Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Литературный обзор 8
1.1. Структура и свойства мышечных белков, небелковых веществ и лшшдов 8
1.2. Технические методы выделения белков 26
Экспериментальная часть
Глава 2. Цель исследования и методика работы 40
2.1. Характеристика объекта исследования 40
2.2. Методика исследования 42
2.3. Характеристика свойств изолятов 56
Глава 3. Обсуждение результатов 61
3.1. Исследование процесса обезжиривания изолятов 62
3.1.1. Выбор и обоснование режимов центрифугирования 62
3.1.2. Распределение липидов в технологическом процессе 64
3.2. Изучение влияния факторов на выход белка 67
3.2.1. Влияние соотношения фарша и растворителя 67
3.2.2. Влияние концентрации неї и NaOH 70
3.2.3. Влияние времени настаивания 72
3.2.4. Влияние температуры 79
3.3. Выбор оптимальных режимов осаждения фракций белков /получение изолятов/ 82
3.3.1. Водорастворимая фракция 82
3.3.2. Кислоторастворимая фракция 84
3.3.3. Щелочерастворимая фракция 85
3.4. Химический состав изолятов 90
3.5. Баланс азотосодержащих веществ 91
3.6. Физико-химические и функциональные свойства белковых изолятов 95
3.6.1. Гидрофильные свойства фракций белков 95
3.6.2. Перевариваемость белков протеолитическими ферментами 98
3.6.3. Аминокислотный состав изолятов 100
3.6.4. Функциональные свойства изолятов 102
3.6.5. Органолептическая оценка белковых изолятов 104
Глава 4. Практическая реализация результатов исследования 108
Вывода 114
Список литературы
- Структура и свойства мышечных белков, небелковых веществ и лшшдов
- Характеристика объекта исследования
- Исследование процесса обезжиривания изолятов
- Водорастворимая фракция
Введение к работе
В Колумбии, как и во многих странах мира в настоящее время ощущается нехватка продуктов питания с достаточным количеством белковых веществ, содержащих необходимое количество незаменимых аминокислот. Помимо мяса и других продуктов, как известно, рыба является богатым источником белка, жиров, минеральных веществ, многих витаминов и жизненно важных соединений. Если судить по данным факультета обработки рыбы Технологического Университета Магдалены /Колумбия/ /152/, то потребление рыбного белка в год на дулу населения составил в декаде 70-х годов 1,32 кг. Цифра, которая находится ниже нормы ФАО /20 кг в год/. Это объясняется тем, что рыба в Колумбии не является популярным продуктом питания и кроме того, не доступна для всех.
С другой стороны, Колумбия имеет весьма благоприятные условия для развития промышленного рыболовства: площадь внутренних водоемов превышает один миллион квадратных километров, а площадь территориальных вод составляет более 100 млн. га. Однако рыбное хозяйство в нашей стране отстает по сравнению с другими странами Латинской Америки. Главной причиной этого является то, что в течение многих лет рыбное дело находилось в частном секторе и не были достаточно изучены и оценены потенциальные ресурсы наших водоемов и морей.
В последние годы наше правительство стало уделять большое внимание развитию рыбного хозяйства. Однако в связи с тем, что флот нашем страны маломощный, лов в открытом море не представляется возможным. Главное направление государственной программы включает развитие рыбного хозяйства именно во внутренних водоемах. По данным института природных ресурсов Колумбии в периоде 1970-1975 гг. количество промысла в пресных водах составило
68% всего лова страны /151/.
Правительственная программа по освоению рыбного хозяйства Колумбии направлена на изыскание новых источников добычи, а также новых эффективных технологических способов обработки рыбы, которые соответствовали бы требованиям нашей страны, то есть пользовались спросом среди населения, доступные во всех районах страны, недорогие в их производстве и позволили бы долго хранить их питательную ценность.
Традиционные способы приготовления пищевых рыбных продуктов в Колумбии, кроме производства некоторых видов консервов, до сегодняшнего дня не получили широкого развития. Зто можно объяс -нить тем, что крупные населенные города страны находятся в центральной её части и транспортировка свежей рыбы или полуфабрикатов трудно осуществить в хороших санитарных условиях. Из-за таких трудностей большое количество объектов лова направляется на производство кормовых продуктов, что является не лучшим способом их обработки.
Перед страной стоит задача, как лучше использовать рыбу в целях решения одной из важных проблем Колумбии - проблемы нехватки белков в пищевом рационе населения.
Одним из путей обработки малоценных рыб в настоящее время является метод выделения из мышечной ткани белка, освобожденного от жиров и продуктов их распада в целях их использования как добавки при производстве других пищевых продуктов, в основном растительного происхождения. Такой продукт носит название белкового изолята.
В настоящее время существует много способов производства таких изолятов, которые можно разделить на три группы: физические, химические и биохимические. Основной проблемой всех этих
- б -
методов является необходимость отделения липидов от белка. В известных нам технологических схемах используются органические растворители, перечень которых разрешен для использования в пищевой промышленности, очень ограничен. Кроме того, их применение приводит к дополнительным материальным затратам.
В данной работе предлагается способ, который относится к категории физико-химических методов. Метод заключается в последовательном растворении измельченных мышц рыб в воде, кислоте и щелочи. С помощью центрифугирования белки отделяются от других компонентов, в том числе от липидов. Из растворов белки осаждаются, получая при этом изоляты белков.
Данный способ более приемлем при условиях рыбной промыш -ленности Колумбии, так как материальные затраты относительно невелики, полученный продукт содержит все аминокислоты, характерные для белков, и малое содержание жира позволяет хранить продукт достаточно длительное время.
В связи с актуальностью данной проблемы и для её успешного решения намечено:
Установить оптимальные технологические режимы получения изолятов белка.
Исследовать процесс обезжиривания изолятов.
- Изучить свойства полученных изолятов.
В итоге проведенного исследования:
Разработана технология получения изолятов по фракциям не прибегая к органическим растворителям.
Разработана технологическая инструкция по приготовлению изолятов.
Пользуясь случаем, считаю приятным своим долгом выразить искреннюю благодарность моему научному руководителю, кандидату
технических наук, доценту В.В.Балю, за постоянную помощь при проведении экспериментов и написании работы.
Выражаю искреннюю признательность членам кафедры технологии рыбных продуктов Астрыбвтуза: доцентам, ассистентам, научным сотрудникам, лаборантам, аспирантам во главе с заведующим кафедрой доцентом Акимовой Б.Е., создавшим своим дружеским отношением, вниманием и советом благоприятные условия для работы.
Структура и свойства мышечных белков, небелковых веществ и лшшдов
Рыба - один из важнейших источников белкового питания человека. В состав тела рыбы входит большое число различных химических веществ, среди которых преобладающее значение имеют белки, липиды /жир/, вода и некоторые минеральные вещества. Эти вещества являются основным материалом, из которого построены ткани и органы рыб. Помимо них, в тканях рыбы находятся вещества, являющиеся продуктами белкового и липидного обмена в организме, а также различные специфические вещества, служащие регуляторами жизненных процессов - витамины, ферменты и гормоны. В небольшом количестве в рыбе содержатся также углеводы. Кроме того, присутствуют красящие вещества или пигменты, обуславливающие различную окраску отдельных тканей и органов рыбы /49/.
Основную пищевую ценность рыбы составляет мышечная ткань, которую принято называть мясом, включающее туловищные мышцы вместе с заключенной в них соединительной и жировой тканью, кровеносными и лимфатическими сосудами и мелкими межмышечными косточками. Мясо - основная съедобная часть рыбы, составляющая в среднем около Ь0% массы /веса/ всей рыбы /29/.
Мышечная ткань рыбы состоит из четырех мышц: двух спинных и двух брюшных, разделяющихся вдоль перегородками плотной соединительной ткани. Спинные и брюшные мышцы в свою очередь разделены поперек тонкими соединительно-тканными перегородками миосептам на ряд сегментов, называемых миотомами, или миомерами, количество которых соответствует числу позвонков /49,64,65/. Миотомы представляют собой отдельные тонкие полоски ткани, имеющие форму полых, входящих один в другой конусов, и состоят из продольно расположенных мышечных волокон, покрытых рыхлой соединительной тканью-эндомизием. Концы мышечных волокон прикреплены к миосеп-там, которые с помощью мышечных перегородок и опорных связок соединены со скелетом.
Мышечные волокна в свою очередь состоят из мышечных клеток поперечнополосатой структуры. Они являются важнейшим морфологическим и функциональным элементом мышечной ткани.
В строении каждой мышечной клетки различают наружную оболочку или сарколемму ; вязкий белковый раствор-цитоплазма или саркоплазма ; многочисленные ядра ; белковые сократительные нити, называемые миофибриллами /44,75/. Сарколемма является оболочкой мышечной клетки и состоит главным образом из коллагена и липидов. Саркоплазма представляет собой вязкий слабоструктурированный белково-соляной раствор, концентрированный золь протеинов, главным образом глобулярного типа. В состав саркоплазмы входят также рибонуклеопротеидные гранулы, гликоген и аденозинтрифосфорная кислота. Саркоплазма располагается непосредственно под сарколеммой ; между миофибриллами и вокруг пучков миофибрилл центральная часть саркоплазмы занята сократительными белковыми нитями-миофиб-риллами, составляющими плотную основу мышечной клетки.
Миофибрилды поперечнополосатых мышечных клеток состоят из правильно чередующихся темных и светлых участков или дисков. Темные диски анизотропны, то есть в поляризационном микроскопе они выявляют двойное лучепреломление. Светлые диски изотропны -в поляризационном микроскопе обнаруживают простое одинарное лучепреломление. Темные и светлые диски разных миофибрилл расположены строго один против другого, то есть темные против темных, а светлые против светлых, что и придает всему волокну поперечную исчерченность /63/. Повторяющимся элементом миофибриллы в про дольном направлении является саркомер. Саркомеры представляют собой элементарные структурные образования миофибрилл. Они состоят из тончайших белковых волоконец, называемых миопротофибрил-лами /64/.
Протофибриллы состоят из белков, причем на долю миозина приходится примерно 54% массы всех структурных белков мышцы, на долю актина - около 27%, остальная масса белков представлена в основном тропомиозином /около 12%/, тропонином и двумя актинами /около 7%/ /18,83,150/.
Белки - наиболее важные и сложные по своей химической природе вещества, входящие в состав мышечной и соединительной ткани, образующей мясо рыбы.
По определениям Ф.Энгельса: "Белок - самое неустойчивое из всех известных нам соединений углерода. Он распадается, лишь только он теряет способность выполнять свойственные ему функции, которые мы называем жизнью, и в его природе заключается то, что эта неспособность раньше или позже наступает" /116/ и "Жизнь есть способ существования белковых тел, и этот способ существования состоит по своему существу в постоянном самообновлении химических составных частей тел" /117/, видно, как важны белковые вещества для правильного развития организма и выполнения всех функций, свойственных живому существу, в том числе и человеку.
Характеристика объекта исследования
Целью исследования состояло: разработать технологию получения обезжиренных белковых изолятов из малоценных пресноводных рыб без применения органических растворителей. Поставленная задача разрешалась путем последовательного растворения бел-крв в воде, растворах неї и NaOH .
В соответствии с поставленной целью проводили серию опытов, в которых было исследовано: - Выход белка по фракциям в зависимости от соотношения фарша и растворителя, концентрации растворов неї и NaOH , температуры экстракции и времени настаивания для растворения. - Процесс обезжиривания изолятов. - Физико-химические и функциональные свойства белковых изолятов. - Применение полученных изолятов. Экспериментальную часть работы проводили в лаборатории технологии рыбных продуктов Астраханского технического института рыбной промышленности и хозяйства.
Характеристика объекта исследования Сырьем .для получения белковых изолятов в Колумбии могут служить следующие ВИДЫ рыб: Bocachico ( Prochilodus reticulaos magdalenae ), Bagre ( Pseudopimelodes fasciatum ), Barbul ( Pimeleodus clarias ), Doncella ( Agennciosus caucanus ), Pa cora ( Plagioscion surinamensis ) и другие. Химический состав и морфометрическая характеристика этих рыб представлена в таблице 2 /124,151,152,168/.
Объектом исследования выбрали красноперку ( Scardinius Erytrophthalmus ). Химический состав и некоторые морфометричес кие характеристики представлены в таблице 3.
Красноперка выбрана для проведения опытов в связи с тем, что она, являясь пресноводной рыбой, по химическому составу, а также по условиям жизни и режиму питания соответствует видам рыб Колумбии, сведения о которых приведены в таблице 2.
В экспериментах использовалась рыба мороженная, первого сорта. Методика исследования Нами предлагается следующая технологическая схема получения изолятов белка /Рис. I/.
Мороженная рыба размораживалась на воздухе при температуре помещения /+I8 С/ до температуры в мясе около - 2 С. Воздуш-ное размораживание выбрано с целью довести до минимума потери водорастворимых белков. После дефростация красноперка разделывалась на филе без кожи.
Выход филе составил в среднем 43% от массы целой рыбы. По литературным данным /72/ выход зависит от времени года и составляет весной 34,9% и осенью 44,9%.
Филе измельчалось на мясорубке с диаметром отверстия решетки 2,5 мм. Полученный фарш измельчался вторично .для более полного разрушения мышечных тканей.
При выделении белковых изолятов на каждой стадии необходимо было выбирать следующие оптимальные параметры выхода белка: I/ Соотношение фарша и добавляемой жидкости /вода, растворы неї HNaOH/. 2/ Концентрация растворов неї и NaOH 3/ Продолжительность настаивания. 4/ Температура, при которой следует вести процесс экстракции белковых веществ.
С этой целью было проведено планирование эксперимента для определения оптимальных условий выделения белка. Была использована методика Адлера Ю.П. /І/, в соответствии с которой необходимо задать верхние и нижние пределы изменения исследуемых пара-метров, влияющих на выход белка данной фракции. По заданным значениям параметров строится матрица со всеми возможными вариантами изменения этих параметров.
I/ Верхние и нижние пределы изменения параметров .для водорастворимой фракции мы выбрали следующие:
- Температура. При выборе влияния температуры мы исходим из того, что верхний предел не должен быть очень высоким, так как из литературы известно /13,48,76/, что белки саркоплазмы начинают денатурировать при 30-35 С. Исходя из этого, мы выбрали верхний предел 23 С. При температуре ниже +8 С раствор некоторых белков застудневает, поэтому выбрали нижним пределом 13 С.
- Влияние времени. При определении продолжительности экстракции фарша в воде мы исходили из того, что верхний предел должен быть ограничен возможностью развития микробиологических процессов, приводящих к порче продукта, поэтому максимальная продолжительность была условно установлена 14 часов. При этом все белки саркоплазмы переводятся в раствор и не ощущается запах гнилостного разложения фарша. Нижний предел был установлен 8 часов, так как при более коротком сроке возможно, что не вся масса белков экстрагируется.
- Соотношение фарша и воды. Верхний предел соотношения фарша и воды - четыре части воды к одной части фарша, при этом получается хорошая смесь и белки хорошо покрываются водой, что гарантирует их полное экстрагирование водой. Нижний предел для наших экспериментов - полторы части вода к одной части фарша, при более низком значении соотношения образуется студнеобразная масса, не разделяющаяся при центрифугировании на фракции.
Исследование процесса обезжиривания изолятов
Как видно из приведенных данных, по ходу увеличения скорости центрифугирования уменьшается количество липидов в продуктах. Максимальное обезжиривание .для всех фракций получается при скорости 10000 об/мин. Что касается времени центрифугирования, .для всех фракций максимальное удаление жиров наблюдается при разных значениях продолжительности процесса, для водорастворимой фракции при 10 мин., для кислоторастворимой фракции при 20 мин. и для щелочерастворимои фракции при 15 IVIHH. Дальнейшее увеличение времени центрифугирования не приводит к уменьшению содержания липидов в продуктах.
Разные условия дяя центрифугации каждой фракции мы объясняем тем, что в каждой их них имеется различный характер взаимосвязи между белками и липидами. При растворении белков в различных растворителях /вода, растворы неї и Ыаон/ часть липидов переходит в раствор, образуя при этом эмульсии, и .для разрушения связей между ними требуются более или менее жесткие условия физического или химического воздействия. Центрифугирование обеспечивает отделение двух составляющих раствора: белки и липиды.
Все последующие определения в данной работе проводили при следующих условиях центрифугирования: скорость центрифуги .для всех фракций 10000 об/мин и время центрифугирования .для водо-, кислото- и щелочерастворимои фракций соответственно - 10,20 и 15 мин. Зо1о2„ Распределение липидов в технологическом процессе.
Баланс липидов был составлен путем определения содержания жиров в основных стадиях технологического процесса /Рис. I/. Полученные данные представлены в таблице 8 в процентах на сухое вещество.
Из таблицы видно, что при первом центрифугировании /отделении водорастворимых белков/ количество жира в оставшейся массе равно 8,54 на сухое вещество. Из этого выходит, что при центрифугировании количество жира в оставшейся массе измельченных мышц снижается на 3,36%, что соответствует снижению на 31,1 по отношению к исходному количеству жира в фарше. После второго центрифу гирования /отделения кислотора творимых белков/ содержание жира в оставшемся массе равно 5,32% на сухое вещество. В этой стадии количество жира уменьшается на 3,22% по отношению к количеству жира в массе после первой центрифугации или на 7,08% по отношению к исходному количеству жира в фарше. Последнее центрифугирование /удаление щелочерастворимых белков/ дает содержание липи-дов в жоме /оставшаяся масса нерастворимых белков/ равное 3,41% на сухое вещество. Снижение количества жира по отношению к массе после второго центрифугирования составляет 1,91% или 6,99% по отношению к исходному количеству жира. За весь технологический процесс центрифугирование обеспечивает обезжиривание на 72,5%.
Как уже было отмечено, при центрифугировании вместе с отделением раствора белка от оставшейся твердой массы, одновременно происходит хорошее разделение белков от липидов. Большая часть последних остается эмульгированной в растворе. При осаждении белковых частей /коагуляцией, изменением рН среды/ основная масса жиров остается в жидкой фазе и часть выпадает в осадок вместе с белками. При этом жир в изолятах составляет, в процентах по отношению к количеству жира в растворе до осаждения, для водорастворимой фракции 4,66%, для кислоторастворимой фракции - 17,70% и для щелочерастворимой фракции 51,83%.
В итоге можно сказать, что в процессах последовательного растворения, центрифугирования и осаждения измельченных мышц по предложенной нами технологии разделения фракций в зависимости от их растворимости в воде, кислоте и щелочи, обеспечивается существенное обезжиривание конечных продуктов /изолятов белка/. При этом содержание липидов в них по отношению к исходному количеству жира в фарше в процентах составляет соответственно для водо-, кислото- и щелочерастворимой фракций - I,45%9 4,59?5 и 7,98%.
Водорастворимая фракция
Из приведенных данных в таблице видно, что содержание липидов во фракции водорастворимых белков не зависит от времени экстракции белка, следовательно, можно брать оптимальное время настаивания фарша в воде 4 часа, при этом исключается порча продукта за счет микробиологических процессов и выход белка по отношению к выходу при 10 часах экстракции сокращается всего лишь на 4,66$.
Для кислоторастворимой фракции наблюдается некоторое увеличение содержания липидов в продукте при продолжительности экстракции менее чем 14 часов. Количество удаляемого жира уменьшается при увеличении времени экстракции белка до определенного значения, после чего становится постоянным. Исходя их этого, можно рекомендовать оптимальное время получения фракции кислотораство-римых белков 14-16 часов, при этом содержание липидов в продукте такое же, что и при 26 часах, и выход белка уменьшается незначительно /5,76$ по отношению к выходу при 26 часах экстракции/.
Как видно, время экстракции каждой фракции различно. Быстрее всех экстрагируются щелочерастворимые белки, это является следствием того, что при их выделении белки этой фракции являются освобожденными от других белков и практически в оставшейся массе измельченных мышц находятся только белки ядер и нерастворимые белки стромы, и за счет этого раствор NaOH может действовать быстрее на белок. Оптимальные режимы времени экстракции белков являются следующими: для водорастворимых белков - 4 часа, для кислоторастворимых белков - 14 часов и для щелочерастворимых белков - 2 часа.
Влияние температуры
При определении влияния этого параметра были приняты постоянными: соотношение фарша и растворителя /для водорастворимой фрак - 80 ции 1 2, для кислоторастворимой фракции I 5, а для щелочераст-воримой - 1 2/, концентрация растворителей / неї - 0,6% и NaOH - 1#/ и время настаивания фарша в воде, кислоте и щелочи соответственно 4 часа, 14 часов и 2 часа.
Шкала изменения температуры была принята от О С до 36 С с интервалом в 4 С. Обработка результатов проводилась по изложенной выше схеме. Результаты приведены в таблице из полученных данных видно, что выход белка несколько увеличивается с пов дшением температуры /Рис. 8/ до определенного преде - 81 a О
Изменение содержания белкового азота в различных фракциях в зависимости от температуры экстракции. 1 - водорастворимая фракция белков 2 - щелочерастворимая фракция белков 3 - кислоторастворимая фракция белков - 82 ла. .даьнеіішее увеличение температуры приводит к уменьшению выхода белка вследствие денатурационных изменений. Исключение составляет фракция щелочерастворимых белков, где растворимость постоянно увеличивается и после 20 С, хотя увеличение растворимости уже незначительно. Все три фракции белков достигают максимума при одном и том же значении температуры /20 С/, которое можно считать оптимальным температурным режимом растворения белков.
Суммируя все вышесказанное, можно рекомендовать следующие условия выделения белковых фракций мышечных тканей красноперки /таблица 16/. целочерастворимаяВыбор оптимальных режимов осаждения фракций белков /получение изолятов/ 3.3.1. Водорастворимая фракция В полученный раствор белка приливали растворы NaOH и неї с целью установления изоэлектрическок точки, а также лодвергали нагреванию до температуры 100 С. О результатах судили по содер жаншо белкового азота в растворе до и после осаждения белка. О полноте осаждения мы судили также визуально по помутнению раствора белка. Полученные данные показаны в таблице 17.
Из таблицы 17 видно, что водорастворимая фракция очень устойчива к изменению рН среды. В щелочной среде осаждение белка вообще не наблюдается, в кислой - образуется незначительный осадок, составляющий всего около 6% от общего содержания белка в растворе. Лучший выход белка получается при нагревании, но при этом белки претерпевают денатурацию, теряют свои первоначальные гидрошильные свойства. Начало коагуляции обнаруживается при температуре 30-35 С, практически полная денатурация заканчивается при 80-35 С. Осаждение нагреванием обеспечивает переход в не-растворенное состояние 94% от общего количества БА, остальные 6% не удается осадить даже при 100 С. Это обстоятельство подтверждает ранее высказанное предположение о гетерогенности фракции.
