Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1 Строение хондроитинсульфата 10
1.2 Свойства хондроитинсульфата 13
1.3 Получение хондроитинсульфата 16
1.3.1 Источники хондроитинсульфата 16
1.3.2 Основные стадии получения хондроитинсульфата 17
1.4 Идентификация хондроитинсульфата 23
1.4.1 Идентификация методом ИК спектроскопии 23
1.4.2 Метод капиллярного электрофореза 24
1.4.3 Метод ядерного магнитного резонанса 25
1.4.4 Другие методы идентификации хондроитинсульфата 26
1.5 Методы количественного анализа хондроитинсульфата 27
1.6 Терапевтические роли хондроитинсульфата 31
1.7 Выводы. Постановка задачи исследований 3 6
Глава 2. Объекты и методы исследования 38
2.1 Характеристика объектов исследования 38
2.2 Методы исследования 39
2.2.1 Методика определения массовой доли хондроитинсульфата в образце 39
2.2.2 Количественное определение восстанавливающих Сахаров 41
2.2.3 Методика количественного определения М-ацетил-0-глюкозамина42
2.2.4 Методика количественного определения D-галактозамина в присутствии D-глюкозамина 44
2.2.5 Количественное определение D-галактозамина и D-глюкозамина методом ВЭЖХ 45
2.2.6 Методика идентификации хондроитинсульфата 48
2.2.7 Определение экзогликозидазной активности 50
2.2.8 Методика определения среднемассовой молекулярной массы хондроитинсульфата 51
2.2.9 Определение физико-химических свойств водных растворов хондроитинсульфата 51
2.2.10 Методики определения качественных показателей препаратов хондроитинсульфата 52
2.3 Математическая обработка данных 52
3 Результаты и их обсуждение 56
3.1. Выделение хондроитинсульфата из гидробионтов Баренцева моря 56
3.2 Разработка и совершенствование методов идентификации хондроитинсульфатов 59
3.2.1 Идентификация хондроитинсульфатов методом инфракрасной спектроскопии 59
3.2.2.1 Идентификация хондроитинсульфата методом ЯМР 63
3.2.3 Идентификация хондроитинсульфата методом ВЭЖХ 70
3.3. Кинетика кислотного гидролиза хондроитинсульфата 73
3:3.1 Кинетика гидролиза хондроитинсульфата по образованию восстанавливающих сахаров 75
3.3.2 Кинетика гидролиза хондроитинсульфата по содержанию D-галактозамина 77
3.3.3. Кинетика гидролиза хондроитинсульфата;по данным ВЭЖХ 79
3.3.4. Кинетика гидролиза хондроитинсульфата по изменению концентрации D-глюкуроновой кислоты в гидролизатах 82
3.3.5 Кинетика образования и разрушения К-ацетил-О-галактозамина в ходе гидролиза хондроитинсульфата 84
3.4. Математическое моделирование процесса кислотного гидролиза хондроитинсульфата 85
3.5 Физико-химические свойства растворов хондроитинсульфатов 88
3.5.2 Система хондроитинсульфат-фермент как биомаркер 89
3.6 Фракционный состав хондроитинсульфата 92
3.7 Выделение хондроитинсульфата из морских гидробионтов с использованием ультрафильтрации 97
Глава 4. Разработка технологии получения хондроитинсульфата из морских гидробионтов с использованием мембран 103
4.1 Обоснование рациональных режимов технологических процессов 104
4.2 Технология получения хондроитинсульфата и его характеристики 110
4.3. Расчет экономической эффективности технологии получения хондроитинсульфата из морских гидробионтов с использованием ультрафильтрации 113
Выводы 119
Список использованной литературы 121
Приложения 133
- Основные стадии получения хондроитинсульфата
- Количественное определение D-галактозамина и D-глюкозамина методом ВЭЖХ
- Фракционный состав хондроитинсульфата
- Обоснование рациональных режимов технологических процессов
Введение к работе
Актуальность темы
Разработка современных технологий переработки гидробионтов является актуальной задачей рыбной отрасли. Создание технологий производства обогащенных пищевых продуктов, профилактических и медицинских препаратов, полученных из морских гидробионтов, включает в себя исследование состава сырья, идентификацию и количественный анализ его компонентов, изучение физико-химических свойств биологически-активных компонентов сырья.
Природный полисахарид хондроитинсульфат (ХС), содержащийся в хрящевой ткани, представляет собой сульфатированный гликозаминогликан, макромолекулы которого состоят из чередующихся мономерных звеньев сульфатированного 1Ч-ацетил-В-галактозамина (АцГалА) и D-глюкуроновой кислоты (Г л У).
Линейные макромолекулы ХС помогают сделать хрящ более устойчивым к давлению, которое оказывает на него вес тела, принимают участие в формировании костной ткани, связок, а также в поддержании упругости и эластичности стенок кровеносных сосудов. ХС является широко используемой пищевой добавкой для лечения дегенеративно-дистрофических заболеваний суставов и позвоночника, например, артроза и остеохондроза. В настоящее время коммерческие препараты ХС получают главным образом из хрящевой ткани млекопитающих. В последние годы для его производства стали также использовать ткани гидробионтов. Проблемами выделения ХС из различных природных объектов и его применения в медицине и биотехнологии занимаются такие зарубежные ученые как A. Kinoshita,. Н. R. Morris, К. Sugahara, М. J. Miller, С. Е Costello.; Н. Takai,. Т. Копо, С. Amornrut, А. В. Khare, S. A. Houliston, F. Abdel и российские исследователи Т. Н. Шкарина, И. М. Сорокоумов и другие. Современные методы получения ХС представляют собой многостадийные процессы экстракции, а выход конечного продукта и его чистота не всегда высоки. Следует отметить, что физико-химические свойства ХС из гидробионтов, методы их идентификации и количественного анализа, количественные закономерности химического гидролиза практически не изучены. В связи с этим, разработка новых и совершенствование известных технологий выделения ХС из морских гидробионтов, изучение их физико-химических свойств, методов идентификации и количественного анализа являются актуальными задачами.
Цели работы: изучение содержания и физико-химических свойств ХС гидробионтов Баренцева моря; разработка и совершенствование методов их идентификации и количественного анализа. Разработка технологии получения ХС из гидробионтов.
Для достижения поставленных целей решались следующие задачи:
1. Изучение содержания ХС в гидробионтах Баренцева моря: сёмге (Salmo salaf), черноротой акуле (Galeus melanostomus), длиннорылой акуле
(Deania calceus), полярной акуле (Somniosus microcephalus), северном скате (Amblyraja hyperborean), морском огурце (Cucumaria frondosa).
2. Разработка методики идентификации и количественного анализа ХС
из морских гидробионтов с помощью высокоэффективной жидкостной
хроматографии (ВЭЖХ) на обращенной фазе солей ГалА и D-глюкозамина в
продуктах кислотного гидролиза ХС. Совершенствование методик
спектрофотометрического определения D-галактозамина (ГалА), АпГалА и ГлУ.
3. Изучение кинетики кислотного гидролиза ХС. Выбор
математической модели, адекватно описывающей процесс кислотного
гидролиза.
4. Изучение физико-химических свойств водных растворов ХС.
5. Разработка технологии получения ХС с использованием
ультрафильтрационных мембран; выбор математической модели, адекватно
описывающей технологию получения ХС.
6. Разработка нормативной документации, оценка экономической
эффективности технологии получения ХС.
Научная новизна
Впервые разработана мембранная технология получения ХС из гидробионтов Баренцева моря: сёмги, черноротой акулы, длиннорылои акулы, полярной акулы, северного ската, морского огурца.
Разработана методика идентификации и количественного анализа ХС с помощью ВЭЖХ на обращенной фазе. Методика включает определение ГалА и D-глюкозамина в продуктах кислотного гидролиза ХС. Усовершенствованы методики спектрофотометрического определения ГалА, АцГалА и ГлУ.
Определены спектральные характеристики, фракционный состав, среднемассовая молекулярная масса, поверхностная и оптическая активность ХС из морских гидробионтов; показано влияние концентрации электролита на процесс полиэлектролитного набухания макромолекул полисахарида.
Рассчитаны константы скоростей гидролиза ХС в хлороводородной и серной кислотах. Разработана математическая модель кинетики гидролиза ХС. Предложена методика расчета содержания ХС в исходных объектах с использованием констант скоростей реакции гидролиза ХС.
Впервые показана возможность использования системы ХС-ферментный препарат в качестве биомаркера.
Практическая значимость
Разработана технология получения ХС из гидробионтов Баренцева моря с применением ультрафильтрации.
Выделены ХС из хрящевой ткани сёмги, черноротой акулы, длиннорылои акулы, полярной акулы, северного ската, а так же кожных покровов морского огурца.
На основании испытаний на базе учебно-экспериментального цеха ФГБОУВПО «МГТУ», (г. Мурманск) разработана и утверждена технологическая инструкция по получению ХС методом
ультрафильтрационного разделения, разработаны Технические условия (ТУ) на «Хондроитин сульфат из тканей морских гидробионтов. Полуфабрикат».
На базе учебно-экспериментального цеха ФГБОУВПО «МГТУ» изготовлена опытная партия ХС, произведенная в соответствии с разработанной технологической инструкцией.
Подана заявка на патент «Способ получения ХС из тканей морских гидробионтов».
Основные положения работы, выносимые на защиту:
1. Разработанная технология получения ХС из тканей морских
гидробионтов с использованием ультрафильтрационных мембран, имеющих
различные молекулярно-массовые пределы задерживания.
Разработанные и усовершенствованные методики идентификации и количественного анализа ХС.
Результаты изучения закономерностей кислотного гидролиза ХС.
Математическая модель кинетики гидролиза ХС, методика расчета содержания ХС в исходных объектах с использованием констант скоростей реакции гидролиза ХС.
Результаты изучения физико-химических свойств растворов ХС из тканей морских гидробионтов; возможность применения системы ХС-фермент в качестве биомаркера.
Технологическая инструкция на полуфабрикат ХС из тканей морских гидробионтов и ТУ «ХС из тканей морских гидробионтов. Полуфабрикат».
7. Оценка экономической эффективности разработанной технологии.
Внедрение результатов исследований
На основании проведенных опытно-промышленных испытаний на базе учебно-экспериментального цеха ФГБОУВПО «МГТУ», (г. Мурманск) разработана технологическая инструкция на производство полуфабриката ХС из тканей морских гидробионтов и ТУ «Хондроитинсульфат из тканей морских гидробионтов. Полуфабрикат».
Результаты изучения кинетических закономерностей кислотного гидролиза ХС, методики их идентификации и количественного анализа внедрены в учебный процесс для студентов направлений 020100.62 «Химия» и 260100.62 «Технология продуктов питания», специальности 260302.62 «Технология рыбы и рыбных продуктов» и аспирантов, обучающихся по специальности 02.00.04 «Физическая химия».
Апробация работы
Основные положения диссертационной работы представлены на научно-технических конференциях профессорско-преподавательского состава, аспирантов, научных и инженерных работников МГТУ «Наука и образование» (г.Мурманск, 2008-2011), Международной научной конференции «Инновации в науке и образовании» КГТУ (г. Калининград, 2009-2010), 10-ой международной конференции молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии» на базе Казанского государственного технологического университета (г. Казань, 2009), Всероссийской научно-технической конференции «Современные проблемы экологии» (г. Тула,
2008), международной научно-практической конференции «Техника и технологии переработки гидробионтов и сельскохозяйственного сырья» МГТУ (г. Мурманск, 2008), VIII Всероссийской конференции с международным участием. «Химия и медицина» (Уфа, 2010), 24-th Conference of the European Colloid and Interface Society (Prague, 2010), The 10-th International Conference of the European Chitin Society (г. Санкт-Петербург, 2011).
Экспериментальная часть работы выполнена в Мурманском государственном техническом университете в рамках научно-исследовательской работы по госбюджетной теме «Химический и электрохимический гидролиз гидробионтов различной природы» (ГР 01200603803) и Госконтракта № П744.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 17 работ, из них 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ, подана заявка на получение патента (№2010153884 (077891)).
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов, списка литературы (161 наименование) и 4 приложений. Работа изложена на 132 страницах, содержит 15 таблиц, 36 рисунков.
Основные стадии получения хондроитинсульфата
Обезжиривание сырья. Субпродукты, содержащие хрящевую ткань, — плавники, отходы от филетирования, хребты, головы — предварительно очищают от остатков мяса, кожи. Некоторые технологии подразумевают получение порошка из хрящей и последующую его обработку. Например, проводят измельчение сырья при температуре минус 120 С. Измельчение при низкой температуре может предотвратить разрушение и окисление хряща из-за выделения тепла при измельчении. Кроме того, при измельчении при комнатной температуре невозможно получение частиц очень маленького размера, а размер частиц получается неравномерным [138].
Удаление жира проводят несколькими способами, включающими промывку растворителями, тепловую обработку водной дисперсии измельченного хряща. Промывка измельченного сырья растворителем, например, водой при температуре 45 С в течение двух часов, чтобы обезжирить и дезодорировать сырьё. Водный раствор получается путем добавления воды в том же объеме, что и хряща [151, 23]. Некоторые авторы приводят способы обезжиривания при помощи промывки органическими растворителями. Экстракция жиров ацетоном поводится трехкратной промывкой, соотношение хрящ-ацетон составляет 1:3 (по массе) [138]. Возможно применение комбинированных методов: измельченный хрящ обезвоживается четырехкратной промывкой ацетоном, каждый раз по 8 часов. Затем обезжиривается четырёхкратной экстракцией н-гексаном (не менее 8 часов, отношение гексан:хрящ — 1:10). После обезжиривания хрящ выдерживают в воде. Соотношение вода:хрящ составляет 10:1, время обработки - 24 часа [85]. В литературе приводятся способы обезжиривания сырья с помощью нагревания смеси хряща и растворителя. Измельченный хрящ загружают в 3-литровую перегонную колбу с круглым дном, в которую добавляют толуол в количестве, равном двукратному весу хрящей. Затем колбу нагревают до температуры кипения толуола, кипение продолжают, пока не прекращается поступление воды в водную ловушку (3 часа). Толуол, содержащий жиры, отделяют от хряща, который затем промывают небольшим количеством (300 мл) свежего толуола при 17 С. Остаточный толуол удаляют из обезжиренного и обезвоженного хряща при температуре около 80 С под вакуумом до исчезновения запаха, около 3 часов [41]. Отделить жировую фракцию можно фильтрацией после тепловой обработки водного раствора, содержащего хрящ и ПАВ. Липиды, связанные с клеточными мембранами или коллагеновой матрицей, могут быть удалены после первой экстракции с ПАВ, такими как Тритон Х-100, после экстракции эфиро-этаноловой смесью в соотношении 1:1 (об./об.). Концентрация Тритон Х-100 - от 2 до 4 %, но предпочтительно около 3 %. Срок добычи, как правило, от 8 до 96 часов [28, 142].
Предварительная обработка. Следующий этап включает щелочной гидролиз сырья, содержащего хондроитинсульфат. Небольшие количества остаточного жира омыляются, щелочерастворимые белки растворяются, денатурируют и разрушаются, амидные группы в коллагене омыляются, изменяя тем самым электрический заряд и изоэлектрическую точку коллагена, основной белок расщепляется на мелкие пептиды, которые могут быть удалены из реакционной смеси с помощью диализа или ультрафильтрации. Бактерии, прионы и вирусы инактивируются. Щелочная обработка модифицирует протеогликаны: ковалентная связь гликозаминогликанов с коровым белком протеогликанов расщепляется. Таким образом, гликозаминогликаны отделяются от белка протеогликанов. В связи с сильным отрицательным зарядом, гликозаминогликаны формируют растворимые в воде солей, которые могут частично вымываются из коллагена. Часть гликозаминогликанов (около 3 % от массы коллагена) связана с коллагеном [85, 142].
Для проведения гидролиза используют разбавленную щелочь, чтобы избежать разрушения хондроитинсульфата. При использовании щелочи в концентрации менее 2 % происходит неполное освобождение необходимой фракции веществ из животной ткани, а при использовании щелочи в концентрации выше 8 % возможно разрушение части хондроитинсульфата [24, 138].
Некоторые авторы предлагают использовать для предварительной обработки хрящей уксусную кислоту [25], хлористый натрий [2].
Примеси осаждают за счет повышения рН с использованием двухвалентной гидроокиси щелочноземельных металлов, например, гидроксида кальция и гидроксида магния. Подбор температуры и рН во время процесса осаждения может обеспечить благоприятные условия для удаления белков и других примесей. Например, щелочной гидролизат можно обработать при температуре от О С до 80 С, рН — выше 10 [36].
Встречаются описания выделения- хондроитинсульфата методом гидролиза разбавленной щелочью с помощью микроволновой обработки. Оптимальные условия получения полисахарида были следующими: мощность СВЧ 252 Вт, время микроволнового облучения - 5,64 мин., соотношение хрящ-раствор - 1:29, концентрация щелочи составляла 7 %. В этих условиях средний выход хондроитинсульфата был 1,632 % [125].
Ферментная обработка. Для расщепления коллагена, содержащегося в хрящевой ткани, используют ферментативный гидролиз сырья. Например, сырье смешивается с буферным раствором с рН приблизительно от 4 до 7, предпочтительно примерно от 4,5 до 5,5. Температура сырья / буферной смеси в процессе пищеварения может быть около 55 С до 80 С. Для проведения гидролиза сырья различные протеазы могут быть добавлены к смеси. К подходящим протеазам относятся, например, папаин, трипсин, химотрипсин, щелочные протеолитические ферменты и их комбинаций. В процессе гидролиза рН смеси необходимо поддерживать на том уровне, который позволяет избежать побочных эффектов на активность фермента. Добавление к реакционной смеси катионов, таких как натрий ацетатного буфера, оказывает влияние на протекание процесса ферментативного гидролиза [23, 82].
Например, ферментативный гидролиз проводят с использованием протеолитического ферментного препарата, выделенного из пилорических придатков дальневосточных лососей (пилорин) с активностью 100-200 Е/г в количестве 1-4 % от массы измельченных хрящей, или протеолитического ферментного препарата, выделенного из гепатопанкреаса камчатского краба с активностью 150-250 Е/г в количестве 0,5-3% от массы измельченных хрящей, или с использованием мегатерина с активностью 200-400 Е/г в количестве 1-4 % от массы измельченных хрящей [16]. Исследования, посвященные изучению действия различных ферментов на хрящевую ткань при получении хондроитинсульфата, показывают, что для ферментативного гидролиза наиболее целесообразно использовать субстратспецифичный ферментный препарат - коллагеназу с концентрацией в суспензии 0,1 % [28, 14].
Исследователи приводят данные по ферментативному гидролизу хрящей акулы {Squatina oculata). Среди 11 коммерческих протеаз, Maxazyme NNP показал наилучшее соотношение выход хондроитинсульфата / стоимость фермента. Оптимальные условия гидролиза с применением данной протеазы: концентрации фермента — 1,63 %, время гидролиза — 2,87 ч [121].
При выборе фермента необходимо учитывать его специфичность к белкам хрящевой ткани, диапазон оптимальных рН и температур.
Диализ. Гидролизат, полученный после щелочного и ферментативного гидролиза, содержит соли, вид и количество которых зависит от применённых в данной технологии реагентов. Чаще всего соли отделяют от гидролизата методом диализа против дистиллированной воды. Именно диализ позволяет извлекать необходимую фракцию веществ за счет равномерной диффузии молекул воды и диализата и постепенного формирования осадка биополимера с изменением рН среды диализата от кислой (1,5-2,5) до нейтральной (5,5-6,0). Полученный препарат содержит мукополисахариды и коллаген одновременно, если не проводилась очистка от белков. [24, 120]
Выделение из раствора. Для выделения хондроитинсульфата из гидролизата используют различные методы осаждения самого полисахарида или примесей. Органические растворители, например, этанол с концентрацией 50-96 % и более добавляются в раствор. После осаждения полисахарида поводят промывку этанолом, метанолом, ацетоном или другим растворителем [151].
Количественное определение D-галактозамина и D-глюкозамина методом ВЭЖХ
Метод основан на регистрации флуоресцентных производных D-галактозамина и D-глюкозамина после их разделения с помощью обращенно-фазовой хроматографии [132].
Разработанный метод определения D-галактозамина и D-глюкозамина состоял из следующих операций.
Предварительная пробоподготовка. На первом этапе проводился кислотный гидролиз препаратов хондроитинсульфата следующим образом. Образец хондроитинсульфата помещали в колбу со стеклянной пробкой, добавляли соляную кислоту (1 мл кислоты на 0,01 г образца). Колбу нагревали на водяной бане при перемешивании, испарившаяся кислота возвращалась в колбу с помощью обратного холодильника. Пробы гидролизата хондроитинсульфата (1 мл) отбирали из реакционной ёмкости через определённые промежутки времени, охлаждали до -20 С, затем высушивали под вакуумом (0,1 ГПа) при температуре -48 С. Сухой гидролизат растворяли в дистиллированной воде и снова сушили под вакуумом для удаления остатков соляной кислоты. Полученный гидролизат хондроитинсульфата растворяли в 20 мл бидистиллированной воды и приступали к анализу.
Восстановление гидролизата хондроитинсульфата с помощью раствора боргидрида натрия. 5 мл 1 %-ного водного раствора NaBHU добавляли к 4 мл гидролизата. Смесь выдерживали при комнатной температуре не менее 3 часов. После этого реакцию останавливали добавлением 1 мл уксусной кислоты (2 моль /дм ).
Модификация восстановленного гидролизата хондроитинсулъфата. Реагент для модификации получали следующим образом: 25 мг ортофталевого альдегида растворяли в 1 мл метанола, затем добавляли 5,6 мл насыщенного раствора тетрабората натрия и 25 мкл Р-меркаптоэтанола.
0,4 мл реагента ОРА добавляли к 0,2 мл гидролизата и встряхивали в течение 1 минуты. Далее в смесь добавляли 1 мл раствора фосфата калия (2,72 г на 50 мл воды). Приготовленный раствор сразу же вводили в хроматограф с помощью автопробоотборника.
Проведение хроматографического разделения. Хроматографическая система Shimadzu LC состояла из дегазатора, бинарного насоса, автоматического пробоотборника, термостатируемой колонки (С-12, размер 4,6 х 250 мм, 35 С), UV-VIS детектор переменной длины волны, и флуоресцентного детектора.
Для разделения производных D-галактозамина и D-глюкозамина в исследуемой системе был подобран состав буферных растворов и градиент скорости их подачи на хроматографическую колонку.
Состав буфера: 0,05 М NaH2P04 в 30 % этанола. Буфер В состоит из этанола / воды / тетрагидрофурана в соотношении объемных долей 70:30:0,6.
Скорость потока составляла 0,8 мл/мин. Буфер В увеличивался до 8 % линейным градиентом от 0 до 3 мин, поддерживался при 8 % от 3 до 18 мин, при 55 % от 18 до 30.5 мин, при 100 % от 30,5 до 32,5 мин и при 0 % от 32,5 до 35 мин. Через 5 мин при 0 % В колонка была готова для следующего анализа. Выходящие с колонок фракции регистрировали по оптическому поглощению веществ с помощью ультрафиолетового спектрофотометрического детектора RF-10AXL на длинах волн 337 нм и 454 нм.
Для построения калибровочной линии использовали растворы с известной концентрацией галактозамина. Количество D-галактозамина в пробе пропорционально площади соответствующего пика на хроматограмме. Количество D-галактозамина и D-глюкозамина в растворе рассчитывали по калибровочному графику, представленном на рисунке 2.7, и рассчитывали из уравнений (2.8, 2.9).
Фракционный состав хондроитинсульфата
Хондроитинсульфат в тканях присутствует виде комплекса полисахарид-белок. В процессе экстракции хондроитинсульфата из тканей белковая часть гидролизуется до аминокислот, а длинные цепочки полисахарида могут частично разрушаться. Поэтому полисахаридные цепи различаются по молекулярной массе, наличию присоединенных остаточных аминокислот, преобладающему положению сульфатной группы. Исследование фракционного состава хондроитинсульфатов показывает распределение полисахаридов по размерам молекул.
Был исследован фракционный состав хондроитинсульфата с помощью эксклюзионной ВЭЖХ. Метод эксклюзионной (ситовой, гель-проникающей, гель-фильтрационной) жидкостной хроматографии основан на разделении молекул веществ по размеру за счет их разной способности проникать в поры неионогенного носителя, который служит неподвижной фазой. Различают гель-проникающую хроматографию (элюент — органический растворитель) и гель-фильтрацию (элюент — вода). При этом первыми выходят из колонки наиболее крупные молекулы (с большей молекулярной массой), способные проникать в минимальное число пор носителя. Последними выходят вещества с малыми размерами молекул, свободно проникающие в поры сорбента.
На рисунке 3.16 представлены хроматограммы хондроитинсульфатов, полученных из различных источников. Присутствующая на всех хроматограммах группа пиков с временем удерживания 6-11 минут соответствует хондроитинсульфату.
На хроматограммах также есть пики с временем удерживания более 12 минут, которым соответствуют олигосахариды хондроитинсульфата и, возможно, остаточные аминокислоты. Хроматограмма хондроитинсульфата, полученного из морского огурца, содержит группу пиков с временем удерживания 4,8-6,0 мин, которая может соответствовать высокомолекулярным веществам, например, белкам.
Более детально изучали фракционный состав хондроитинсульфата, полученного из хрящей сёмги, с использованием эксклюзионной ВЭЖХ. На рисунке 3.17 представлены хроматограммы препарата хондроитинсульфата из хрящей семги в зависимости от концентрации NaCl в элюенте.
При хроматографировании растворов, содержащих препарат хондроитина, было обнаружено смещение пиков одной хроматограммы относительно другой. Было показано, что на положение пиков влияет ионная сила раствора элюента - хлорида натрия. С увеличением ионной силы пики сдвигаются вправо. При уменьшении ионной силы раствора более выгодными являются развернутые конформации макромолекул полиэлектролитов (так называемое полиэлектролитное набухание). Среднестатистические размеры молекул растут, и это приводит к уменьшению удерживаемых объемов в эксклюзионной ВЭЖХ.
Избежать полиэлектролитного набухания можно добавлением в раствор нейтрального электролита, экранирующего ионные группы. В этом случае хроматограмма образцов будет соответствовать их молекулярно-массовому распределению.
При анализе полученной зависимости удерживаемого объема хондроитинсульфата от концентрации хлорида натрия было установлено, что полное подавление полиэлектролитного набухания наблюдается при концентрации NaCl, превышающей 0,05 моль/дм (ионная сила раствора равна 0,05 моль/дм ). При меньшей ионной силе раствора наблюдается несколько пиков на хроматограммах, обусловленных различными конформациями молекул хондроитинсульфата. При концентрации хлорида натрия больше 0,05 моль/дм наблюдаются два основных перекрывающихся пика с удерживаемыми объемами 10 и 10,8 мл, соответствующими двум фракциям полисахарида. Явление полиэлектролитного набухания хондроитинсульфата может быть использовано при его получении и очистке с помощью ультрафильтрационных мембран, имеющих различный молекулярно-массовый предел задерживания.
При ионной силе раствора 0,003 моль/дм на хроматограмме присутствует наибольшее количество пиков.
Исследование состава фракций раствора хондроитинсульфата с концентрацией 2,5 % проводили с использованием коллектора фракций хроматографической системы. Фракции хондроитинсульфата с различным временем удерживания по заданной программе собирались в установленные пробирки коллектора. Небольшой объём введенной пробы (50 мкл) не позволяет собрать достаточного для анализа количества полисахарида за один цикл, поэтому было проведено 9 автоматических циклов хроматографирования со сбором фракций в одни и те же пробирки.
На рисунке 3.18 приведена хроматограммма хондроитинсульфата из сёмги с нанесенными временными рамками фракций.
Собранные фракции высушивали под вакуумом при температуре -48 С, затем к сухому остатку добавляли 2 мл соляной кислоты с концентрацией 6 моль/дм Кислотный гидролиз проводили в течении 60 минут при температуре 100 С. Гидролиз останавливали немедленным охлаждением пробы, затем раствор сушили под вакуумом как было описано ранее. В гидролизатах определяли концентрацию D-галактозамина методом ВЭЖХ на обращенной фазе (глава 2). В таблице ЗЛО приведены данные распространения D-галактозамина в различных фракциях.
Самое высокое относительное содержание D-галактозамина обнаружено во фракции № 3, которая соответствует объёму удерживания на колонке от 8,2 до 8,5 мл.
Обоснование рациональных режимов технологических процессов
Эффективность осаждения хондроитинсульфата из раствора при различной продолжительности осаждения и концентрации этилового спирта в растворе характеризуется количеством полученного полисахарида и параметром, описывающим эффективность использования этанола. Параметр эффективности использования этанола можно выразить следующим уравнением.
В эксперименте использовали хрящи сёмги, которые обрабатывали согласно разработанной технологии (глава 3). На стадии осаждения полученный после мембранной обработке раствор, содержащий хондроитинсульфат, обрабатывали этиловым спиртом (96 %). Концентрацию спирта в растворе варьировали от 33 % до 83 %, время осаждения составляло от 1 до 48 часов. Осадок из раствора извлекался при помощи центрифугирования, затем высушивался при 60 С. Количество хондроитинсульфата в полученном осадке определяли методом ВЭЖХ (глава 2).
На рисунке 4.1 приведена зависимость количества выпавшего осадка от продолжительности процесса осаждения.
Из рисунка 4.1 следует, что максимальный выход осадка из раствора происходит при времени осаждения в интервале от 20 до 30 часов, затем, по-видимому, имеет место вторичное растворение некоторых компонентов осадка.
Из рисунка следует, что максимальное содержание хондроитинсульфата в осадке соответствует концентрации этанола в растворе гидролизата 70-80 %. При меньших концентрациях происходит неполное осаждение полисахарида, значительная часть остаётся в растворе. При больших концентрациях этанола наблюдается уменьшение количества хондроитинсульфата в осадке, что может быть обусловлено выпадением в осадок других веществ, например, остаточного белка.
При концентрации этанола в растворе 75 % не наблюдается чётких максимумов содержания хондроитинсульфата в интервале времени от одного до 48 часов.
Параметр эффективности использования этанола показывает выход хондроитинсульфата из раствора (в мг хондроитинсульфата /мл раствора) при некоторых затратах этанола. Зависимость данной характеристики от времени осаждения для концентрации этанола 75 % приведена на рисунке 4.4.
Из рисунка 4.4 следует, что при концентрации этанола 75 % оптимальным временем осаждения является интервал 15-40 часов.
Зависимость эффективности использования этанола в зависимости от концентрации этанола в растворе приведена на рисунке 4.5.
Из графической зависимости, приведенной на рисунке 4.5, следует, что наибольшей эффективность использования этанола становится при концентрации этанола в растворе в интервале 70-80 %.
Определение технологических параметров процесса, близких к оптимальным, было проведено с использованием метода планирования эксперимента. Расчеты выполнены с помощью программы STATISTICA Ver. 8.0 (StatSoft., Inc.).
В качестве функции отклика Y было выбрано содержание хондроитинсульфата, в качестве влияющих факторов: количество этанола в растворе X], (%), и продолжительность процесса х2, (час).
Проведенные эксперименты показали, что область близкая к оптимуму процесса осаждения хондроитинсульфата из раствора находится в диапазоне варьирования х2, от 70 до 80 %, х/ от 15 до 40 час. Согласно этому осуществляли центральное ортогональное композиционное планирование эксперимента. Полученные в ходе экспериментов данные вводили в матрицу планирования эксперимента (таблица 4.1), которую подвергали математической обработке.
Расчетные значения влияющих факторов, наиболее близкие к оптимальным: х2 = 66 %; Xj = 25 часов.
Анализ полученных данных показал, что продолжительность процесса осаждения хондроитинсульфата из раствора имеет оптимум на поверхности функции отклика, для получения максимального количества хондроитинсульфата достаточно 25 часов. Поэтому, рациональными условиями протекания процесса осаждения хондроитинсульфата являются: содержание спирта в растворе - 66 %, продолжительность - 25 часов.
