Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 6
1.1. Кефирные грибки, разновидности, особенности культивирования 6
1.2. Химизм развития кефирных грибков в молоке 24
1.3. Биотехнологический потенциал кефирных грибков и перспективы его использования 35
1.4. Заключение по обзору литературы 44
1.5 Цель и задачи исследований 45
Глава 2. Материалы и методы исследований экспериментальная часть 47
Глава 3. Исследования влияния условий культивирования на свойства микробных ассоциаций кефирных грибков 60
3.1. Исследование и выбор момента воздействия на процесс культивирования кефирных грибков 61
3.2. Исследование морфологических, тинкториальных свойств сформированной микробной ассоциации кефирных грибков 65
3.3. Изучение микробного фона сформированных ассоциаций кефирных грибков и кинетики ферментативных реакций 71
3.4. Исследование активности сформированных микробных ассоциаций кефирных грибков. Разработка технологии приготовления закваски 75
3.4.1. Протеолитическая активность 7 5
3.4.2. Нуклеотидпродуцирующая способность 76
3.4.3. Ароматообразующая способность 77
3.4.4. Витаминсинтезирующая способность 83
3.4.5. Структурообразующая способность 84
3.4.6. Разработка технологии приготовления закваски 87
Глава 4. Исследование и выбор технологических режимов производства кисломолочного продукта. Разработка схемы технологического процесса 90
4.1. Выбор режимов тепловой обработки молока и массовой доли инокулята 90
4.2. Выбор технологических режимов подготовки биомассы кефирных грибков 92
4.3. Разработка схемы технологического процесса 95
Глава 5. Химический состав и пищевая ценность кисломолочного продукта. Результаты клинической апробации. Хранение
5.1. Характеристика орґанолептических, физико-химических показателей продукта 98
5.2. Исследование стереоспецифичности молочной кислоты 100
5.3. Содержание некоторых витаминов в кисломолочном продукте 101
5.4. Химический состав кисломолочного продукта 102
5.5. Биологическая ценность и антибиотическая активность кисломолочного продукта 107
5.6. Определение выживаемости микроорганизмов in vitro 109
5.7. Клиническая апробация продукта 112
5.8. Изучение продолжительности хранения продукта 113
5.9. Производственная проверка технологии кисломолочного
продукта «Биофир» 115
Выводы 118
Литература
- Биотехнологический потенциал кефирных грибков и перспективы его использования
- Исследование морфологических, тинкториальных свойств сформированной микробной ассоциации кефирных грибков
- Выбор технологических режимов подготовки биомассы кефирных грибков
- Содержание некоторых витаминов в кисломолочном продукте
Введение к работе
Лактобактерии - постоянные обитатели желудочно-кишечного тракта человека и животных, они широко распространены в природе. Их дефицит негативно отражается на физиологическом состоянии макроорганизма.
Надежным и эффективным приемом профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний, дисбактериозов является употребление активных клеток лактобактерии, обладающих высокой биохимической, антагонистической активностью и микроорганизмов, способных приживаться в желудочно-кишечном тракте.
В связи с этим особый интерес представляют кефирные грибки - живая система групп микроорганизмов, физиологически принципиально разных, однако находящихся в симбиотической связи между собой, биологически сложившейся в результате эволюции. Необходимо отметить и то, что кефирные грибки, согласно современным данным отечественных и зарубежных исследований, содержат полисахарид глюкогалактан, который способствует усилению ферментативной активности желудочно-кишечного тракта, повышению его физиологической активности и укреплению иммунной системы.
Существующие до настоящего времени способы применения кефирных грибков связаны с приготовлением кисломолочного напитка - кефир, с совершенствованием технологии его получения, повышением его пищевых и диетических свойств (6, 8, 10, 16, 18, 19). Имеются работы, связанные с использованием кефирной грибковой закваски для приготовления кисломолочных напитков смешанного типа брожения - тарага (12, 14), курунги (98).
Однако появились данные об использовании природного консорциума микроорганизмов кефирных грибков (82). Методом последовательного ин-
кубирования слива кефирных грибков в молоке достигается освобождение мезофильных и ароматообразующих стрептококков природного симбиоза кефирных грибков в активном состоянии от термофильных и мезофильных мо-лочно-кислых палочек, стрептобактерий, уксусно-кислых и дрожжей (82).
Преимущества использования симбиоза микробных партнеров в биологически сформировавшихся консорциумах очевидны: повышение эффективности биоконверсии используемой среды, возрастание удельной скорости роста микробных клеток, изменение свойств биотической среды, усиление сопротивляемости к воздействию внешних факторов.
Интересными представляются исследования, направленные на изменение условий культивирования кефирных грибков с использованием приемов, достаточно известных в биотехнологии, таких как механическое встряхивание и принудительная аэрация среды с целью создания аэробиоза в системе при достижении определенной величины активной кислотности.
Кефирные грибки являются одним из немногих микробных систем, природа и свойства которых до конца не изучены.
Биотехнологический потенциал кефирных грибков и перспективы его использования
Современные данные литературы убедительно свидетельствуют о широком распространении в производстве продуктов питания консорциумов микроорганизмов (38, 40, 48, 53, 60, 71, 82, 87). Преимущества совокупности различных взаимозависимых организмов, выступающих как единое целое при использовании определенного субстрата, перед монокультурами очевидны.
Рыбальский Н.Г., Лях СП. (87) анализируя преимущества применения консорциумов микроорганизмов перед монокультурами микроорганизмов отметили следующее: - универсальность, способность к саморегуляции за счет изменения соотношения и численности видов; - более полное использование функциональных биотехнологических возможностей микроорганизмов; - высокая устойчивость к неблагоприятным факторам окружающей среды; - улучшение вкусовых качеств ферментированных продуктов; - возможность обогащения целевых продуктов различными биологиче ски активными веществами с более широким спектром действия.
В механизме развития микробных сообществ значительна роль нуклеиновых производных. Являясь биологически активными соединениями, они играют фундаментальную роль в молекулярной логике живого, стимулируют развитие группы микроорганизмов, в том числе и лактобактерий (33). Стимуляция роста и развития культур при совместном развитии обеспечивается присутствием в средах культивирования наряду с аминокислотами, пептидами и др. соединениями - нуклеиновых производных. О возможности накапливать микроорганизмами в средах культивирования свободные мононуклео-тиды было выявлено многими исследователями (91,102).
В настоящее время известно, что появление пуриновых и пиримидино-вых нуклеотидов в среде культивирования может обуславливаться двумя основными факторами (102): I - высвобождением микробной клеткой в период активного роста или в период лизиса внутриклеточного низкомолекулярного нуклеотидного пула; II - ферментативным расщеплением высокомолекулярных РНК, ДНК, олигонуклеотидов, нуклеопротеидов или их фрагментов.
Нуклеотиды пуринового и пиримидинового ряда в качестве мономеров включаются в состав всех известных нуклеиновых кислот, для синтеза которых используются только нуклеозидтрифосфаты. В виде мононуклеотидтри-фосфатов они выполняют коферментную функцию по переносу фосфата, пи-рофосфата, адениловой кислоты, аденозина с АТФ на субстраты, такие же свойства присущи ГТФ. АТФ и ГТФ выполняют функцию передатчика первичных сигналов мембранных рецепторов на мембранные системы. Таким образом, пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды обеспечивают биоэнергетические реакции в клетках, участвуют прямо или опосредованно во всех ка-таболических и анаболических процессах, обеспечивающих жизнедеятельность организма.
Специфические особенности продуцентов этих жизненно важных биологически активных соединений, условий их культивирования привлекают все большее внимание исследователей (68, 94,109).
Митягина СЮ. и др. (68), исследуя нуклеотидный фонд бактерий D.desulfuricans В-1388 и определяя внутриклеточные концентрации АТФ, АДФ, АМФ, НАДФ, НАД, обнаружили низкое содержание АТФ и низкий энергетический заряд аденилатной системы в клетках. Выявлено, что окисление окиси углерода бактериями не влияло на уровень АТФ, но приводило к значительному увеличению содержания восстановленных никотинамидаде-ниннуклеотидов.
Satoru Asahi и др. (109) отметили гиперпродуцирование оротовой кислоты и оротидина мутантными клетками Bacillis ubtilis. Клетки В. subtilis с модифицированной активностью оротатфосфорибозилтрансферазы и 51-монофосфатдекарбоксилазы, полученные на основе уридин-продуцирующего штамма В. subtilis, накапливали значительное количество оротовой кислоты и оротидина даже в присутствии избытка урацила.
Тихоновой Е.Б. и др. (94) исследовано изменение пула АТФ в динамике периодического роста Rhodococcus minimus. При этом показано, что в первые часы роста происходит уменьшение пула этого энергетического метаболита одновременно с увеличением интенсивности дыхания, что, по-видимому, связано с увеличением расхода энергии на синтез запасных углеводов. В последующий период по мере снижения дыхательной активности уровень АТФ возрастает и остается стабильным до конца экспоненциального фазы роста, снова уменьшаясь в стационарной фазе после потребления субстрата. Изменение удельной скорости роста, обусловленное природой источника с его концентрацией и свойствами используемого варианта культуры, не оказывают влияния на динамику пула АТФ.
Исследование морфологических, тинкториальных свойств сформированной микробной ассоциации кефирных грибков
Исследование морфологических, тинкториальных свойств микробных ассоциаций кефирных грибков, сформированных в условиях культивирования.
Наиболее объективной, позволяющей достичь максимального эффекта анализа результатов эксперимента в микробиологической практике, является оценка свойств микроорганизмов с помощью микроскопического препарата. В этой связи в ходе дальнейших исследований была изучена морфология микробных ассоциаций кефирных грибков.
Состояние питательной среды - основа развития микроорганизмов, следовательно, воздействуя на молоко, ферментируемое грибками путем создания условий аэробиоза и механического воздействия, микробным сообществам была предложена своего рода некая мягкая стрессовая ситуация, ответная реакция на которую была незамедлительна. Подобранные условия культивирования привели к неожиданному эффекту - произошло существенное изменение качественного фона и количественного соотношения предста вителей микробного сообщества кефирных грибков. Изучение сформиро вавшихся ассоциаций кефирных грибков методом микроскопирования препаратов окрашенных метиленовой синью, по методу Грама, по методу Злато-горова, были получены микрокартины, фотографии которых представлены на рис.
Микрокартина ассоциации (см. рис. 4), полученной в результате механического встряхивания (опыт 1), отличается от микробиального фона типичной грибковой закваски, полученной в стандартных условиях и в условиях аэробиоза (опыт 2). Известно, что условия развития дрожжевой клетки отражаются на их морфологии и цитологии (4). Произошли изменения феноти-пического характера, морфологические изменения клеток дрожжей, форма которых не совсем типична, продолговатые, слегка вытянутые клетки, хорошо ориентированные в пространстве, не видно скоплений дрожжевых клеток и не совсем единичные экземпляры, характерные для сообщества, сформированного в стандартных условиях. Присутствуют представители ароматообра-зующей микрофлоры, ацетобактерии, которые благоприятно развиваются в симбиозе под влиянием механического воздействия.
В закваске, полученной под воздействием нагнетания молекулярного кислорода воздуха, микрокартина препаратов существенно отличалась от предыдущей (см. рис. 5). Произошел активный рост лишь дрожжевых клеток и подавление других видов. Очевидно, это связано с результатом воздействия молекулярного кислорода, так как известно, что растворенный кислород является питательным компонентом для аэробных микроорганизмов и специфическим биологическим действием клеток дрожжей на других симбионтов.
Микрокартина (см. рис. 6) представлена клетками дрожжей типичной формы, расположенных в виде скоплений, не присутствуют спорообразующие виды.
Микрокартины сформированных сообществ достаточно убедительно свидетельствуют о том, что произошли заметные изменения в микробной системе кефирных грибков. Можно предположить, что это связано с изменением окислительно-восстановительных условий среды, на которую оказывалось воздействие. В этой связи были изучены окислительно-восстановительные потенциал в исследуемых вариантах проб молока, ферментируемого кефирными грибками. Полученные результаты представлены в таблице 6.
Анализ данных таблицы свидетельствует о том, что произошло падение окислительно-восстановительного потенциала опытных вариантов проб по сравнению с контрольной, отмечены различия в величине Eh между опытными вариантами проб. Резкое падение Eh произошло в закваске, полученной в результате встряхивания, благодаря которому значительно увеличивается площадь поверхности среды. Суспензия микроорганизмов - это коллоидная система, в которой механические силы, вероятно влияют на равномерное распределение продуктов обмена, на более тесное взаимодействие молекул с субстратом, где реакционно способные группы располагаются поблизости друг от друга и каталитических групп различных ферментов.
Выбор технологических режимов подготовки биомассы кефирных грибков
Кефирное зерно представляет собой плотное, упругое вещество, которое плохо рвется и проявляет тенденцию к возврату формы при деформации. Основная часть кефирных зерен состоит из углеводов, большую часть которых составляют полисахариды. Полисахариды являются естественными загустителями - стабилизаторами, синтезируемыми микрорганизмами. Особенности состава, структуры и физико-химических свойств микробных полисахаридов определяют их уникальные реологические показатели. Для их растворов характерна повышенная вязкость, что обусловлено высокими силами сцепления гидрофильных молекул полисахаридов и воды. Механизм действия микробных полисахаридов, улучшающих структурно-вязкостные свойства кисломолочных продуктов, может быть не одинаков, он зависит от тех культур микроорганизмов, которые используют для ферментации молока.
Микробные полисахариды, с одной стороны, могут изменять консистенцию продукта благодаря большой вязкости, придавая ему плотность или однородность. С другой стороны консистенция продукта и ее стабильность могут обуславливаться гидрофильными эмульгирующими свойствами полисахаридов, то есть способностью стабилизировать кисломолочный сгусток.
Важным фактором в использовании биомассы кефирных грибков в производстве ферментированных напитков является влияние ее на органо-лептические свойства. Биомасса кефирных грибков усиливает и делает более выраженным основной вкус кисломолочного напитка.
Обогащение биомассы кефирных грибков также обеспечивает высокую сохранность продукта, выживаемость клеток микроорганизмов, отмечается высокая устойчивость сгустка у образцов, обогащенных биомассой кефирных грибков, в них не наблюдается расслоение сгустка и снижение влаго-удерживающей способности.
Кроме того, исследования, проведенные в нашей стране и за рубежом показали (36, 97, 123, 129, 130), что кефирные грибки содержат полисахарид глюкогалактан, который усиливает ферментативную активность желудочно-кишечного тракта, повышает физиологическую активность организма, укрепляет иммунную систему, способствует выведению вредных веществ. Полисахариды оказывают благоприятное воздействие на организм, связывая воду, некоторые токсические вещества.
В ходе проведенных нами исследований свойств микробных ассоциаций кефирных грибков была выявлена высококачественная закваска, полученная при использовании механического воздействия, которая отличалась более высокой биохимической активностью. Но как показали исследования поверхностного натяжения при ферментации молока, образование устойчивой коллоидной системы в закваске, подвергавшейся встряхиванию, шло чуть хуже, чем в контроле, структурно-вязкостные свойства были ниже.
Для улучшения структурно-вязкостных свойств продукта, нами, в качестве естественных загустителей-стабилизаторов была взята биомасса кефирных грибков, подвергнутая термической обработке в фильтрате закваски.
Биомасса кефирных грибков неоднородна по составу и представляет собой упругие комочки, что делает невозможным равномерное распределение ее в массе продукта. Известно, что при температуре 7 5 С кефирные грибки способны образовывать гомогенную текучую массу, которая легко смешивается с продуктами (129).
Нами экспериментально установлено, что поверхностное натяжение обработанной биомассы кефирных грибков снижается с увеличением температуры нагревания (см. рис. 16), особенно выше 90С.
Максимальное значение поверхностного натяжения наблюдается при температуре нагревания 75С с выдержкой 10-15 мин. Поэтому для получения обработанной биомассы с вязкостью, достаточной для того, чтобы повлиять на консистенцию продукта, необходимо вести процесс нагревания биомассы при температуре не ниже 75С в течение 10-15 минут. Этот режим подготовки биомассы грибков был использован нами при получении продукта.
Целесообразно, в целях достижения лучшего распределения биомассы грибков, подготовить предварительно эмульсию на основе фильтрата кефирной грибковой закваски в соотношении 1 часть грибков: 10 частей фильтрата. Использование фильтрата грибковой закваски позволит исключить явление контаминации.
Содержание некоторых витаминов в кисломолочном продукте
Консорциумы микроорганизмов способны к более высокому биосинтезу витаминов, чем отдельные культуры (87).
В образцах кисломолочного продукта было исследовано содержание витаминов Bi, В2, С. Полученные результаты (см. табл. 19) свидетельствуют о том, что микробная ассоциация грибков, сформированная в условиях механического воздействия обладает способностью к биосинтезу витаминов. Применение этой закваски позволило повысить в продукте по сравнению с исходным молоком (пастеризованным) содержание тиамина на 38%, рибофлавина на 32%, соответственно. А содержание аскорбиновой кислоты составило 108%.
Химический состав кисломолочного продукта. Проведенные исследования пищевой ценности «Биофира» показали, что в результате жизнедеятельности в молоке микробной ассоциации грибков, полученной в условиях механического воздействия, в готовом продукте накапливается физиологичный для организма человека L(+) изомер молочной кислоты и витамины. При этом содержится высокое количество активных клеток лактобактерий. В табл. 20 приведены данные, проведенных нами исследований химического состава продукта. В сравнении представлена характеристика химического состава натурального пастеризованного молока.
Из табл. 20 видно, что в продукте несколько меньше содержание белка, углеводов, что можно объяснить действием ферментов микроорганизмов. Витаминный состав «Биофира» существенно превосходит натуральное молоко, что объясняется биосинтезом этих соединений микрофлорой закваски. Несколько отличается минеральный состав продуктов, вероятно, это результат добавления в образовавшийся сгусток гомогенной биомассы грибков.
В ходе дальнейших исследований, с целью оценки пищевой ценности продукта изучали аминокислотный состав продукта. Анализ полученных данных (см. табл. 21) показывает, что микрофлора закваски в процессе своей жизнедеятельности накапливает почти все аминокислоты. В сравнении с молоком, происходит в большей степени накопление валина, изолейцина, лейцина, метионина, треонина, фенилаланина, аргинина. При этом общий удельный вес свободных аминокислот составляет 10,079 мг%, из них на долю незаменимых 3,298 мг%.
Процесс ферментации молока сопровождается молочнокислым брожением, в результате чего изменяется содержание углеводов. В табл. 22 представлены данные содержания углеводов в процессе сквашивания молока микробными ассоциациями грибков, сформированными под воздействием механического встряхивания.
В результате проведенных исследований установлено (см. табл. 22) уменьшение лактозы с 4,9% до 3,11% через 8 часов ферментации. Глюкоза и галактоза утилизируются микроорганизмами закваски.
Данные литературы свидетельствуют о том, что в создании вкусовых свойств продукта непосредственно участвуют летучие кислоты, накапливаемые в процессе ферментации молока лактобактериями. «Биофир» характеризуется высоким содержанием уксусной кислоты 43,1 мг/ЮОг, муравьиной -28,4 мг/ЮОг, пропионовой - 5,3 мг/ЮОг, масляной - 2,4 мг/ЮОг.
Полученные результаты, вероятно, связаны с симбиотической деятельностью мезофильных, уксуснокислых, ароматообразующих бактерий. 5.5. Биологическая ценность и антибиотическая активность кисломолочного продукта. Биологическая ценность пищевых белков зависит от содержания и соотношения в нем незаменимых аминокислот (72, 81, 90).
В этой связи для характеристики биологической ценности в работе использовали метод аминокислотного скора (81). Химический аминокислотный скор белков молока, ферментированного микробными ассоциациями кефирных грибков, представлен в табл. 24.
Из данных табл. 24 видно, что главной лимитирующей аминокислотой в «Биофире» является сумма аминокислот метионин+цистин, скор которых составляет 70,8%. Это, однако несколько выше скора этих аминокислот для молока. Для остальных аминокислот скор достаточно высок - от 103,8% до 135,3%. В настоящее время при создании новых ферментированных продуктов на основе молока, особое внимание уделяется антибиотической активности (47).
Учитывая вышеизложенное, в работе были изучены антибиотические свойства микрофлоры кисломолочнго продукта «Биофир». Полученные результаты приведены в табл. 25.
Исследование антибиотических свойств микрофлоры продукта выявило присутствие антагонистических свойств. Так, отсутствие роста тест-культуры Е. coli наблюдалось в разведении 1:8, торможение - в разведении 1:32, а тест-культура S. sonnee 2841 не росла в разведении 1:4, угнеталась в разведении 1:16. Тест-культура Ent. aerogenes не развивалась в разведении 1:4, подавлялась в разведении 1:32.
В научной литературе (24, 56) имеются сведения о том, что наряду с лактобактериями, дрожжи и уксуснокислые бактерии обладают способностью образовывать антибиотические вещества.
Полученные в работе результаты, вероятно, являются следствием сим-биотического взаимоотношения микробных ассоциаций грибков - мезофиль-ных лактобактерий, уксуснокислых, ароматообразующих бактерий, дрожжей.
Таким образом, проведенные исследования позволяют сформулировать вывод о том, что новый кисломолочный продукт «Биофир» отличается количественными изменениями аминокислот, высоким содержанием незаменимых аминокислот, и обладает антибиотическими свойствами и содержит физиологически активный L(+) изомер молочной кислоты.
