Содержание к диссертации
Введение
1. Аналитический обзор 8
1.1. Химозин и пепсин - основные молокосвертывающие ферменты 8
1.1.1. Терминология 8
1.1.2. Номенклатура, структура, физико-химические и технологические свойства химозина и пепсина 10
1.2. Проблема дефицита сырья для производства натуральных молокосвертывающих ферментов 17
1.3. Молокосвертывающие ферментные препараты животного происхождения: краткий обзор рынка и перспективные разработки 20
1.3.1. Отечественные препараты сычужного фермента и говяжьего пепсина 20
1.3.2. Импортные препараты животного происхождения 21
1.3.3. Генноинженерные препараты химозина 21
1.3.4. Перспективные генноинженерные препараты 24
1.4. Современные технологические схемы получения коммерческих мо локосвертывающих препаратов животного происхождения 27
1.4.1. Технологии получения натуральных препаратов 28
1.4.2. Технология получения рекомбинантных препаратов 30
1.5. Основные физико-химические методы выделения и очистки молокосвертывающих ферментов 32
1.5.1. Осаждение белков методом высаливания 32
1.5.2. Ионообменная хроматография 34
1.5.3. Гидрофобная хроматография 35
1.6. Северные олени как потенциальный источник молокосвертывающих ферментов 43
1.6.1. Краткое описание вида 43
1.6.2. Численность популяции северных оленей в России и в мире 44
1.6.3. Первичная обработка оленины и средний выход сычугов 45
1.6.4. Потенциальные возможности сырьевой базы северного оленеводства. Теоретические расчеты 46
1.7. Заключение по обзору. Цель и задачи исследований 48
2. Организация работы, объекты и методы исследований 53
2.1. Организация экспериментов и объект исследований 53
2.2. Методы исследований 55
2.2.1. Определение молокосвертывающей активности 55
2.2.2. Определение протеолитической активности 56
2.2.3. Жидкостная хроматография низкого давления 58
2.2.4. Статистическая обработка результатов 60
2.2.5. Другие методы 61
3. Результаты исследований 62
3.1. Выделение молокосвертывающего фермента из сычугов северных оленей 62
3.1.1. Критерии выбора основных параметров 62
3.1.2. Метод получения молокосвертывающего фермента из сычугов северных оленей 63
3.1.3. Выход ферментативной активности 64
3.1.4. Исследование белкового состава экстракта, супернатанта и высола 64
3.1.5. Потенциальные возможности использования сырьевой базы ц северного оленеводства для производства МФП 66
3.2. Оптимизация процедуры выделения методом высаливания 67
3.2.1. Осаждение молокосвертывающего фермента из сычугов северных оленей различными концентрациями сульфата аммония 67
3.2.2. Исследование белкового состава осадков и супернатантов 69
3.3. Частичная очистка молокосвертывающего фермента из сычугов северных оленей. Некоторые физико-химические характеристики частично очищенного препарата 71
3.3.1. Хроматография на SP-Sephsrose FF 71
3.3.2. Хроматография на DEAE-Sephsrose FF 73
3.3.3. Одностадийный метод выделения молокосвертывающего фермента из сычугов северных оленей методом хроматографии на DEAE-Sepharose FF 74
3.3.4. Исследование полипептидного состава и протеолитической активности частично очищенного препарата 76
3.4. Выделение молокосвертывающего фермента из утилизируемой тех нологической жидкости методом гидрофобной хроматографии 81
3.4.1. Исследование возможности сорбции и десорбции молокосвертывающего фермента на гидрофобном сорбенте 82
3.4.2. Конечная схема выделения молокосвертывающего фермента из утилизируемой технологической жидкости методом гидрофобной хроматографии на Phenyl Sepharose CL-4B 86
3.5. Блок-схема технологического процесса получения молокосвертывающего ферментного препарата из сычугов северных оленей 91
3.6. Основные технологические характеристики молокосвертывающего фермента из сычугов северных оленей 92
3.6.1. Соотношение активности пепсина и химозина 93
3.6.2. Влияние основных технологических параметров на молоко-свертывающую активность препарата 94
3.6.3. Термостабильность 100
3.6.4. Протеолитическая активность 103
3.6.5. Ферментативная стабильность 108
3.7. Испытание молокосвертывающего фермента из сычугов северных оленей при выработке сыра 109
Выводы 119
Список литературы
- Химозин и пепсин - основные молокосвертывающие ферменты
- Проблема дефицита сырья для производства натуральных молокосвертывающих ферментов
- Организация экспериментов и объект исследований
- Выделение молокосвертывающего фермента из сычугов северных оленей
Введение к работе
Производство сыра - наиболее важная сфера использования молока во всех странах мира. Объемы производства сыров ежегодно увеличиваются в соответствии с постоянным повышением спроса на этот продукт. Анализ мировых и Российских показателей за период с 1998 по 2004 год подтверждает долгосрочную тенденцию увеличения объемов выработки сыров [36,33]. Даже при быстрых темпах роста производства свежих молочных продуктов, сыр поглощает около 40% мировых объемов производства молока [36].
Увеличение объемов производства сыров неразрывно связано с увеличением выпуска молокосвертывающих препаратов. Традиционно, при производстве сыров используются натуральные молокосвертывающие ферментные препараты (МФП), получаемые из сырья животного происхождения. Наиболее широко в сыроделии применяются препараты сычужного фермента (химозина), говяжьего пепсина и их смесевые композиции. Эти препараты хорошо изучены, апробированы, их использование позволяет вырабатывать сыры самого высокого качества [2]. Сырьем для производства сычужного фермента служат сычуги телят-молокопоек (легких телят), ягнят и козлят. Препараты пепсина получают из желудков взрослых коров, свиней и других сельскохозяйственных животных [41].
Однако, возникшая во второй половине 20 века, в связи с постоянным ростом мирового производства сыров, проблема дефицита сычугов легких телят (а следовательно, и проблема дефицита натурального сычужного фермента), не решена и в настоящее время [7,56,116,190]. В конце 20 столетия, проблема усугубилась, после распространения в ряде европейских стран эпидемии прионовых заболеваний среди сельскохозяйственных животных, являвшихся источниками сырья для производства натуральных МФП [60,77,134,150,197].
Альтернативой натуральным МФП в течение последних 15 лет являются препараты химозина, полученные методами генной инженерии с использованием рекомбинантных ДНК [95,166,226,244]. Однако, широкому использованию
рекомбинантных химозинов, препятствует невозможность оценки отдаленных последствий использования рекомбинантных белков, а также ряд вопросов технологического, этического и экономического характера [57,106,110,206,222].
В наши дни российские производители натуральных МФП (прежде всего химозина) испытывают нехватку доступного отечественного сырья и вынуждены приобретать его в странах ближнего и дальнего зарубежья (Республика Беларусь, Украина, Польша).
Очевидно, что решение проблемы дефицита сырья для производства натуральных МФП, должно идти по двум основным направлениям. Во-первых, поиск новых сырьевых источников, во-вторых, внедрение современных технологий, позволяющих интенсифицировать уже существующие производственные схемы.
Цель настоящей работы - исследование возможности расширения сырьевой базы производства натуральных МФП, за счет использования нетрадиционных источников, одним из которых являются сычуги северных оленей.
Вести научные изыскания, не опираясь на предшествующий опыт работы отечественных и зарубежных исследователей, невозможно. Среди тех, кто, по мнению автора, внес наиболее значительный теоретический и практический вклад в исследование натуральных МФП и в разработку проблемы их дефицита - И.П.Бузов, Л.М.Гинодман, А.В .Гудков, В.И.Звягинцев, В.К.Неберт, В.А.Краюшкин, P.F.Fox, M.L.Green, B.Foltmann, D.B.Emmons и другие.
Формально, о результатах проведенной работы можно сказать следующее. Методом экстракции и последующего осаждения, из сычугов СО выделен молокосвертывающий фермент и изучены его основные физико-химические свойства. Исследована ферментативная стабильность жидкого препарата и влияние на этот параметр ионов кальция. Экстраполяция данных по выходу ферментативной активности, на сырьевые возможности северного оленеводства показывает, что организация промышленной переработки сычугов СО, позволит вырабатывать дополнительно от 2,5 до 5 тонн МФП с активностью 150 ты-
7 сяч условных единиц. Такое количество МФП даст возможность получать ежегодно от 22300 до 44600 тонн сыра.
Большое внимание уделено различным технологическим аспектам выделения МФ из сычугов СО. Исследована эффективность процедуры высаливания МФ в зависимости от концентрации сульфата аммония. Определена концентрация СА, которая позволяет получать препараты МФ с высокой удельной активностью и выходом, близким к максимальному. Разработана одностадийная хроматографическая процедура выделения МФ из экстракта сычугов. В целях повышения эффективности технологии производства препарата, разработан метод дополнительного выделения МФ из утилизируемой технологической жидкости с использованием гидрофобного хроматографического сорбента. Результатом этого этапа работы стала оригинальная технологическая блок-схема производства МФП из сычугов СО. По итогам работ с применением метода гидрофобной хроматографии подана заявка (Регистрационный № 2005109079 от 29.03.2005) на выдачу патента Российской Федерации на полезную модель: "Линия производства молокосвёртывающего ферментного препарата".
Проведено сравнительное исследование основных технологических свойств МФ из сычугов СО, телячьего сычужного фермента и говяжьего пепсина. Показано, что по ряду характеристик, - подчинению закону Шторка и Зе-гелке, зависимости МА от концентрации ионов кальция и рН, по устойчивости к действию мочевины — МФ из сычугов СО в большей степени похож на говяжий пепсин, чем на сычужный фермент. По терморезистентности МФ из сычугов СО уступает ГП и ОКО СФ, и является, таким образом, наименее термостабильным. Отличительной характеристикой МФ из сычугов СО, представляющей наибольший интерес, является низкая абсолютная и относительная ПА, что свидетельствует о его высокой специфичности.
Логичным завершением лабораторных исследований стала производственная апробация МФ из сычугов СО. В динамике исследованы основные физико-химические и органолептические показатели экспериментальных сыров. Показано что использование МФ из сычугов СО, обладающего очень низким
8 уровнем неспецифического протеолиза, позволяет вырабатывать сыры с длительным сроком хранения без ухудшения органолептических свойств.
Диссертация содержит 120 страниц основного текста, 13 таблиц, 22 иллюстрации, библиографию объемом 257 наименований, 18 приложений. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ и получен патент РФ на полезную модель.
Химозин и пепсин - основные молокосвертывающие ферменты
В соответствии с современной номенклатурой, химозин (ЕС 3.4.23.4) и пепсин (ЕС 3.4.23.1), натуральные молокосвертывающие ферменты, выделяемые из желудков млекопитающих, являются аспартат эндопептидазами [89,97,202]. Название указывает на наличие в структуре активного центра, остатков аспарагиновой аминокислоты (аспартата), которые критичны для проявления ферментативной активности. Среди эукариот, ферменты этой группы являются мономерами с молекулярными массами (ММ) от 35 до 42 кДа[98]. Вторичная структура аспартат протеиназ состоит в основном из антипараллельных бэтта-складчатых слоев и почти не содержит альфа-спиральных участков. Третичная структура представляет из себя два тандемных домена, степень гомологии которых составляет более 20% [113]. Каждый домен содержит один каталитический участок (сайт), в центре которого расположен остаток аспартата (Asp 34 и Asp 216) [112,113,147,173,221]. Аминокислотная последовательность каждого каталитического участка выглядит следующим образом: [гидрофобный y4acTOK]-Asphr-Gly-[Ser/Thr]. Показано, что в областях, прилегающих к активным сайтам, полипептидная цепь образует ф-образную петлю, таким образом, что аспартат оказывается окруженным преимущественно гидрофобными аминокислотными остатками. В ферментативно активном белке, каталитические сайты расположены напротив друг друга (faceo-face), образуя один активный центр так, что расстояние между двумя аспартатными остатками составляет 3,5 А [112,113,221] Активный центр химозина и других аспартат эндопептидаз расположен внутри складки длинной около 40 А, которая разделяет два домена [113]. Структура активного центра стабилизируется водородными связями. Для проявления ферментативной активности один остаток аспартата должен находиться в ионизированной, другой - в протонированной форме [112,113].
Visser et al. [248], показали, что последовательность His (98)-Lys (111) в молекуле каппа-казеина отвечает за способность химозина гидролизовать ключевую пептидную связь. Gilliland et al., подтверждают эти данные и указывают, что положительно заряженные остатки His (98,100,102) взаимодействуют с отрицательно заряженными остатками Glu (288), Asp (279), Asp (280) химозина, расположенными на расстоянии 20-25 аминокислотных остатков от активного центра [113]. Очевидно, что гидролизуемый участок каппа-казеина должен свободно проникать внутрь складки, где расположен активный центр аспартат протеиназ. Предполагается, что в момент протеазной атаки гидрофобный участок Leu (ЮЗ)-Ие (108) молекулы каппа-казеина ассоциирован с гидрофобными аминокислотами, окружающими активный центр аспартат протеиназ [191].
Химозин. Существует два изофермента химозина - А и В, которые образуются в результате точечной аминокислотной замены-в положении 290 (Asp (А) — Gly (В)) [113,164]. В 2005 году коллектив авторов под руководством Marianne Harboe сообщил о выделении химозина С, который является не продуктом посттрансляционной деградации химозина А, а еще одним генетическим вариантом [198]. Изофермент В является основным компонентом желудочного сока, его относительное содержание составляет от 60 до 90%, он менее активен, чем изоформа А, но более устойчив при рН ниже 3,5 [97,98,102,113,218]. Химозин, как и большинство изученных к настоящему времени гастральных протеиназ, транслируется в рибосомальных комплексах клеток слизистой оболочки желудка в виде неактивного прекурсора (предшественника), который называется пре-прохимозином [102,174,189]. Молекула пре-прохимозина состоит из 381 аминокислотного остатка и имеет ММ 43 кДа [122,174]. "Пре" фрагмент, называемый также сигнальным пептидом, расположен на N-концевом участке полипептидной цепи, состоит из 16 аминокислотных остатков и проявляет гидрофобные свойства [122]. Еще в процессе трансляции мРНК, сигнальный пептид, за счет своих гидрофобных свойств, легко внедряется в мембрану эндоплазматического ретикулума (ЭР) и "протаскивает" за собой молекулу прохимозина. После проникновения во внутреннее про странство ЭР сигнальный пептид элиминируется, и фермент превращается в прохимозин. Из цистерн ЭР прохимозин попадает в аппарат Гольджи, откуда секретируется в периплазматическое пространство [122,236]. Прохимозин - не активный предшественник (зимоген) химозина, полипептид с ММ 40,8 кДа, который состоит из 365 аминокислотных остатков [123,188,189,202]. В молеку ле зимогена активный центр прикрыт полипептидным участком Leu (73)-11е (85) N-терминального домена, что создает стерическое препятствие для контак та с молекулами субстрата [112,113,221]. Существование химозина в виде фер ментативно неактивного предшественника предохраняет внутриклеточные бел ки от протеолитического повреждения [202]. Предполагается, что образование активного фермента,- химозина (323 аминокислотных остатка, ММ=35,6 кДа) может происходить двумя способами. При рН, в диапазоне 4-5, химозин обра зуется за счет автокаталитической активации, во время которой элиминируется фрагмент из 42 аминокислот с N-терминального участка молекулы прохимози на. В том случае, если активация зимогена идет при рН 2,5, происходит раз рыв пептидной связи Phe (27)- Leu (28) на N-терминальном участке, что при водит к образованию промежуточного продукта - псевдохимозина, который в дальнейшем превращается в химозин путем аутолиза [102,122,123,147,184,188,202].
Проблема дефицита сырья для производства натуральных молокосвертывающих ферментов
Мировая проблема дефицита натурального СФ возникла во второй половине 20 века [56,116,190], по двум основным причинам. Первая из них - рост объемов производства сычужных сыров. Например, в США производство сыра возросло вдвое за период с 1960 по 1973 год [190]. Вторая - связана с возникновением острого дефицита традиционно используемого для выработки классического СФ сырья - сычугов телят-молокопоек. Нехватка СФ стала ощущаться с 1969 года, а в 1973 году потребности производства были удовлетворены уже только на 30%. В результате, цены на натуральный СФ резко возросли: только за период с 1960 по 1970 стоимость выросла на 200% [190]. В связи с тем, что технологии животноводства направлены на откорм телят массой 150-200 кг, заготовки сычугов легких телят ежегодно снижаются, а доля тяжелых желудков соответственно возрастает. Кроме повышенного содержания пепсина, в сычугах тяжелых телят содержится больше балластных примесей и посторонних протеаз, снижающих качество МФП, а следовательно, и вырабатываемых с ними сыров [41].
Поиски заменителей СФ за рубежом шли в нескольких направлениях [41,56,116,185]: создание смесевых композиций [29,35,41,47,48,190], изучение молокосвертывающих ферментов животного [3,11,16,29,35,41,45,48,116,129, 172,190], микробного [29,35,41,45,48,116,129,172,185,190] и растительного происхождения [3,5,9,41,53,119,172,185,190], исследования в области генной инженерии и клонирования молокосвертывающих ферментов [55,65, 69,88,95,114,123,152,157,167,173,174,183-185,224,243]. Одно из основных требований к любому белковому коагулянту, претендующему на роль заменителя химозина - высокая молокосвертывающая и низкая протеолитическая активность [9,11]. По этому критерию было отвергнуто множество ферментов, способных свертывать молоко, но обладающих высоким уровнем неспецифического протеолиза, что негативно сказывается на качестве и выходе сыра. Натуральный МФ, который бы по своим свойствам полностью заменял СФ, до настоящего времени не найден, по крайней мере, коммерческих препаратов таких ферментов на рынке нет. Существующие в виде товарных продуктов заменители микробного происхождения не находят широкого применения в сыроделии, в основном из-за высокой термостабильности и неспецифической протеолити-ческой активности. Сегодня уже очевидно, что за рубежом решение проблемы дефицита натурального СФ, связывают с развитием генной инженерии [55,114,123,152,157,167,173,174,183,224,251]. Коммерческие препараты телячьего химозина, производимого с использованием рекомбинантных ДНК и генетически модифицированных микроорганизмов [69,88,184,185,243], получившие широкое распространение в последние два десятилетия, будут рассмотрены ниже.
Проблема сырьевого дефицита при производстве сычужного фермента в бывшем Советском союзе возникла в начале 70-х годов. Тогда же начались работы по поиску молокосвертывающих ферментов животного происхождения, способных более или менее успешно заменить сычужный фермент [9,16,26,29,35,45,119,172]. В целях уменьшения расхода СФ, основные работы были направлены на создание смесевых композиций говяжьего, свиного и куриного пепсинов с реннином [16,29,45,119,172]. Усилиями научных коллективов и промышленности были созданы комплексные ферментные препараты серии "ФП ВНИИМС", в начале 70-х годов началось их производство. На какое-то время проблема была снята, но как оказалось - не надолго.
В начале 90-х годов, теперь уже Россия, вновь столкнулась с проблемой дефицита натуральных МФП [3,7]. Экономические реформы подорвали сырьевую и производственную базу натуральных молокосвертывающих препаратов, нарушились связи основного производителя - "Московского завода сычужного фермента" (МЗСФ) - с поставщиками сырья в Казахстане и на Украине, что вызвало падение объемов производства. Отметим, что на этот период пришлось и резкое снижение объемов выработки сычужных сыров. Это смягчило, но не решило проблему дефицита натуральных МФП [7]. Несмотря на то, что в последние годы ситуация постепенно улучшается, - МЗСФ увеличивает объемы производства, появились частные российские компании производящие МФП, проблема сырья (и его качества!) продолжает оставаться острой.
На взгляд автора, решение проблемы дефицита сырья для производства адекватных натуральных заменителей сычужного фермента, связано как с поисками новых сырьевых источников, так и с внедрением современных технологий, позволяющих интенсифицировать уже существующие производственные схемы.
Губчатая энцефалопатия коров, "скрэпи", прионы. В конце 20 века Европу "накрыла" эпидемия "коровьего бешенства" - вызываемого прионами [60,150,197] - инфекционного заболевания сельскохозяйственных животных [77,134,150], что серьезно подорвало сырьевую базу натуральных МФП.
Прионы - особый класс белков, обладающих инфекционными свойствами. Попадая в организм человека, или спонтанно возникая в нем, они способны вызывать тяжелые неизлечимые поражения ЦНС. Название "прионы" аббревиатура от proteinaceous infectious particle - белковая инфекционная частица [5]. Несмотря на то, что прионовые белки человека и животных различаются незначительно, долгое время считалось, что существуют межвидовые барьеры на пути передачи болезни. Однако последние данные показали, что барьеры эти не абсолютны и существует принципиальная возможность передачи болезни от одного вида другому [150]. Так в Великобритании, в 1999 году было зарегистрировано около 40 случаев прионовых заболеваний, в связи с употреблением мясопродуктов, полученных от животных, зараженных "коровьим бешенством" [5].
Организация экспериментов и объект исследований
Все лабораторные исследования, связанные с выделением МФ из сычугов СО и исследованием его физико-химических и технологических свойств, проводились в лаборатории биохимии СибНИИ сыроделия СО РАСХН. Апробацию молокосвертывающего фермента из сычугов СО проводили при выработке сыра "Витязь" в условиях производства на ООО "Экспериментальный сыродельный завод" (г. Барнаул). Общая схема исследований приведена на Рисунке. 1 Работа состояла из нескольких последовательных и взаимосвязанных этапов исследований.
На первом этапе исследована возможность выделения МФ из сычугов СО методом экстракции и последующего высаливания сульфатом аммония. Определяли суммарный выход ферментативной активности и полипептидный состав препарата. На втором этапе оптимизировали процедуру осаждения МФ из водного экстракта сычугов, методом высаливания сульфатом аммония. На третьем этапе разработана одностадийная процедура частичной очистки МФ из сычугов СО и исследованы его некоторые физико-химические свойства. На четвертом этапе разработан метод выделения МФ из утилизируемой технологической жидкости с использованием гидрофобного адсорбента -Phenyl Sepharose CL-4B. На пятом этапе исследованы основные технологические параметры МФ из сычугов СО.
Заключительным этапом работы стала производственная апробация МФ и изучение физико-химических и органолептических показателей сыров, выработанных с его использованием.
Молокосвертывающая активность (в условных единицах) выражается числом миллилитров сырого цельного молока, которое коагулируется 1 мл жидкого или 1 г сухого препарата при температуре 35С в течение 40 минут.
Для определения молокосвертывающей активности (МА) использовали стандартизированный сухой субстрат ("Субстрат — ст.З"), выпускаемый ВНИИ маслосыродельной промышленности РАСХН, (г. Углич). Активность всех препаратов определяли относительно Отраслевого контрольного образца сычужного фермента (ОКО СФ 2003/2004), аттестованного на 2003-2004 годы и выпускаемого ОАО "Московский завод сычужного фермента".
Подготовка субстрата. 25,0 г. стандартизированного сухого субстрата растворяли в 230 мл 0,01 N раствора кальция хлорида (не допускать образования пены!) в течение 1 ч при перемешивании на магнитной мешалке, при температуре 20С. Доводили рН полученного раствора до 6,5, используя 1,0 М раствор гидроокиси натрия. Конечный объём раствора доводили до 250 мл 0,01 N раствором хлорида кальция.
Подготовка Отраслевого контрольного образца. 1,0 г ОКО СФ растворяли в 80 мл дистиллированной воды с температурой 35С, перемешивали в течение 30 мин, доводили общий объём до 100 мл и выдерживали на водяной бане при температуре 35С в течение 15 мин.
Подготовку сухих исследуемых образцов молокосвертывающих препаратов проводили аналогичным образом. Жидкие ферментные препараты разводили 0,02 М Na-ацетатным буфером (рН=5,6) так, чтобы МА составляла 1-4 тысячи условных единиц на 1 мл. Исследуемые образцы перед определением МА выдерживали на водяной бане при температуре 35С в течение 15 мин и охлаждали до комнатной температуры.
Процедура определения молокосвертывающей активности. 5,0 мл раствора стандартизированного субстрата вносили в пробирку и прогревали на водяной бане при температуре 35С в течение 5,0 минут. Затем к субстрату до бавляли 0,1 мл исследуемого образца, включали секундомер, содержимое пробирки сразу же тщательно перемешивали. Продолжительность свертывания субстрата отмечали по секундомеру с момента внесения образца до появления первых хлопьев коагуляции субстрата. Появление хлопьев проверяли путем периодического нанесения стеклянной палочкой капли реакционной смеси на стенку пробирки. Процедуру определения активности проводили на водяной бане при температуре 35С. Молокосвертывающую активность определяли в двух параллельных пробах. За конечный результат брали среднее арифметическое значение двух параллельных определений.
Молокосвертывающую активность (МА) сухих препаратов выражали в условных единицах на 1 г препарата и рассчитывали по формуле: МА (усл. ед.) = А Т1/Т2, где: А - аттестованная молокосвёртывающая активность ОКО СФ 2003/2004 в условных единицах на 1 г; ТІ - время свертывания с ОКО СФ 2003/2004; Т2 - время свертывания с исследуемым образцом. Молокосвертывающую активность (МА) жидких препаратов выражали в условных единицах на 1 мл препарата и рассчитывали по формуле: МА (усл.ед.) = 0,01 А Т1/Т2, где: А - аттестованная молокосвёртывающая активность ОКО СФ в условных единицах на 1 г; ТІ - время свертывания с ОКО СФ; Т2 - время свертывания с исследуемым образцом.
Выделение молокосвертывающего фермента из сычугов северных оленей
При проведении экспериментов по ступенчатому осаждению, количество сульфата аммония (СА) в граммах, которое нужно добавить кіл раствора при температуре 20 С, чтобы из раствора с насыщением Si (%) получить раствор с насыщением S2 (%) определяли по формуле: СА(г)= 533 (S2-Si)/(100-0,3 S2) [37]
Экстракт сычугов СО получали согласно п.2.2.1 (Стадия 2). В 10 мл экстракта вносили сухой СА до конечной концентрации 20,40,60,80% от насыще-ния. После полного растворения внесенного СА, смесь вымешивали в течение 30 минут при 20-22 С и оставляли при этой температуре на 10-12 часов. Образовавшиеся осадки отделяли центрифугированием (рефрижераторная центрифуга РС-6, 2500 оборотов/мин, 10-15С, 40 минут) и растворяли в 5 мл 20 мМ Na-ацетатного буфера (рН=5,6). В растворах осадков и в супернатантах определяли А280, молокосвертывающую активность (МА) и удельную МА.
В стартовой схеме выделения, для осаждения МФ из экстракта сычугов северного оленя, был использован сульфат аммония (СА) в концентрации 80% (Ф от насыщения (3,24М). В супернатанте, после отделения высола, оптическая плотность при А280 уменьшается в 2,9 раза, что свидетельствует об осаждении примерно 65% белковых компонентов исходного раствора. Результаты элек-трофоретического исследования показали (п.3.1.3.), что при такой концентрации С А, в осадок выпадают все полипептидные компоненты с ММ более 14 кДа. Таким образом, СА при 80% насыщения, осаждает почти все белковые составляющие экстракта слизистой оболочки сычуга СО, кроме некоторой части л низкомолекулярных компонентов которые обнаруживаются как в надосадочной жидкости, так и в конечном продукте.
При разработке метода любого препаративного выделения, основанного на процедуре высаливания, возникает необходимость подбора оптимальной концентрации вносимой соли. Оптимизация призвана решить следующие задачи: 1) добиться максимального выхода при высокой удельной активности выделяемого фермента; 2) уменьшить плотность раствора в котором происходит осаждение фермента (за счет снижения концентрации соли), что позволит эффективнее отделять осадок; 3) снизить затраты на выделение фермента за счет уменьшения количества вносимой соли.
В целях оптимизации процедуры выделения, было исследовано поведение МФ из сычугов СО при различных концентрациях вносимого сульфата аммония. Результаты осаждения белков экстракта сычугов СО различными концентрациями С А представлены в таблице 4.
При 20% насыщения молокосвертывающий фермент осаждается лишь частично, - и в супернатанте, и в растворе осадка обнаруживается МА. При концентрации СА в экстракте равной 1,62М и выше, происходит полное осаждение МФ, о чем свидетельствует нулевая активность супернатантов.
Выход МФ в диапазоне концентраций 1,62М - 3,24М (40-80% от насы щения) составляет от 83% до 86%. По мере увеличения количества вносимой соли наблюдается снижение удельной активности растворов осадков, что свя зано с увеличением в них доли балластных белков. Удельная активность осад ф, ка получаемого при 40% насыщения СА является наиболее высокой и превы шает этот показатель для 60% и 80% насыщения в 1,2 и 1,8 раза, соответственно. Суммарный выход МА, достигаемый при 40% насыщения, всего на 3% меньше максимального выхода, полученного при внесении СА до 80% насыщения (96,5% от выхода ферментативной активности при 80% насыщения сульфатом аммония).
Результаты исследования полипептидного состава фракций, получаемых при ступенчатом фракционировании экстракта сычугов СО сульфатом аммония, представлены на рисунке 3.
Растворимость белков экстракта при повышении концентрации СА нахо-\Ф дится в обратной зависимости от их молекулярной массы (ММ). Видно, что при повышении концентрации вносимого СА от 0 до 20-40% насыщения, в первую очередь осаждаются высокомолекулярные белки с ММ 94 кДа (треки № 2,3). При насыщении экстракта сычугов 60-80% СА, в растворе (в супернатанте) остаются только низкомолекулярные белки и пептиды (треки № 4,5) с ММ 17 кДа. Осадок, получаемый при 20% насыщения СА, характеризуется высоким относительным содержанием высокомолекулярных компонентов, что связано с их наименьшей растворимостью.
