63
Глава 3. Результаты исследования видового состава мицелиальных грибов и характера поражения ими поверхности твердых сыров в период созревания 64
3.1. Выделение мицелиальных грибов, доминирующих на поверхности твердых сыров и в воздухе сыродельных предприятий 64
3.2. Идентификация выделенных штаммов мицелиальных грибов 67
3.3. Изучение характера поражения поверхности твердых сыров мицелиальными грибами 73
Глава 4. Исследование фунгицидной и антифаговой активности современных дезинфицирующих препаратов 80
Глава 5. Разработка антимикробного состава «хит-асеп» на основе хитозана, предназначенного для формирования защитного покрытия на поверхности твердых сыров 87
Глава 6. Исследование структуры и эксплуатационных характеристик защитных покрытий на основе хитозана 98
Глава 7. Исследование показателей качества твердых сыров в процессе созревания с использованием защитного Покрытия «хит-асепт» по
Выводы 137
Список использованной литературы
- Мицелиальные грибы - инициаторы микробной порчи поверхности твердых сыров
- Химические средства для защиты поверхности твердых сыров
- Для выделения и идентификации мицелиальных грибов
- Изучение характера поражения поверхности твердых сыров мицелиальными грибами
Введение к работе
Актуальность работы. Анализ тенденций развития молочной и сыродельной отраслей России за последнее время показывает абсолютный рост производства и потребления отечественной продукции.
Твердые сыры являются полноценными продуктами, содержащими важнейшие и незаменимые для человека нутриенты. Однако в процессе выработки и созревания сыры могут поражаться различными нежелательными микроорганизмами, такими как плесневые грибы, дрожжи, бактериофаги и др., которые приводят к нарушению технологических процессов производства и порче готовой продукции.
Ведущая роль в поражении поверхности продуктов питания и пищевого сырья принадлежит плесневым грибам. Именно эти микроорганизмы ухудшают товарный вид продукции, снижают её вкусовые качества, вызывают изменения белков, жиров, продуцируют высокотоксичные вещества, представляющие угрозу для здоровья людей. Развиваясь на поверхности твердых сыров, плесневые грибы могут поражать продукт по всей его массе, что приводит к большим потерям - до 15 - 20 % высокоценного продукта.
Поиск прогрессивных способов ухода за сыром в период созревания постоянно интересует отечественных и зарубежных исследователей. Этой проблеме посвящены работы СМ. Баркана, З.Х. Диланяна, З.С. Соколовой, Б.Г. Миргородского, В.Е. Гуля, Г.Г. Шилера, И.С. Бубличенко, А.Г. Снежко, Л.И. Лакомовой, В.В. Ткаченко, Р.И. Раманаускаса, Massa С.С. и многих других.
"Для защиты поверхности сыров чаще всего применяют полимерные покрытия или пленки, а также разнообразные антимикробные препараты, содержащие в своем составе антибиотики или химические консерванты. Однако в случае их использования необходимо строго контролировать уровень перехода в продукт этих химических веществ, а также продуктов деструкции полимеров.
В настоящее время во всем мире большое значение уделяется созданию принципиально новых защитных покрытий на основе биополимеров, способ-
ных обеспечить эффективную защиту продуктов питания от микробных поражений и воздействия кислорода воздуха, предотвратить их усушку в процессе производства и хранения. В этом отношении заслуживают внимания упаковочные пленки и покрытия на основе хитозана, который считают перспективным биоматериалом будущего. Интерес к хитозану в пищевой промышленности связан не только с такими его уникальными физиологическими и экологическими свойствами, как биосовместимость, биодеструкция, способность к селективному связыванию тяжелых металлов, но и с его полным соответствием современным требованиям, предъявляемым к пищевым добавкам.
Цель и задачи исследований. Целью работы являлась разработка защитного покрытия на основе хитозана, предназначенного для пролонгированной антимикробной защиты поверхности твердых сыров в период созревания.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
выделить и идентифицировать штаммы мицелиальных грибов, инициирующих порчу поверхности твердых сыров и присутствующих в воздухе современных сыродельных предприятий;
изучить механизмы поражения поверхности твердых сыров мицели-альными грибами в период созревания;
исследовать фунгицидные и антифаговые свойства современных дезинфицирующих средств, рекомендуемых для применения в молочной промышленности;
разработать антимикробный состав на основе хитозана, предназначенный для формирования защитного покрытия на поверхности' твердых сыров перед созреванием;
изучить структурные и эксплуатационные характеристики разработанного защитного покрытия на основе хитозана;
провести сравнительные исследования показателей качества твердых сыров в процессе созревания без использования и с использованием разработанного защитного покрытия;
разработать проект нормативной документации на антимикробный состав на основе хитозана для защиты поверхности твердых сыров;
определить экономический эффект от использования разработанного защитного покрытия в технологии твердых сыров.
Научная новизна работы. Разработан способ модификации хитозана, позволяющий получить антимикробный состав «Хит-Асепт», предназначенный для формирования защитного покрытия на поверхности твердых сыров перед созреванием. Показано, что разработанный состав обладает фунгицид-ной и антифаговой активностью пролонгированного действия.
На основании исследования физико-механических, физико-химических, микробиологических свойств и структуры модифицированных пленок на основе 1% хитозана показана возможность их использования для защиты поверхности твердых сыров в период созревания.
Установлено, что разработанное покрытие не оказывает влияния на процесс созревания твердых сыров и надежно защищает их поверхность от поражения мицелиальными грибами в период созревания. Показано, что покрытие «Хит-Асепт» предупреждает окислительную порчу липидов в поверхностном слое твердых сыров и способствует сохранению в их составе эссен-циальных полиненасыщенных жирных кислот.
На основании исследования состава микрофлоры современных сыродельных предприятий выделены и идентифицированы 16 штаммов мицели-альных грибов, поражающих поверхность твердых сыров и присутствующих в воздухе производственных помещений. Показано, что доминирующим видом в составе плесневых грибов, контаминирующих поверхность твердых сыров, является Penicillium roquefortii.
Выявлены два вида поражения твердых сыров обсеменяющими поверхность изолятами грибов рода Penicillium: «стелящийся» и «буравящий».
На основании результатов сравнительной оценки фунгицидных и антифаговых свойств ряда современных дезинфицирующих средств показано, что препараты «Полисепт-ОП», «БИОР-1», «Фармадез», «Абсолюцид»
обладают фунгицидной активностью в отношении выделенных штаммов грибов. Установлено, что дезинфицирующие средства «Дез-яхонт», «Септабик», «БИОР-1», «Полисепт-ОП», «Аламинол» обладают антифаговым действием против бактериофага Ть антисептики «Абсолюцид», «Аламинол», «Сандим-Д» и «Бриллиант» более активны против бактериофага U33A.
Практическая значимость работы. Создана коллекция мицелиальных грибов, инициирующих порчу поверхности твердых сыров и присутствующих в воздухе производственных помещений сыродельных предприятий. Эта коллекция включает следующие штаммы мицелиальных грибов: Penicillium аи-rantiogriseum BKM FW-3056; Penicillium roquefortii BKM FW-3057; Penicillium roquefortii BKM FW-3071; Penicillium verrucosum BKM FW-3089; Penicillium aurantiogriseum BKM FW-3090; Penicillium roquefortii BKM FW-3087; Penicillium chrysogenum BKM FW-3088; Penicillium roquefortii BKM FW-3072; Penicillium expansum BKM FW-3073; Penicillium expansum BKM FW-3074; Penicillium expansum BKM FW-3075; Penicillium verrucosum BKM FW-3076; Penicillium roquefortii BKM FW-3077; Penicillium citrinum BKM F-3942; Geotrichum candidum BKM FW-3078. Культуры приняты для хранения и использования во Всероссийскую коллекцию микроорганизмов ИБФМ РАН.
Определена рациональная концентрация сорбата калия в составе покрытия на основе хитозана, обеспечивающая надежную антимикробную защиту поверхности твердых сыров в период созревания.
Предложена технологическая схема получения и применения покрытия на основе хитозана для защиты поверхности твердых сыров в период созревания.
Разработан проект НД (технические условия и инструкция по применению) на состав антимикробный «Хит-Асепт» на основе хитозана, предназначенный для формирования защитного покрытия на поверхности твердых сыров.
На основании промышленной выработки сыров в ООО «Боголюбовские сыры» показана целесообразность использования защитного покрытия «Хит-
Асепт» в процессе созревания твердых сыров, что подтверждено актом производственных испытаний.
Результаты исследования фунгицидной и антифаговой активности изученных дезинфицирующих средств внедрены в ООО «Боголюбовские сыры».
Определен экономический эффект от использования защитного покрытия в технологии твердых сыров, который составляет 4733,3 тыс. руб. в год.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы докладывались и обсуждались на Международных научных конференциях «Живые системы и биологическая безопасность населения» (М., 2004, 2005, 2006, 2007); Международной научной конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 140-летию РГАУ - МСХА им. К.А. Тимирязева (М., 2005); на III Съезде общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (М., 2005); на Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (М., 2005, 2007, 2008); Пятом Всероссийском конгрессе по медицинской микологии (М., 2007).
Результаты работы и защитное покрытие экспонировались на Международном конкурсе молодых ученых, проходившем в рамках Четвертого Международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (М., 2007); специализированной выставке «Мир биотехнологии 2008», проходившей в рамках Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (М., 2008); 8-ом Московском международном салоне инноваций и инвестиций (М., 2008).
Результаты работы награждены грамотой 4-ой Международной научной конференции «Живые системы и биологическая безопасность населения» (М., 2004); дипломом и золотой медалью IV-ro Московского Международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (М., 2007) (приложение № 10, № 11).
Работа выполнялась при поддержке гранта РФФИ - офи - а № 07-04-12005.
Мицелиальные грибы - инициаторы микробной порчи поверхности твердых сыров
Качественный и количественный состав микроорганизмов, контамини-рующих поверхность твердых сыров в период созревания и последующего хранения весьма разнообразен и зависит от многих факторов [24, 64, 106].
При созревании сыра в условиях повышенной влажности воздуха на поверхности сырных головок наблюдается обильный рост санитарно-неблагоприятной микрофлоры, что требует частой мойки и зачистки поверхности продукта, приводящих к довольно существенным потерям ценной белковой массы (до 15-20 %). Такие режимы созревания очень благоприятны для развития психрофильных микроорганизмов, в частности для мицелиаль -ных грибов, дрожжей и другой гнилостной микрофлоры [24, 49]. Также на размножение микроорганизмов на поверхности сыров влияют содержание влаги, активность воды, окислительно-восстановительный потенциал, значение рН, содержание соли [148, 166, 205].
В результате исследования микробной обсемененности поверхности твердых сыров во время созревания, а также стен камер, системы кондиционирования и воздуха в производственных помещениях сыродельного завода было выделено 640 изолятов мицелиальных грибов. Из них к роду Penicillium принадлежали 71%, Aspergillus - 15%, Trichoderma — 6%, Cladosporium - 4%, Mucor — 3%, Chrysosporium pannorum — 1% [11]
Анализ состава микроорганизмов в атмосфере производственных помещений Углического сыродельного завода, выполненный в разное время года, показал, что общее количество микроорганизмов, а также плесневых грибов во всех помещениях летом в полтора раза было выше, чем зимой [126]. Максимум бактериальной популяции наблюдался в сыродельном цехе, а в камерах созревания сыров преобладали плесневые грибы (табл. 1) [126]. Установлено также, что грибы рода Penicillium доминировали во всех производственных помещениях сыродельного завода. Наряду с ними в прессовальном отделении и в камерах созревания сыров были выделены также ги-фомицеты родов Aspergillus, Geotrichum, Cladosporium [126].
Результаты определения состава микроорганизмов, поражающих поверхность твердых сыров, выполненные рядом авторов [11, 52, 126], показывают, что на поверхности твердых сыров в период созревания преобладают мицелиальные грибы. В работах этих авторов доказано, что доминирующая роль среди них отводится мицелиальным грибам рода Penicillium. Этими авторами отмечено также высокое содержание на поверхности твердых сыров плесневых грибов рода Aspergillus, Mucor, Cladosporium, о чем свидетельствуют данные, приведенные в таблице .
При изучении родовой принадлежности плесневых грибов, развивающихся на поверхности твердых сыров Шилером [126] установлено, что количественная доля плесеней рода Penicillium составляла 0,92 ед., что в значительной мере превосходило долю представителей родов Aspergillus (0,03) и Cladosporium (0,03). Кроме того, Шилером показано также, что грибы рода Penicilliwn превосходили по содержанию в 3 раза представителей Aspergillus, Geotrichum, Cladosporiiim не только в аэропланктоне сырохранилищ, но и на поверхности созревающих сыров [126].
Однако, что касается видового состава мицелиальных грибов, то здесь данные цитируемых авторов несколько отличаются. Например, в работе Бу-кановой [И] показано, что из представителей рода Penicillium на поверхности сыров преобладали изоляты P. martensii {А1,1 %) и P. proteoliticum (24%) в меньшем количестве обнаруживались грибы P. stalonifirum и P. camamberti [11].
Согласно исследованиям Шил ера [126], на сыродельных предприятиях чаще других встречался плесневый гриб P. glaucum, который был использован автором в качестве тест-объекта при разработке искусственных покрытий, применяемых для созревания твердых сыров [126].
В исследованиях Кузнецовой [52] установлено, что на ряде сыродельных предприятий России и Белоруссии в условиях пониженной температуры в камерах созревания, сырохранилищах, холодильных камерах и на поверхности сыров чаще других обнаруживался мицелиальный гриб Penicillium chrysogenum [52].
Порча европейских сыров чаще всего бывает обусловлена грибом Р. commune [176]. В Австралии основным плесневым грибом, вызывающим порчу поверхности сыров является P. roguefortii, который отличается высокой устойчивостью к слабокислотным консервантам и наименьшей потребностью в кислороде [9].
Химические средства для защиты поверхности твердых сыров
Одним из надежных способов антимикробной защиты промышленных материалов, строительных конструкций, технологического оборудования и тары признано использование химических дезинфицирующих средств. Химический метод дезинфекции до настоящего времени остается основным и достаточно эффективным в бактерицидном отношении при условии строгого соблюдения норм и правил, изложенных в технической документации [106, 197]. В пищевой промышленности к дезинфицирующим средствам предъявляют достаточно жесткие гигиенические, микробиологические и токсикологические требования [61, 167].
На эффективность дезинфекции оказывают влияние степень обсеме-ненности микроорганизмами, состав микрофлоры, концентрация антимикробного препарата и продолжительность контакта его с обрабатываемой поверхностью. В жидкой среде, наиболее благоприятной для диссоциации химического вещества, контакт дезинфектанта с микробной клеткой наступает быстрее [50, 84, 131].
По физико-химическим свойствам, воздействию на микробные клетки и классу действующего вещества дезинфицирующие средства условно можно распределить на три группы: хлорсодержащие, перекисные и препараты на основе четвертично-аммонийных соединений (ЧАС) и гуанидинов [61, 118].
Более 70 % дезинфицирующих средств, используемых на предприятиях молочной промышленности, составляют хлорсодержащие препараты [61, 65]. Широкому применению этих препаратов способствует сильное спороцидное действие активного хлора и низкая стоимость. Однако к их недостаткам относят нестабильность, выраженную токсичность и сильное окисляющее (разрушающее) действие на обрабатываемые материалы [50].
Высокими бактерицидными свойствами обладают препараты на основе перекиси водорода и надуксусной кислоты [61]. Они являются самыми высокоэффективными бактерицидными и спороцидными средствами против грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, в том числе дрожжей и плесеней грибов. Однако эти препараты чрезвычайно агрессивны по отношению к обрабатываемым поверхностям [50].
Достаточно широко используется в настоящее время группа дезинфицирующих средств на основе ЧАС и полигексаметилен-гуанидинов (ПГМГ) хлорида или фосфата [61]. Дезинфектанты на основе ЧАС являются эффективными бактерицидными и фунгицидными средствами против грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, дрожжей и грибов. Эти препараты индифферентны по отношению к любым материалам: нержавеющей, хромникелевой стали, алюминию, латуни, меди, пластмассам. Средства отличаются высокой стабильностью и не разлагаются при хранении [61]. Однако другие авторы считают опасными четвертичные соли аммония и многокомпонентные вещества для обеззараживания, поскольку они остаются в следовых количествах в виде кристаллов солей, особенно после плохого ополаскивания обработанных мест, контактирующих в последствии с пищевой продукцией [48]. ЧАС не относятся к числу сильных антимикробных веществ, для обеспечения обеззараживающего эффекта необходимы их высокие концентрации, а отдельные виды микроорганизмов (споровые формы, микобактерии туберкулеза и т.д.) не подавляются под действием ЧАС [48].
В настоящее время находят применение гуанидиновые дезинфектанты; поскольку они значительно эффективнее ЧАС, производных фенола и хлор-содержащих препаратов, обладают меньшей токсичностью [50].
Для инактивации бактериофагов считают, что наиболее эффективными средствами являются хлорсодержащие вещества, гипохлорид, ЧАС, препараты на основе перекиси водорода и надуксусной кислоты [17, 24].
Микробиологические исследования отечественных и зарубежных ученых, выполненные в последние годы, показывают, что микроорганизмы окружающей среды обладают ярко выраженной селективной способностью и могут формировать свою устойчивость к различного рода антимикробным воздействиям как по хромосомному, так и по внехромосомному типу [127]. Кроме того, попадая на влажные поверхности строительных конструкций или производственного оборудования, сообщества микроорганизмов образуют «биоплёнки», которые становятся более устойчивыми к действию антимикробных и дезинфицирующих средств [37]. Для предотвращения или снижения рисков контаминации продуктов питания важна дезинфекция оборудования и производственных помещений, которая способна подавлять рост численности адаптировавшихся или стойких к химическим веществам штаммов микроорганизмов [9, 139].
Следовательно, для грамотной и эффективной антимикробной защиты производственных помещений, технологического оборудования и других поверхностей необходимо подбирать биоцид и необходимую концентрацию его применения с учетом специфики защищаемого материала и циркулирующей на предприятии микрофлоры.
Для выделения и идентификации мицелиальных грибов
Для выявления микроскопических грибов посевы микроорганизмов инкубировали при температуре 25 - 28С, начинали просматривать через 3 дня и в течение десяти дней периодически повторяли просмотр.
Идентификация чистых культур грибов производится на основании культурально-морфологических признаков при выращивании на агаризован-ных питательных средах.
Идентификацию изолятов, принадлежащих видам Penicillium, производили с использованием комбинации различных питательных сред и культивирования при разных температурах по определителю [165]: - агар Чапека с дрожжевым экстрактом (CYA), температура культивирования: 5С, 25С и 37С, время культивирования: 7 суток. - 25 % глицерин-нитратный агар (GN25), температура культивирования: 25С, время культивирования: 7 суток; - мальц экстракт агар (МЕА), температура культивирования 25С, время культивирования: 7 суток.
Идентификацию изолятов, принадлежащих к роду Мисог, проводили на основе изучения культурально-морфологических признаков на Мальц-агаре. Посевы культивировали 5 суток при 20С, идентификацию проводили с использованием определителя Schipper М.А.А. [206].
Идентификацию изолятов, принадлежащих роду Geotrichum, проводили на основе изучения культурально-морфологических признаков на Мальц-агаре. Посевы культивировали 10 суток при 20С, идентификацию проводили с использованием определителя De Hoog G.S., с соавт. [144].
Определение микробной обсемененности методом «смывов» Определение микробной обсемененности поверхности твердых сыроЕ проводили методом «смывов» [72]. Посев анализируемых проб осуществляли на селективную питательную среду Сабуро с последующей регистрацией выросших колоний микроорганизмов. 2.4.3. Определение микробной обсемененности воздуха в производственных помещениях сыродельных предприятий
Количественное определение плесневых грибов и дрожжей в воздухе производственных помещений сырохранилищ проводили седиментационным методом по их оседанию в течение 5 минут на селективную питательную среду Сабуро (5 чашек Петри) [72]. Санитарно-микологическое состояние воздуха в цехах и производственных помещениях сыродельных предприятий оценивали в соответствии с внутриведомственными санитарными требованиями и инструкциями для отраслей пищевой промышленности [64, 72].
Исследование фунгицидной активности растворов антимикробных соединений и дезинфицирующих средств проводили методом «аппликаций» (или методом бумажных дисков) [52]. Пример определения фунгицидной активности препаратов приведен на рис. 3.
Пример определения зоны подавления гриба РепісіШит chrysogenum.
Для исследований споровую суспензию грибов в концентрации 1-2 млн. /мл наносили шпателем на твердую питательную среду Сабуро в чашках Петри. Затем стерильные диски фильтровальной бумаги d = 2,5 см смачивали в растворах исследуемых концентраций препаратов и выкладывали на газонь тестируемых грибов. Чашки инкубировали при t = 28 С и наблюдали зону подавления развития тест-культур. Повторность опыта составляла не менее 9. 2.4.5, Определение фунгицидной активности методом «капель»
Фунгицидную активность полученных пленок определяли методом «капель». Образцы исследуемых пленок размером 5 х 5 см выкладывали в чашки Петри. При помощи пастеровской пипетки на поверхность исследуемых пленок наносили по 4 капли споровой суспензии тестируемого гриба. Чашки инкубировали при t = 28 С и наблюдали развитие грибов на поверхности оболочки [52].
Микроскопия мицелиальных грибов на поверхности сыра Сканирующая микроскопия. Для исследования вырезали пластинки сыра размером 5x5 мм и укладывали на медные столбики. Образцы высушива ли и напыляли вольфрамом (150-200 нм) 5 минут методом ионного напыления JFC-1100 (JEOL, Япония). Полученные образцы просматривали в сканирующий микроскоп Т-300 (JEOL, Япония) под разными углами.
Электронная микроскопия. Образцы размером 3x5 мм фиксировали в 2,5% глютаровом альдегиде в 0,05 М кокадилатном буфере с рН 7,2 в течение 24 часов. Затем проводили постфиксацию 2% тетраоксидом осмия в том же буфере в течение 12 часов. После этого материал обезвоживали через серию спиртов 30%, 50%, 70% (2 раза), 80%, 96%, абсолютный спирт (2 раза), абсолютный ацетон (2 раза) по 2 часа. Обезвоженный материал последовательно заключали в смесь эпоксидных смол Эпон 812 и Аралдит М в соотношении 1:1, проводя материал через серию пропиток. После полимеризации из смолы с заключённым в неё образцом готовили ультратонкие срезы на ультрамикротоме LKB-NOVA (Швеция). Ультратонкие срезы наносили на медные опорные сеточки, покрытые формваровой подложкой, укреплённой углеродом. Полученные срезы контрастировали 2% уранилацетатом в 70% этаноле в течение 30 минут при 37 С и докрашивали сложным свинцовым контрасте-ром в течение 1 -2 минут при комнатной температуре. Подготовленный материал просматривали в электронном микроскопе JEM-100CXII (JEOL, Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ.
Изучение характера поражения поверхности твердых сыров мицелиальными грибами
Известно, что рост и развитие микроорганизмов, а в последствии и их повреждающее действие на пищевую продукцию, определяются не только биологическими особенностями самих микроорганизмов, но и биохимическим составом пищевых субстратов, а также условиями окружающей среды, среди которых важную роль играют температура, влажность, рН и др. показатели [106, 127, 163, 198, 204]. Поэтому для разработки эффективных современных способов и средств защиты поверхности твердых сыров от поражения микроорганизмами необходим не только грамотный анализ контаминирующей микрофлоры, изучение температурного оптимума роста индивидуальных её представителей, но важно также располагать знаниями об особенностях и характере развития грибов на поверхности пищевых субстратов, в данном случае -поверхности сырных головок, а также механизмах поражения этими токсино-образующими микроорганизмами поверхности пищевых продуктов.
Каждый вид сыра характеризуется собственной микроструктурой, которая формируется в процессе его изготовления и созревания. В частности, считают, что показательным и стойким признаком микроструктуры является толщина прослоек между макрозернами [109]. Именно по этому признаку можно судить об особенностях технологии того или иного вида сыра [24]. Например, если сыр «Российский» имеет более рыхлую структуру, то и его рисунок может быть обусловлен не только развитием молочнокислых бактерий, но и особенностями технологического процесса производства и формования сырной головки. «Швейцарский» сыр имеет более плотную структуру, его рисунок обусловлен развитием и жизнедеятельностью пропионово-кислых бактерий, продуцирующих большое количество углекислого газа, под действием которых образуются характерные для этого сыра «глазки» округлой формы разного диаметра [24, 49]. Известно также, что микроструктура сыра влияет на его усушку, диффузию солей, молочной кислоты и продуктов распада белков между различными участками сырной массы, а также кристаллизацию солей и других веществ, входящих в состав сырной массы [109]. Следовательно, характер развития грибного мицелия на поверхности сырной головки будет определяться, прежде всего, микроструктурой самого сыра, которая в свою очередь зависит от технологии выработки данного вида сыра.
В соответствии с поставленной задачей первоначально с помощью сканирующей микроскопии была исследована микроструктура сыра «Российский», выработанного в производственных условиях сыродельного завода ООО «Старицкий сыр».
Представленные на рис. 5 сканограммы показывают, что сырная масса сыра «Российский» представляет собой рыхлую, пористую структуру, характеризующуюся множеством микропустот разных размеров и формы. Эти мик- ропустоты имеют округлую или многоугольную форму и образуются на стыке нескольких макрозерен. Согласно проведенной статистической обработке полученных сканограмм было установлено, что размер микропустот изучаемого сыра колеблется от 5 до 45 мкм, а средний размер их составляет 10 — 20 мкм (рис. 5 А). Такие микропустоты, вероятно, образуются в результате жизнедеятельности молочнокислых или других бактерий под действием образуемых ими газов (рис. 5 Б) [109].
Известно, что в отличие от других микроорганизмов, мицелиальные грибы обладают мощным приспособлением, позволяющим им быстро захватывать пищевые субстраты - это поляризованный верхушечный рост [121]. Благодаря этому происходит быстрое продвижение грибной гифы на новые участки питательной среды, быстрая колонизация территории и активное накопление грибной биомассы. Поэтому следующим этапом работы явилось исследование характера поражения плесневыми грибами поверхности такого полноценного белкового и жиросодержащего продукта, как сыр. В качестве тест-объекта использован гриб P. roquefortii ВКМ FW-3057. Культуру гриба наносили на по верхность незрелого сыра «Российский» и далее изучали характер поражения поверхности сыра исследуемым микроорганизмом.
Представленные на рис. 6 сканограммы поверхности сыра свидетельствуют, что в процессе поражения на поверхности продукта развивается воздушный мицелий грибов, который в дальнейшем довольно плотным слоем покрывает поверхность всей сырной головки (рис. 6 А). Показано, что в результате развития тестируемого гриба P. roquefortii на поверхности сыра образуется густой «войлок», состоящий из грибных гиф, среди которых четко выявлены гифы-конидиеносцы, формирующие самостоятельные конидии на конце грибной гифы (рис. 6 А). Такие конидии могут легко отделится от ко-нидиеносцев и из них в благоприятной обстановке будет развиваться новый мицелий, образующий новые колонии плесневых грибов, в том числе и на поверхности других сырных головок.
В процессе своего развития на поверхности сырной головки мицелий гриба P. roquefortii заполняет все микро-, макротрещинки, а также различного рода углубления на поверхности пищевого продукта, т.е. мицелий плавно стелится по его поверхности (рис. 6 Б). Более того, при нарушении целостности коркового слоя сыров и появлении возможности проникновения грибного мицелия в более глубокие слои сырной головки, гифы гриба P. roquefortii
