Содержание к диссертации
Введение
1. Аналитический обзор 10
1.1.Состав и свойства кератинов 10
1.2. Анализ штаммов микроорганизмов, содержащих ген кератиназы 23
1.3 Способы технологической переработки кератинсодержащего сырья 29
1.4. Заключение по обзору литературы и задачи исследования 35
2. Методика выполнения работы 38
2.1. Организация выполнения работы 38
2.2. Объекты исследования 40
2.3. Методы исследований 41
3.Результаты исследований и их обсуждение 49
3.1. Идентификация штамма, полученного из природного источника, и изучение его свойств 49
3.2. Изучение влияния технологических параметров культивирования на кератинолитическаую активность Bacilluspumilus 58
3.3. Подбор оптимального состава питательной среды для культивирования штамма Bacillus pumilus 64
4. Практическая реализация результатов исследования 85
4.1.Технологическая схема по производству биопрепарата для переработки отходов птицеперерабатывающей промышленности в кормовую добавку... 85
4.2. Состав, свойства и продолжительность хранения биопрепарата 90
4.3. Экономическая эффективность выработки биопрепарата 95
Выводы и результаты 103
Список использованных источников 104
- Анализ штаммов микроорганизмов, содержащих ген кератиназы
- Объекты исследования
- Изучение влияния технологических параметров культивирования на кератинолитическаую активность Bacilluspumilus
- Состав, свойства и продолжительность хранения биопрепарата
Анализ штаммов микроорганизмов, содержащих ген кератиназы
Сравнение тонкого строения перьев и волос: мозаичная кутикула (а) бородки пера у серого журавля - в центре каждой чешуйки видны вмятины от ядра, и (б) иглы американского дикобраза; раструбная кутикула (в) бородки второго порядка пуха покровного пера полевого жаворонка и (г) нижней части остевого волоса мышевидного опоссума, ячеистая сердцевина стержня (д) покровного пера кедровки и (е) иглы американского дикобраза. Кутикула построена из чешуек, которые состоят из ороговевших клеток. Конструкция чешуек перьев и волоса может быть очень похожей. Например, мозаичная кутикула: клетки ее не перекрываются, а располагаются встык, имеют вид пяти- или шестиугольников. У млекопитающих мозаичная кутикула находится в наиболее тонкой, прикорневой части волоса, а также покрывает, например, иглы дикобраза. У птиц она часто встречается на бородках опахала пера[96]. Считается, что такая структура придает волосу или перу особую прочность. Но у птиц чешуйка-мозаика составлена только одной клеткой, и даже виден след от круглого ядра в центре, а чешуйка-мозаика волоса млекопитающих состоит из нескольких клеток, и ядер в ней не видно[11, 27].
Покровные перья и пуховые волосы должны быть тонкими и гибкими. Эти свойства обеспечиваются сходным конструктивным решением. Кутикула этого типа перьев и волос представляет собой кольцевые сегменты, вставленные друг в друга: в расширенную часть нижнего сегмента вставлена зауженная часть верхнего. Получается членистая структура наподобие раздвижного телескопа. Только у перьев междоузлие длиннее, чем у волоса[26, 133].
Корковый слой состоит из плотно соединенных веретеновидных клеток. Кора и волос, и перьев может содержать воздушные полости. Воздушные полости улучшают теплозоляционные свойства покровов. Та же теплозащитная функция предопределила и сходное строение третьего слоя - сердцевины. Сердцевинный слой устроен по принципу сетки или ячеек, ограниченных клеточными стенками. Воздух внутри ячеек обеспечивает снижение теплопроводности, а ячеистая структура повышает механическую прочность[14, 130].
Отдельные морфологические компоненты пера образованы белковыми веществами, относящимися к группе твердых или мягких кератинов. Содержание этих протеинов составляет более 85% по массе. Твердые кератины отличаются повышенной химической устойчивостью, высоким содержанием серы, значительной термоустойчивостью и тенденцией к образованию ориентированных упорядоченных структур. Мягкие кератины характеризуются пониженной устойчивостью к химическим и термическим воздействиям, крайне низким содержанием серы, слабой структурированностью[37,125]. Аминокислотный состав различных кератинов не постоянен и значительно варьируется в зависимости от происхождения сырья (таблица 1.1.1). При исследовании аминокислотного состава кератина установлено, что в нем содержатся все незаменимые аминокислоты, причем в незначительных количествах [19, 45,69].
Аминокислотный состав кератина представлен из 19 аминокислотами. Среди них нет оксипролина и оксилизина, которые являются основными аминокислотами коллагена, а вместо них присутствуют серосодержащие аминокислоты цистин и цистеин [5, 22, 74].
Различия в аминокислотном составе кератина различных животных обуславливаются особенностями процесса ороговения эпителиальных тканей. В ряде случаев это связано с образованием различных по своему морфологическому характеру типов волоса. Так, например, волос кролика отличается от тонкорунной овечьей шерсти пониженным количеством серосодержащих аминокислот и повышенным содержанием аминокислот основного характера [98,43].
Это все указывает на то, что кератины представляют собой не индивидуальное химическое вещество, а целую группу белковых веществ.
Существенным отличием кератинов пигментированных волос и перьев животных от непигментированной тонкорунной овечьей шерсти, куриного пера, является повышенное содержание в первых тирозина. Так, в волосе ондатры находится приблизительно 10-14% тирозина, а в волосе белки 6-12%.Интересно отметить, что аминокислотный состав кератинов волоса пушных животных изменяется в соответствии с сезонной изменчивостью (линькой) волосяного по-крова[54,58,114].
Известно, что остатки аминокислот в белках соединяются друг с другом посредством пептидной связи, образуя так называемые полипептидные цепочки, агрегация которых приводит к формированию макромолекулы белка. Таким образом, следующим шагом в понимании структуры белка после расшифровки его аминокислотного состава являются вопросы о порядке чередования аминокислотных остатков в полипептидных цепочках, размерах полипептидных цепочек и природе остатков, находящихся в концевых участках цепочек.
Сведения, позволяющие судить о молекулярном весе макромолекул белка, минимальном числе образующих их полипептидов и об их характере, могут быть получены посредством определения аминокислот, образующих конечные участки полипептидных цепочек[80,101,138].
Аминокислотный состав кератина дает представление о строении его основных структурных единиц - молекулярных цепей, а также об активных группах, участвующих в образовании межмолекулярных связей и в значительной степени определяющих свойства кератина и их изменения под влиянием различных реагентов (рисунок 1.1.2)[108,113].
Объекты исследования
При выполнении работы использовали общепринятые, стандартные и оригинальные методы исследования. Отбор проб и подготовку их к анализу проводили по ГОСТ 26929. Активную кислотность измеряли на потенциометрическом анализаторе по ГОСТ 26781-85. Чистую культуру бактерий Bacillus pamilus, обладающую кератиназной активностью, получали из тухлого мяса говядины. Для этого говяжье мясо, нарезанное пластинками толщиной 3-5мм,помещали в чашках Петри в термостат при температуре 37-38Св течении суток для ускорения процесса загнивания.
Для изучения физиолого-биохимических свойств микроорганизмов использовали: - питательный агар, г/дм : панкреатический гидролизат рыбной муки - 12; пептон ферментативный - 12; натрия хлорид - 6; агар микробиологический - 10; рН-7,1-7,5. -крахмальный агар, г/дмЗ: крахмал растворимый - 10; калия гидрофосфат -1; магния сульфат - 1; натрия хлорид - 1; аммония сульфат - 2; кальция карбонат -2; железа сульфат - 0,001; марганца хлорид - 0,001; цинка сульфат - 0,001; агар-агар - 20. - среду Чапека, г/дмЗ: сахароза - 20; калия дигидрофосфат - 1; магния сульфат - 0,5; калия хлорид - 0,5; натрия нитрит - 2; агар-агар - 20. Компоненты питательных сред растворяюли в 1 дм дистиллированной воды, нагревали до полного расплавления агара, разливали в пробирки или колбы и стерилизовали 15 мин при температуре 121С (питательный агар и крахмальный агар) и 20 мин при 112 С (среда Чапека). Питательные среды для культивирования микроорганизмов были приготовлены в соответствии с ГОСТ Р 51758-2001.
Перед проведением исследований штаммы микроорганизма активировали. Для активации Bacilluspamilus использовалипитательный агар. Культивирование микроорганизмов проводили при температуре 38С и рН среды 7,1-7,5 в течение суток.
Культивированиемикроорганизма проводили в течение 72 ч в термостате при температуре 30-40 С. Полученный посевной материал засевали на плотные питательные среды (питательный агар, крахмальный агар, среда Чапека) методом глубинного и поверхностного посева.
При поверхностном посеве агаризованные питательные среды разливали в стерильные чашки Петри и после охлаждения подсушивали в термостате при 40±2С в течение 40-60 мин. После этого на поверхность агаровой пластины стерильной градуированной пипеткой вносили 0,05 см микробной суспензии.
Для глубинного посева 1 см микробной суспензии вносили в стерильную чашку Петри, заливалипитательным раствором, 45±2 С последующим перемешиванием.
Дифференцировку бактерии по биохимическим свойствам их клеточной стенки проводилис помощью метода Грама. Суть метода заключается в том, что клеточная стенка грамположительных бактерий прочно фиксирует генцианвио-лет, не обесцвечивается этанолом и потому не воспринимает дополнительный краситель (фуксин). У грам отрицательных микробов генцианвиолет легко вымывается из клетки этанолом, и они окрашиваются дополнительным красителем.
Для получения чистых культур палочковидных бактерий использовали метод Дригальского, основанный на механическом разделении микробных клеток на поверхности плотной питательной среды в чашках Петри.
Для определения метаболизма Сахаров у исследуемого штамма использовали тест-системуАРІ 50СН. Принцип работы тест-системы заключается в измене 43 ний цвета субстрата в лунках тест-полос при смещении рН в ходе обмена веществ микроорганизмов.
Результаты обработки секвенсов при помощи компьютерной программы, находящейся на сайте RDBII (RibosomalDatabaseProjectll), предназначенной для определения родства микроорганизмов и построения филогенетических деревьев, представляются в графическом виде.
Культивирование микроорганизмов осуществляли на питательном бульоне с добавлением различных солей: NaCI - 0,25%; КН2РО4 - 0,1%; СаСОз - 0,3%. Массовая доля солей была выбрана согласно имеющимся литературным данным.
По окончании культивирования культуральную жидкость отделяли от мицелия центрифугированием (3500-4000 об/мин), надосадочную жидкость - фильтрованием через фильтр «Красная лента».» В фильтрате определяли кератиназную активность.
Для определения кератиназной активности брали 200 мг измельченных перьев (предварительно промытых хлороформом и водой, высушенных на воздухе), до-бавляли 10 см 0,05 М боратного буфера рН 9,0, содержащего количество фермента, эквивалентное 0,02 единицы общей протеолитической активности (ПС). Энергично встряхивали и оставляли на 3±0,06ч при 37±2 С для гидролиза кератина. Параллельно проводили контрольную реакцию на растворение перьев в буфере и содержание растворимого белка в культуральной жидкости. Количество расщеп-ленного белка (мкг/см ) в культуральной жидкости за 1 ч гидролиза определяли по калибровочной кривой, построенной по растворам сывороточного альбумина.По окончании гидролиза оставшийся нерасщепленный белок осаждали раствором три-хлоруксусная кислоты и фильтровали. В фильтрате измеряли оптическую плотность при 340 нм.
Общее содержание белка определяли спектрофотометрическим методом по стандартной биуретовой реакции согласно ГОСТ 23327-78.
Общую бактериальную обсемененность ферментного препарата рассчитывали как среднее арифметическое число колоний микроорганизмов на 1 г препарата для всех разведений. Определение общего азота проводили с помощью анализатора белка RAPID N ELEMENT AR, в соответствии с европейскими стандартами. Принцип метода заключается в определении азота за счет сжигания анализируемого вещества известной массы в условиях высокой температуры (900±2 С) камеры в присутствии кислорода, что приводит к высвобождению углекислого газа, воды и азота, массовая доля которого детектируется прибором.
Содержание общего белка рассчитывали умножением общего азота на пересчетный коэффициент для микробного белка, составляющий 6,25. Содержание влаги определяли по ГОСТ Р 52838-2007. Содержание сырого протеина определяли по ГОСТ 13496.4-93. Определение аминного азота проводили спектрофотометрическим методом с использованием 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислоты (ТНБС). Метод основан на спектрофотометрическом определении хромофоров, образующихся при реакции первичных аминов с ТНБС. Количество аминного азота в исследуемых гидролизатах определяли по калибровочному графику, построенному для стандартных разведений известного вещества. Степень гидролиза определяли как отношение аминного азота к общему азоту.
Определение аминокислот проводили с помощью автоматического анализатора аминокислот AracusPMAGmbH, утвержденного директивами 98/64/ЕС и 2000/45/ЕС. Принцип метода состоит в катионообменном разделении аминокислот с шаговым градиентом рН и послеколоночной дериватизацией нингидрином. Для этого образцы предварительно подвергали кислотному (6 н. соляная кислота, температура 110С, в течение 24-72 ч) или ферментативному гидролизу.
Для математической обработки результатов исследований использованы методы регрессионного анализа с применением многофакторного планирования, градиентного метода и метода наименьших квадратов, линейного программирования. Графические зависимости на рисунках представлены после обработки экспериментальных данных по методу наименьших квадратов, реализованные в MicrosoftExcel и MatLAB 6.5. Для определения активности микроорганизмов в центрифужную пробир-ку отмеряли 1 см сыворотки и 1 см трихлоруксусную кислоту (ТХУ) 10%, перемешивали, закрывали пробкой и кипятили 20 мин на водяной бане. Далее-центрифугировали в течении 20 ±2 мин при скорости 1500 об/мин. 0,4 см цен-трифугата помещали в мерные пробирки и прибавляли 4 см фосфатного буфе-ра (рН=6,8) и 0,5 см 1% водного раствора нингидрина. Содержимое пробирки перемешивали и ставили в кипящую водяную баню. После появления лилового и фиолетовому цвета раствора пробирки охлаждали и доводили объем дистил-лированной водой до 7 см . Колориметрировали при зеленом светофильтре в кювете шириной слоя 5 см . Норма составляет 2,96 ±0,1 мг%.
Изучение влияния технологических параметров культивирования на кератинолитическаую активность Bacilluspumilus
Аэрация является неестественным фактором, который определяет рост и развитие микроорганизмов в процессе культивирования. Параметры аэрации для каждого вида микроорганизмов определяются в соответствии с особенностями развития, состава питательной среды, продолжительности культивирования и т.д.
Аэрация - это процесс поступления воздуха в питательную среду, который позволяет ускорить процесс окисления органических веществ в питательной среде, повышая их усвояемость для микроорганизмов, так как кислород является основным лимитирующим фактором при культивировании.
Принцип аэрации состоит в том, что атмосферный воздух проходит несколько степеней очистки под давлением, далее поступает в виде мелких пузырьков в питательную среду. Такой метод применяют при глубинном культивировании, для стимуляции роста аэробов скорость поступления кислорода должна быть не меньше скорости его потребления.
Культуру микроорганизмов высеивали в жидкую питательную среду объемом 5 дм в биореактор, подключали датчики насыщения кислородом, создавали оптимальные условия и задавали среднюю фиксированную скорость перемеши 70 вания 80 об/мин, варьируя только скорость подачи воздуха. В процессе культивирования наблюдали за ростом микроорганизмов и потреблением кислорода, в соответствии с этим изменяли насыщенность кислородом питательной среды, данные представлены на рисунке 3.3.1.
Из графика (рис. 3.3.1) видно, что насыщенность питательной среды кислородом составляет 46,5% в первый час культивирования микроорганизмов, при этом происходит адаптация микроорганизмов и распределение по всему объему, при дальнейшем культивировании наблюдается снижение объема потребляемого кислорода до минимального значения 26,3 %, что соответствует активации роста микроорганизмов.
В процессе дальнейшего культивирования для стимуляции роста микроорганизмов начали подачу кислорода до выхода на плато. Зависимость аэрации от насыщенности кислородом питательной среды представлена в таблице 3.3.6. Таблица 3.3.6- Зависимость аэрации от насыщенности кислородом питательной среды
Из таблицы 3.3.6 видно, что оптимальный для роста и развития штамма Ва-cillus ритйит объем подачи кислорода, должен составлять 1,150 дм /мин, так как данного объема хватает на развитие микроорганизмов без кислородного голодания. Далее проводили адаптацию микроорганизмов при подаче постоянного потока кислорода для оптимизации параметров ферментации. Анализ проводили по трем параметрам аэрации 0,465; 0,865; 1,150 дм /мин, наблюдали изменение прироста биомассы, активности белка от потребления кислорода.
На рисунке 3.3.2 представлена зависимость прироста биомассы, активности ферментов, массовой доли белка от потребления кислорода в процессе культивирования.
Из рисунка 3.3.2 видно, что для стабильного прироста биомассы без резких переломов, которые могут образовываться из-за кислородного голодания или чрезмерной аэрации, необходимое количество кислорода составляет 1,150 дм /мин. Также из графика на рисунке 3.3.2 следует, что целевой белок начинает накапливаться при продолжительности культивирования 6 ч.
Наблюдается высокая кератинолитическая активность при аэрации 1,150 дм /мин, что свидетельствует об интенсивном продуцировании фермента в куль-туральную жидкость без окисления. При объемах 0,465 и 0,865 дм /мин через 4 ч активность начинает снижаться, что связано с недостатком кислорода в культу-ральной жидкости. 1 «
Зависимость прироста биомассы, активности, белка от потребления кислорода в процессе культивирования.
Учитывая полученные результаты, были определены оптимальные интервалы варьирования основных параметров процесса культивирования. Оптимальным вариантом культивирования в ферментере объёмом 5 дм является продолжительность 21ч, при перемешивании 80 об\мин. Варианты с увеличением скорости перемешивания до 150 об/мин снижали скорость накопления целевого продукта, однако аэрация при 1,150 дм /мин позволяет ускорить процесс накопления белка. В таблице 3.3.7 представлены параметры процесса культивирования продуцентов кератиназы Bacillus pumilum в биореакторе.
Представленные оптимальные условия культивирования продуцента кератиназы Bacillus pumilum в дальнейшем применили для наработки фермента и определения оптимальной концентрации его внесения при проведении гидролиза перопухового сырья (таблица 3.3.8)
Очистку фермента проводили с применением сульфата аммония. Полученные очищенные образцы кератиназы полученные как с применением ультразвука для разрушения клеточных стенок микроорганизмов, так и без разрушения. За контроль принимали раствор протеиназы К в 50мМ фосфатном буфере, наиболее близкий по действию фермент щелочной протеазы.
Провели качественный анализ-сравнение на жидкостном хроматографе LC-20 Prominence на спектрофотометрическом детекторе с заданной длиной волны 280нм; скорость потока элюента - 1 мл/мин; элюент - 100мм натрий-фосфатный буфер с 0,3 м NaCl; объем инжекции - 20мкл; время анализа составило 30 минут. Хроматограмма образцов представлена на рисунке 3.3.3.
Состав, свойства и продолжительность хранения биопрепарата
Перо, полученное на птицефабрике, очищают промывкой от животноводческих загрязнений и продуктов убоя птицы, далее обрабатывают слабым щелочным раствором, который не оказывает отрицательного действия на перо. После промывки перо сушат, проверяют на наличие посторонних примесей и измельчают с добавлением карбоната кальция для простоты измельчения.
Параллельно проводят посев микроорганизмов на питательную жидкую среду с целью активации для получения работоспособных культур микроорганизмов Bacilluspumilus и наработки кератолитических ферментов.
Для активации и наработки микроорганизмов используют питательную среду LB следующего cocTaBa:NaCl -Юг/дм , дрожжевой экстракт-4г/дм , пептон -Юг/дм , фруктоза - 0,5 г/дм .
Посев производится в стерильных условиях. Далее культура культивируется при температуре 37± 2С, рН среды 6,8-7,0, в течение12 - 32 часов с постоянным перемешиванием, частота движения 80-120 об/мин.
После культивирования культуру микроорганизмов обрабатывают ультразвуком, ультразвук можно заменить охлаждением культуры до 5С для инактивации клеток, далее отделяют клетки от культуральной жидкости с помощью фильтрования под вакуумом.
Полученную культуральную жидкость при необходимости сушат на распылительной сушилке для получения однородной консистенции, мелкодисперсного порошка. Полученный биопрепарат получается с активностью 8,9Е/ мг, степенью очистки ГхЗ, так как микроорганизмы продуцируют фермент кератиназу во внешнюю среду, не задерживая и не накапливая его в клеточной мембране.
Технология получения биопрепарата для биотрансформации перопухового сырья представлена на рисунке 4.1.2.
В обезжиренное измельченное перо вносят полученный активный биопрепарат вместе с питательной средой и воду, в соотношении 25 г пера на 1дм воды и 3 гбиопрепарата.
Далее проводят процесс ферментативного гидролиза в течение 28+0,5 чпри температуре37±2С.Температурный режим выбран таким образом, что нагрев сырья с внесенными в биопрепаратомпозволяет активизировать ферменты для перевода кератина пера в усвояемую форму. Соответственно, процесс биотрансформации начинается сразу после внесения биопрепарата.
По окончании ферментативного гидролиза гидролизат подвергается инактивации. Параметры инактивации выбраны таким образом, чтобы ферменты пре 89 кращали свое действие на гидролизат. Так как фермент кератиназа работает в широком температурном диапазоне от 24до 65±2С, в связи с этим для инактивации выбрана низкая температура 0±1С в течение 10-15 мин. Данные параметры оптимальны для инактивации в производственных масштабах.
Фильтрация - это неотъемлемая стадия технологического процесса, так как в гидролизате могут оставаться взвести жестких частей пера, которые гидролизу-ются дольше, помимо этого в сырье могут присутствовать различные посторонние примеси. Во избежание засорения форсунки и поломки аппарата в процессе сушки сырье подвергают фильтрации, отделяя твердые фазы.
Следующей стадией в производстве белковой кормовой добавки является процесс сушки.Процесс сушки протекает чрезвычайно быстро (обычно 15-30 сек) и частицы в зоне повышенных температур имеют насыщенную поверхность, температура которой близка к температуре адиабатного испарения чистой жидкости.
Благодаря мгновенной сушке и невысокой температуре распыленных частиц материала высушенный продукт получается хорошего качества: например, не происходит денатурации белков, окисления, потерь витаминов и т. д.
Выбор распылительной сушки можно объяснить тем, что получаемый гидролизат имеет однородную консистенцию, а распылительная сушка позволяет исключить процесс измельчения сухого гидролизата, также гидролизат имеет повышенную растворимость. После распылительной сушки лишняя влага удаляется из продукта ферментативного гидролиза, и белковая добавка приобретает порошкообразную форму. Удаление влаги позволяет повысить срок хранения готовой продукции.
Контроль безопасности кормовой добавки необходим для проверки безопасности продукции для животных и, соответственно, человека. Кормовые добавки и кормовые смеси по показателям качества и безопасности должны соответствовать требованиям технических нормативных правовых актов, действующих на территории Российской Федерации.По санитарно-микробиологическим показателям высокобелковые кормовые добавки должны соответствовать нормам СанПиН 2.3.2.1078-01 (индекс 1.9.9.4). Следующая стадия подразумевает фасовку кормовой добавки для включения в комбикорма и при необходимости ее маркировку.
Последняя стадия связана с внесением кормовой добавки в комбикорма для сельскохозяйственных животных по предварительно разработанной рецептуре, для сбалансированности рациона.
Технологический регламент выработки белковой кормовой добавки и рецептуры (таблица 4.1.1) использован при разработке технической документации, включающей технические условия и технологическую инструкцию.
Массовая доля поваренной соли, %, не более 6,0 Поп.3.1 Биопрепарат хорошо растворим в воде, но допускается выпадение в осадок нерастворимого наполнителя. Определение растворимости в воде проводят 5 г исследуемого препарата (из общей пробы) взвешивают на технических весах в ста-канчике вместимостью 100 см и тщательно растирают стеклянной палочкой с небольшим количеством дистиллированной воды. Навеску переводят в цилиндр вместимостью 500 см , доводят дистиллированной водой до метки и оставляют на 10—15 мин при периодическом перемешивании. После этого визуально определяют растворимость биопрепарата.
