Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Анализ особенностей технологии криозамороженных бактериальных концентратов 9
1.1 Роль функциональных продуктов в питании человека 9
1.2 Основные направления производства бактериальных концентратов прямого внесения 15
1.3 Факторы, влияющие на выживаемость замороженных микроорганизмов 20
1.4 Виды защитных сред и криопротекторов 26
1.5 Методы оценки выживаемости микроорганизмов 42
1.5.1 Применение импедансного метода для определения выживаемости бактерий 43
1.6 Цель и задачи исследований 48
Глава 2. Объекты и методы исследований 50
2.1 Объекты исследований 50
2.2 Общепринятые и стандартные методы исследований 53
2.3 Оригинальные и модифицированные методики 57
2.3.1 Приготовление защитных сред 57
2.3.2 Получение бактериальной массы для криозамораживания 58
2.3.3 Оценка выживаемости микроорганизмов импедансным методом 61
2.3.4 Методика криозамораживания 66
2.4 Методы математической обработки экспериментальных данных 68
Глава 3. Экспериментальное изучение технологии получения криозамороженных бактериальных концентратов с использованием криопротекторов 71
3.1 Изучение влияния концентраций криопротекторов в защитной среде на выживаемость микроорганизмов 71
3.2. Экспериментальное обоснование выбора криопротекторов 77
3.3 Влияние криозамораживания на морфофункциональные и биохимические свойства исследуемых микроорганизмов 86
3.4 Влияние основы защитной среды на выживаемость микроорганизмов 93
3.5 Исследование реологических характеристик биомассы при смешивании ее с защитными средами 95
Глава 4. Опытная проверка режимов хранения и использования криозамороженных бактериальных концентратов 101
4.1 Изучение влияния режимов и сроков хранения на выживаемость 101
4.2 Экспериментальная технология использования защитных сред в процессе криозамораживания 115
4.3 Апробация замороженных бактериальных концентратов в промышленных условиях 119
4.4 Экономическая и социальная значимость 121
Выводы 127
Список литературы 129
Приложение 1 Методические рекомендации «Использование метода измерения электрического сопротивления для определения количества молочнокислых бактерий в заквасках и молочных
продуктах» 146
Приложение 2 Результаты измерений количества молочнокислых бактерий импедансным методом 147
Приложение 3 Лабораторный регламент (технологическая инструкция) использование криопротекторов
в производстве заквасок прямого внесения 149
Приложение 4 Акты о внедрении научно-исследовательской работы 150
Приложение 5 ТУ 9222- 00419785-10 Закваски прямого внесения штаммов Lactobacillus acidophilus NKl, Bifidobacterium bifidum 791, Bifidobacterium longum В 379M и консорциумов микроорганизмов (Lactobacillus acidophilus NKl, Bifidobacterium bifidum 791, Bifidobacterium longum В 379M) 152
- Факторы, влияющие на выживаемость замороженных микроорганизмов
- Оценка выживаемости микроорганизмов импедансным методом
- Влияние криозамораживания на морфофункциональные и биохимические свойства исследуемых микроорганизмов
- Изучение влияния режимов и сроков хранения на выживаемость
Введение к работе
Актуальность работы.
Обеспечение здоровья населения является одним из важнейших приоритетов в России. На федеральном и регионачьных уровнях поставлены задачи, связанные с продовольственной безопасностью страны.
Концепция оздоровления человека и предупреждения старения организма путем включения в рацион кисломолочных продуктов была впервые выдвинута И.И. Мечниковым, который исследовал свойства молока, ферментированного закваской, содержащей штаммы L.bulgaricum.
Впервые в России С.А. Королевым были применены закваски, т.е. чистые культуры молочнокислых бактерий, а также были проведены исследования микробиологических процессов по основным отраслям молочного производства. Под его руководством была основана первая школа отечественных микробиологов молочной промышленности. Его учениками, последователями и рядом других исследователей: Королевой Н.С., Банниковой Л.А., Богдановым В.М., Гудковым А.В., Лагодой И.В., Гуськовой Л.Д., Семенихиной В.Ф., Рожковой И.В., Ганиной В.И., Тихомировой Н.А., Шевелевой С.А., Шендеровым Б.А. заложены основы производства заквасок и бактериальных концентратов.
Опыт отечественной и зарубежной молочной промышленности и анализ научных публикаций показывает, что производство кисломолочных продуктов прогрессирует, увеличивается спрос на бактериальные концентраты, и, как следствие, повышаются требования к заквасочным культурам, а именно они должны обеспечивать безопасность и качество, вырабатываемой продукции, обеспечивать необходимый баланс штаммов, обуславливать удобство внесения. Этим требованиям в большей степени соответствуют бактериальные концентраты прямого внесения (DVS), так как их использование исключает процедуру восстановления культур перед сквашиванием; стадию перевивки в процессе хранения, что обеспечивает устойчивость в соотношении видов и штаммов микроорганизмов.
На сегодняшний день, при производстве бактериальных концентратов применяются два способа их консервирования: лиофилизация и замораживание при сверхнизких температурах (-196С). И если первый способ достаточно изучен и широко применяется в производстве, то сведения об использовании второго - носят ограниченный характер, он до сих пор не нашел промышленного применения в нашей стране. Несмотря на значительное количество исследований посвященных вопросам выживаемости микроорганизмов в процессе криоконсервирования, не имеется четких представлений о совокупности и взаимосвязях процессов, позволяющих применить технологию для промышленного производства бактериальных концентратов.
На российском рынке в настоящее время представлены дорогостоящие замороженные бактериальные концентраты импортного производства. Обеспечить молокоперерабатывающие предприятия отечественными
замороженными бактериальными концентратами не представлялось возможным, одной из причин являлось отсутствие технологии приготовления защитных сред обеспечивающих сохранность свойств и активности бактериальных концентратов. Следовательно, разработка технологии получения и способа применения криопротекторных сред, для получения бактериального концентрата прямого внесения, методом замораживания при сверхнизких температурах является актуальным вопросом, требующим систематического изучения.
Работа выполнена в ГНУ ВНИМИ в рамках темы РАСХН «Разработать комплекс экологически чистых энергосберегающих технологий для переработки молока на базе низких температур», а также Федеральной целевой программы "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники" на 2007-2012 годы по теме «Разработка технологий универсального быстропереориентируемого производства заквасок прямого внесения для биотехнологической промышленности».
Цели и задачи исследований.
Целью диссертационной работы является разработка технологии получения и способа применения криопротекторных сред, при производстве активных и стойких бактериальных концентратов молочнокислых бактерий, методом замораживания при сверхнизких температурах.
Для достижения полученной цели были сформулированы следующие задачи:
обосновать целесообразность использования криопротекторов, как компонентов защитной среды, для замораживания бактериальных концентратов;
разработать метод оценки выживаемости микроорганизмов на основе импедансной технологии;
разработать лабораторную методику криозамораживания
микроорганизмов;
изучить влияние криозамораживания на морфологические, культуральные и биохимические свойства исследуемых бактерий;
изучить влияние вида и концентрации криопротекторов в составе защитных сред на эффективность криозамораживания микроорганизмов;
изучить динамику изменения свойств криозамороженных микроорганизмов в процессе хранения при различных температурах;
разработать защитные среды для молочнокислых и бифидобактерий, подлежащих криозамораживанию, а также соответствующую нормативную документацию.
Научная новизна.
В результате проведенных исследований получены научно-обоснованные данные о влиянии состава защитной среды на эффективность процесса криозамораживания молочнокислых микроорганизмов и бифидобактерий.
Установлены зависимости, характеризующие интенсивность изменения микробиологических, биохимических, физико-химических процессов,
протекающих в замороженных бактериальных концентратах в процессе хранения от состава защитной среды;
Показана высокая эффективность применения разработанных
криозащитных сред для стабилизации свойств молочнокислых бактерий в
процессе консервации (криозамораживания), а также повышение
жизнеспособности в процессе хранения.
Практическая значимость работы.
Разработан лабораторный регламент (технологическая инструкция) использования криопротекторов в производстве заквасок прямого внесения. Определены физико-химические и микробиологические показатели, на основании которых обоснованы сроки и условия хранения и разработан лабораторный регламент хранения заквасок прямого внесения. Разработана методика определения количества молочнокислых бактерий и динамики их роста на основе импедансного метода. По результатам работы подана заявка на получения патента на способ замораживания молочнокислых бактерий с использованием разработанной криозащитной среды. Проведена выработка кисломолочного продукта «Ацидофилин» на ОАО «Кезский сырзавод» и ЗАО «Кировском молочном комбинате», где использовали криозамороженный бактериальный концентрат на основе культуры Lb. acidophilus, изготовленный с применением защитной среды КС-20 на участке научно-исследовательских и экспериментальных работ ГНУ ВНИМИ Россельхозакадемии. В результате выработки был получен кисломолочный продукт «Ацидофилин», полностью отвечающий требованиям нормативной документации.
Апробация работы и публикации.
Основные результаты работы доложены на Международном симпозиуме «Лактоза и ее производные» г.Москва (2007); Международной научно-практической конференции «Совершенствование технологий производства продуктов питания в свете государственной программы развития с-х на 2008-2012 гг." г.Волгоград(2008); на конференции-конкурсе научно-инновационных работ молодых ученых и специшшетов «Отделения хранения и переработки сельскохозяйственной продукции» Россельхозакадемии, г.Москва (2008,2009); на международной научно-практической конференции «Передовые технологии и оборудование в производстве молока» г.Брсст (2009).
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ и подана заявка на изобретение №2010120515 от 24.05.2010г. «Способ замораживания молочнокислых бактерий».
Структура и объем диссертации.
Факторы, влияющие на выживаемость замороженных микроорганизмов
При всех способах, которые сейчас применяют на практике для низкотемпературного замораживания биологических объектов, в них происходят глубокие изменения, в том числе изменение агрегатного состояния структуры системы, состава и других физико-химических свойств. Основная масса повреждений клеточных структур в период замораживания прямо или косвенно связана с образованием кристаллов льда.
Одна из наиболее ранних гипотез о повреждении биологических структур при замораживании была выдвинута в работах Н.А. Максимова 121 на основе интуитивного представления о механическом повреждении этих структур растущими кристаллами льда. Это повреждение могло быть деформацией и разрывом мембран, нарушением межклеточных контактов и пр. Позже, Т. Ней /90/ изучая повреждения эритроцитов, сделал вывод о существовании феномена механического раздавливания клеток растущими кристаллами внеклеточного льда. Также повреждение клеток происходит во время рекристаллизационного укрупнения внутриклеточного льда при отогреве, что отмечал в своих трудах Дж.К. Шерман/27/. Механизм повреждения клеток при образовании, росте и рекристаллизации внутриклеточных кристаллов окончательно не выяснен. Повреждения могут быть вызваны как проявлением механического феномена, так и обезвоживающим действием внутриклеточного льда.
В свою очередь, П.Мейзур /12/ привел доказательства, что внутриклеточная кристаллизация является непосредственной причиной криоповреждения, а не следствием воздействия других повреждающих факторов, что позволило ему в дальнейшем сформулировать гипотезу криоповреждения. Согласно этой гипотезе на выживаемость клеток в процессе кристаллизации оказывают влияние два типа явлений. К первому типу относятся такие явления, как:
- чрезмерное осмотическое обезвоживание клеток, в результате которого увеличивается концентрация внутриклеточных веществ, приводящая к необратимой денатурации белков или к повреждению мембранных структур;
- разрушение клетки за счет контакта с омывающей кристаллы льда средой, концентрация растворенных веществ в которой из-за превращения части растворителя в лед непрерывно увеличивается вплоть до эвтектической области;
- резкое изменение кислотности и ионной силы растворов вне и внутри клеток в процессе замораживания;
- повреждение клеточной мембраны вследствие достижения клеткой минимального объема.
Второй тип явлений повреждения связан с образованием-внутриклеточных кристаллов льда, которое приводит к таким же явлениям, что и обезвоживание, кроме того, вызывает механическое разрушение мембранных структур, особенно в процессе рекристаллизации внутриклеточных кристаллов при размораживании суспензии. /68/
В целом в процессе низкотемпературного замораживания клетки оказываются в условиях, очень далеких от тех, в которых они обычно функционируют. При этом они подвергаются воздействию такого количества неблагоприятных факторов, что для предотвращения необратимых повреждений на практике применяют различные приемы, в том числе, подбор защитных (криопротекторных) сред.
Как правило, наиболее значительной по объему составной частью защитной среды является криопротектор, т.е. специальное вещество или набор веществ, способное предотвращать развитие повреждений биологического материала при его замораживании и последующем оттаивании. В этой связи поиск оптимальных по своему воздействию криопротекторов является актуальной задачей.
Помимо физических изменений в процессе криозамораживания, различные исследователи выделяют ряд факторов, влияющих на выживаемость и стойкость микроорганизмов при замораживании-оттаивании, а именно:
1. Вид микроорганизмов. Чувствительность бактерий к замораживанию и оттаиванию сильно варьируется в зависимости от вида микроорганизма/9, 120/ и их морфофизиологического состояния: клетки, находящиеся в стационарной фазе роста, менее устойчивы к повреждающему действию низкотемпературной консервации, чем клетки, находящиеся в экспоненциальной фазе роста. Поэтому клетки для замораживания обычно отбирают в середине экспоненциальной фазы роста./64/ Разные виды микроорганизмов обладают различной криорезистентностью, т.е. устойчивостью к криозамораживанию. К факторам, обуславливающим различную криорезистентность микроорганизмов можно отнести видовую принадлежность, размеры, форму, морфофункциональные особенности организации и метаболизма./127/ Так, форма шаровидных бактерий более оптимальна за счет минимального значения поверхностного натяжения. При этом внешнее давление на мембрану равномерно распределяется по поверхности и передается внутрь сферы, в результате чего клетки деформируются равномерно и на поверхностной мембране не создается участков повышенного риска. Наличие клеточной стенки у бактерий повышает их устойчивость в негативному воздействию низкотемпературного замораживания./119,140,147,149/ По некоторым данным молочнокислые стрептококки обладают высокой криостабильностыо, из них наиболее криолабильны S.cremoris, промежуточное положение занимал S.diacetilactis, наиболее стабильным оказался вид S.lactis./2/ Недостаток данных по изучению криорезистентности лакто- и бифидобактерий, не говоря уже о конкретных штаммах, используемых при производстве бактериальных концентратов, требует дополнительных исследований.
2. Концентрация клеток в суспензии. Концентрация клеток в замораживаемой суспензии влияет на выживаемость микроорганизмов. Ряд исследователей отмечают, что выживаемость клеток не зависит от первоначальной концентрации клеток в суспензии./5/ Другие — указывают, что жизнеспособность микроорганизмов значительно повышается, если исходная концентрация клеток в суспензии была высокой, порядка 109 10пКОЕ/см3./9,90/
3. Режим охлаждения. Одним из ведущих факторов, влияющим на эффективность криозамораживания является режим охлаждения. На практике применяют несколько способов охлаждения. Одним из них является поэтапное замораживание, например, с помощью программного замораживателя. На первом этапе биомасса медленно (2-40С/мин) охлаждается до температуры минус 20-30С с последующей адаптацией в течении 5-20 минут, на втором этапе скорость охлаждения увеличивается до 60С/мин. После охлаждения биомассы до минус 70С скорость охлаждения снижается до 5-8С/мин, при таком данной скорости биомасса охлаждается до температуры минус 120С, после чего образцы помещаются в криохранилища/2,112/. При таком режиме замораживания образовавшиеся внутриклеточные кристаллы льда на первом этапе охлаждения не повреждают клетку, так как их размеры не достигают критического значения.
Температурная остановка обеспечивает снижение интенсивности обезвоживания клетки, способствует рекристаллизации внутриклеточных кристаллов в более крупные, но не превышающие критических размеров, с последующим их растворением. На последнем этапе охлаждения внутриклеточные кристаллы не зарождаются вплоть до эвтектической точки/170/. Поэтапное замораживание нашло широкое применение в медицине при криоконсервации клеток крови и костного мозга. Также этот способ оптимален для дрожжей: на первом этапе от +20 до -20С со скоростью 0,2С/мин, на втором от -20 до -196С со скоростью 2-3 С/мин. В клеточных линиях (L929 ВНК-21, ДМ-15, Sp2/0) используемых в производстве вакцин и биологически активных веществ, при быстрых (300-400С/мин) скоростях охлаждения до -196С без применения криопротектора гибель клеток составляет примерно 99%. Применение медленного охлаждения со скоростью 2-3С/мин до -80С с последующим погружением в жидкий азот, позволило повысить содержание сохранных клеток в суспензии/80,95/.
Быстрое замораживание со скоростью 300-400С/мин осуществляется погружением клеток в жидкий азот, при этом важен размер частиц, подвергнутых замораживанию/131/. Одним из преимуществ быстрого охлаждения является то, что в этих условиях действие концентрированных солевых растворов после выделения льда занимает менее продолжительный период до достижения их эвтектической точки. /67,120/ Исследования молочнокислых стрептококков показали, что при медленных скоростях охлаждения —1 и 6С/мин количество жизнеспособных клеток было на 30-40% ниже, чем после замораживания их при скорости охлаждения 400С/мин. При скорости охлаждения 60С/мин отмечалась тенденция к уменьшению количества жизнеспособных стрептококков/134,150,158/. В целом, метод быстрого замораживания является перспективным при производстве замороженных бактериальных концентратов и с позиций использования более простых технических решений.
Оценка выживаемости микроорганизмов импедансным методом
Для изучения эффективности криозамораживания микроорганизмов, как отмечалось ранее, требуется достоверный метод, позволяющий кроме количественного учета оценивать функциональную активность микроорганизмов, подвергнутых замораживанию/оттаиванию. Для удовлетворения поставленной задачи наиболее приемлемо применение импедансного метода. На его принципах основана работа микробиологического анализатора БакТрак 4300 (рисунок 2.3.1), который был выбран нами для дальнейших экспериментов.
Предварительно, используя в качестве исследуемых образцов молоко-сырье, была разработана методика выполнения измерений и проведена аттестация и стандартизация метода. Результаты проведенной работы, позволили нам разработать лабораторную методику для определения количества жизнеспособных молочнокислых микроорганизмов.
Методика включает в себя следующие основные этапы:
1. Установка параметров измерения:
- температура измерения: 30С — для мезофильных бактерий, 37С — для термофильных бактерий;
- интервал измерения: 10 минут;
- время нагрева: 1 час;
- М-параметр: 5%.
2. Посев 1 см предварительно подготовленного образца вносили в измерительную ячейку с 9 см среды. Количество засеваемого образца устанавливают в соответствии с таблицей 2.3.1.
3. Учет результатов происходит автоматически, при пересечении порогового значения. При наличии соответствующего калибровочного файла результат определения КОЕ выдается автоматически в виде количества микроорганизмов в исследуемом образце. Если высевали образцы из разведений, то результат определения КОЕ необходимо было умножить на степень разведения для получения значения КОЕ в 1 см3 исследуемого образца.
Для подтверждения достоверности разработанного метода оценивали результаты, полученные методом посева на твердые питательные среды и разработанным нами. Кроме того, в соответствии с рекомендациями изготовителя прибора была выполнена калибровка прибора /30,61/. Для этого были приготовлены образцы с различным содержанием молочнокислых бактерий (диапазон не менее 4 логарифмических единиц), с последующим высевом на чашки Петри и в измерительные ячейки анализатора.
Пропорциональность количества микроорганизмов в образце по отношению к времени определения изменения импеданса выражается математически с помощью линейной регрессии.
По результатам измерений были составлены уравнения регрессии и определены коэффициенты детерминации R . Уравнение линейной регрессии имеет вид: y(logKOE)=kjx+k0 где, к/ и к0- калибровочные коэффициенты.
Метрологические характеристики метода измерения определяются коэффициентом корреляции (г) и дисперсией (syx), выражаемой в логарифмических единицах.
Коэффициент корреляции г должен превышать значение (-0,85), а коэффициент детерминации R должен стремиться к +1.
На рисунке 2.3.2 а) представлены кривые роста L. acidophilus, данные приведенных измерений (Приложение 2) были использованы для определения корреляции между логарифмом количества микроорганизмов и временем определения импеданса, коэффициенты полученного уравнения регрессии /=-0,2904 и 0=9,3046 занесены в калибровочный файл, для последующего определения количества L.acidophilus в образцах. Полученный график регрессии отображен на рисунке 2.3.2 б).
На рисунке 2.3.3 а) представлены кривые роста Str.thermophilus, по результатам приведенных измерений (Приложение 1) рассчитано уравнение регрессии с коэффициентами Агу -0,5544 и о=9,4024. График регрессии отображен на рисунке 2.3.2 б).
Эффективность криозамораживания оценивали по степени активности клеток и количеству жизнеспособных микроорганизмов после замораживания. Результат выражали в процентах, как отношение количества оставшихся жизнеспособными после замораживания клеток к количеству клеток в суспензии до замораживания.
С помощью импедансного метода проводили постановочные эксперименты, а именно определяли период эквилибрации. Постановочные эксперименты выполняли с использованием культуры Lb. acidophilus.
Время эквилибрации определяли, изучая активность клеток после внесения биомассы в защитные среды, содержащие проникающие криопротекторы, а именно, глицерин и полиэтиленгликоль. Для этого каждые 20 минут отбирали по 1 см3 смеси и с помощью микробиологического анализатора БакТрак 4300 проводили сравнение активности клеток в образцах.
Влияние криозамораживания на морфофункциональные и биохимические свойства исследуемых микроорганизмов
Руководствуясь полученными данными, следующим этапом работы было конструирование защитной среды с оптимальной концентрацией криопротекторов. Полученная защитная среда должна обеспечивать сохранность клеток в процессе криозамораживания, и главное в процессе хранения.
Для построения плана эксперимента по определению влияния концентрации криопротекторов в защитной среде, были проанализированы данные постановочных экспериментов, которые позволили определить факторы и задать область их изменения.
Сведения об областях определения факторов, точности поддержания уровней и области, в которых по литературным данным и результатам предварительных экспериментов оптимизация наиболее целесообразна, представлены в таблице 3.3.1.
Анализ уравнений и поверхностей на рисунке 3.3.1-3.3.3 позволил прогнозировать изменения выживаемости бактерий в зависимости от концентрации криопротекторов. Переход окраски от светло-зеленого к коричневому соответствует изменению выживаемости от минимума до максимума.
На рисунке 3.3.1 представлена зависимость выживаемости Str. thermophilus от концентрации криопротекторов в защитной среде.
Данную зависимость описывает уравнение: ух = 8,9593 + 4,3293xj + 2,0815х2 - 0,0893х,2 - 0,018 х2 - 0,034х22
Коэффициент корреляции, для представленной модели равен 0,9204, что указывает на её высокую точность.
При изменении концентрации глицерина от 0 до 25% (при минимальном значении сахарозы) выживаемость Str. thermophilus увеличивалась до 60%, дальнейшее увеличение концентрации глицерина вело к снижению выживаемости. Концентрация сахарозы оказывала менее интенсивное влияние, чем глицерин. Выживаемость при максимальной концентрации сахарозы (при минимальной концентрации глицерина) достигала 40%. Область максимальной выживаемости Str. thermophilus наблюдалась при совместном воздействии глицерина в концентрации от 15 до 25% ) и сахарозы (15 до 20%).
На рисунке 3.3.2 область максимальной выживаемости клеток 89- 93 % четко выражена на поверхности отклика и соответствует выбранным параметрам: концентрация глицерина 20%; концентрация сахарозы 20%, причем прослеживается зависимость выживаемости L. acidophilus от соотношения криопротекторов в защитной среде, которая может быть описана уравнением:
Коэффициент корреляции, равный 0,9021, указывает на наличие сильной зависимости выживаемости от перечисленных выше показателей.
При изменении концентрации глицерина от 0 до 25% (при минимальном значении сахарозы) выживаемость L. acidophilus увеличивалась до 70%, дальнейшее увеличение концентрации глицерина вело к снижению выживаемости. Выживаемость при концентрации сахарозы от 20 до 30% (при минимальной концентрации глицерина) достигала 50%.
При рассмотрении зависимости выживаемости В. adolescentis (рисунок 3.3.3) отмечено смещение области оптимума. Максимальная выживаемость наблюдалась при концентрации глицерина 15% и концентрации сахарозы 25%. у3 = 29,9 + 2,19х1 - 0, Об !2 + 2,6х2 - 0,05х2 - 0,0 Цх2
Коэффициент корреляции, равный 0,8936.
В таблице 3.3.3 представлены наилучшие результаты, полученные в процессе исследования зависимости выживаемости бактерий от концентрации криопротекторов и их композиции.
Таким образом, проведенные исследования позволили установить оптимальные значения концентрации криопротекторов, а также определить их соотношение в защитной среде. Полученные данные подтверждают наше предположение об улучшении криопротекторных свойств защитной среды при комбинировании экзо- и эндоцеллюлярных криопротекторов.
Изучение влияния режимов и сроков хранения на выживаемость
Не менее важным условием, влияющим на выживаемость бактерий, является температурный режим хранения. В опубликованных работах приводятся противоречивые данные по хранению криозамороженных бактерий при различных температурах. В целом они свидетельствуют о положительном влиянии снижения температуры хранения на выживаемость бактерий. При изучении влияния режимов хранения на выживаемость использовали два температурных режима, которые наиболее оправданны с экономической точки зрения, это минус 25 и минус 40С.
При проведении исследований непосредственно после криозамораживания, упаковки и маркировки образцы бактериальных концентратов закладывали на хранение при соблюдении указанных выше режимов. Выживаемость бактерий анализировали через 24 часа после замораживания и после одного, трех и шести месяцев хранения. Данные экспериментов с использованием защитных сред, состав которых приведен ранее (см. табл. 3.4.1) представлены в таблице 4.1.1.
В процессе хранение L. acidophilus при температуре минус 25С выживаемость снижалась в среднем на 7%, такая же тенденция отмечена при хранении Str. thennophilus и В. adolescentis. Температурный режим минус 40С в меньшей степени оказывал влияние на выживаемость, снижение составило не более 2-3%.
Во всех случаях наклон кривых, характеризующих снижение выживаемости бактерий в ходе хранения, является более пологими при более низких температурах хранения, что еще раз подтверждает предположение о положительном влиянии более низких температур на стойкость бактериальных концентратов при хранении.
Применение среды КСБ-15, приготовленной на основе MRS-бульона, при промышленном производстве замороженных бактериальных концентратов экономически не целесообразно ввиду сравнительно высокой стоимости составляющих компонентов среды, при том что показатели выживаемости существенно не превышают выживаемость, полученную при использовании среды КС-20.
В целях проверки эффективности использования предложенной защитной среды КС-20 были проведены дополнительные исследования влияния криозамораживания на качественные признаки исследуемых микроорганизмов. Полученные результаты представлены в таблице 4.1.2.
Под влиянием криозамораживания микроорганизмы не претерпевали существенных изменений, так после криозамораживания L.acidophilus размер клеток не изменился. Микроскопическая картина представлена грамположительными палочками, расположенными в виде коротких цепочек (рисунок.4.1.7).
Str.thermophilus представляли собой цепочки разной длины, состоящие из кокков. После криозамораживания в микроскопичиских препаратах Str.thermophilus наблюдалось увеличение коротких цепочек за счет разрыва длинных (рисунок 4.1.8). Размеры кокков после криозамораживания не изменились.
После криозамораживания не наблюдалось изменения спектра сбраживаемых углеводов: все исследуемые культуры ферментировали глюкозу, сахарозу, лактозу и раффинозу.
При изучении степени повреждения поверхности мембран клеток подвернутых замораживанию и хранению в течении 6 месяцев при температуре минус 40С с применением защитной среды КС-20, получили результаты представленные в таблице 4.1.3.
На основании полученных результатов при сравнении с контрольными образцами установлено, что после криозамораживания с применением данной защитной среды происходит возрастание освобождения УФ-поглощающих веществ, что говорит о незначительных повреждениях мембран клеток. Ввиду того, что существенных изменений протеолитической активности и активности кислотообразования исследуемых микроорганизмов не обнаружено, можно рекомендовать данную среду для производства бактериальных концентратов.
Таким образом, в процессе разработки технологии получения и способа применения криопротекторных сред, для получения активного и стойкого бактериального препарата молочнокислых бактерий, методом криозамораживания при сверхнизких температурах было предпринято исследование влияния различных защитных сред на выживаемость, сохранность морфологических и физико-биологических свойств молочнокислых бактерий и бифидобактерий.
Изучение влияния криозамораживания на морфофункциональные и биохимические свойства исследуемых бактерий позволило установить, что в процессе криозамораживания исследуемые культуры сохраняли свои морфологические признаки и ферментативные свойства. Снижение выживаемости и функциональной активности в процессе замораживания и хранения в выбранных режимах еще раз подтвердило необходимость использования криопротекторов.
Получено дополнительное подтверждение о том, что выживаемость бактерий зависит от фазы роста. Для начальной и средней стадии логарифмической фазы роста характерно интенсивное течение метаболических процессов, есть основания считать, что в таком активном состоянии происходит усиление криорезистентости бактерий. Вероятно, что определенную роль в устойчивости клеток к низким температурам может играть липидный состав клеток и мембран, который у молочнокислых бактерий может изменяться в зависимости от фазы развития культуры./38,126/
Полученные результаты показали, что наиболее высокие показатели выживаемости бактерий наблюдались при замораживании культуры в период логарифмической фазы роста, что согласуется с вышеизложенными представлениями.
Вопрос влияния состава защитных сред на выживаемость и сохранность свойств бактерий тесно связан с поиском защитных веществ или криопротекторов. Результаты показали, что из выбранных веществ, обладающих криопротекторными свойствами, наиболее эффективным оказалось использование глицерина. При мгновенном замораживании клеток максимальную (78-92%) выживаемость обеспечивало добавление в защитную среды 20% глицерина. Меньшая (48-70%) выживаемость при данном режиме наблюдалась при использовании 15%-ного глицерина. При замораживании клеток под защитой 10- и 15%-ной лактозы и сахарозы сохранность клеток снижалась до 39-44%.
Выживаемость молочнокислых бактерий может в значительной степени определяться скоростью отогрева. К факторам, повреждающим клетки в ходе отогрева можно отнести процессы вне- и внутриклеточной рекристаллизации.
Использование предложенного нами метода быстрого отогрева замороженных культур в молоке, подогретом до температуры 37-40С, не выявило статистически достоверных отклонений в выживаемости и функциональной активности исследуемых бактерий. Очевидно, что при быстром отогреве кристаллы льда не успевают достичь значительных размеров, что снижает вероятность повреждения клеток.
