Содержание к диссертации
Введение
1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 5
2 МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ ГЕПАТОПРОТЕКТИВНЫХ СРЕДСТВ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 10
2.1 Гепатопротекторы флавоноидной природы 11
2.2 Солянка холмовая как источник гепатопротективных средств 24
3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЕ 31
3.1 Характеристика основных объектов исследования 31
3.2 Технологические методы исследования 32
3.3 Лабораторные животные и условия эксперимента 33
3.4 Методы изучения гепатопротективной активности 35
3.5 Статистическая обработка результатов 41
4 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 42
4.1 Разработка ресурсосберегающей технологии экстракта солян ки холмовой жидкого (лохеина-Н) 42
4.1.1 Совершенствование методов стандартизации сырья и экстракта солянки холмовой 42
4.1.2 Оптимизация технологии экстракции надземной части солянки холмовой 49
4.1.3 Определение микробиологической чистоты экстрактов солянки холмовой 67
4.2 Фармакологические эффекты экстракта солянки холмовой - лохеина-Н 70
4.2.1 Гепатопротективное действие экстракта солянки холмовой (лохеина-Н) при экспериментальном остром гепатите, вызванном парацетамолом 70
4.2.2 Гепатопротективное действие экстракта солянки холмовой (лохеина-Н) при экспериментальном остром гепатите, вызванном D-галактозамином 78
4.2.3 Гепатопротективное действие экстракта солянки холмовой (лохеина-Н) при экспериментальном хроническом гепатите, вызванном тетрахлорметаном 85
4.2.4 Желчегонное действие экстрактов солянки холмовой при экспериментальном остром гепатите, вызванном
тетрахлорметаном 92
5 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 97
6 ВЫВОДЫ ПО
7 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 112
8 ПРИЛОЖЕНИЯ 141
- Солянка холмовая как источник гепатопротективных средств
- Методы изучения гепатопротективной активности
- Гепатопротективное действие экстракта солянки холмовой (лохеина-Н) при экспериментальном остром гепатите, вызванном парацетамолом
Введение к работе
Актуальность темы
Заболевания печени и желчевыводящих путей занимают в мире одно из лидирующих мест среди причин нетрудоспособности и летальности [104]. Ежегодно на 15-30% увеличивается число больных, страдающих гепатобилиарной патологией [131]. Основными причинами такой неблагоприятной динамики являются распространение вирусных гепатитов, ухудшение экологической обстановки, рост потребления лекарственных средств и алкоголя, изменение структуры питания и увеличение числа лиц с нарушениями обмена веществ [14, 92, 130]. Опасность для здоровья и социальная значимость заболеваний гепатобилиарной системы определяют необходимость разработки эффективных патогенетически обоснованных методов фармакопрофилактики и терапии. В этом плане большой интерес представляют гепатопротективные средства, способные нормализовать метаболизм, функции и структуру паренхимы печени. Основной группой (52-55%) гепатопротекторов являются средства растительного происхождения (силимарин, силибор, Лив.52, гепа-бене, сибектан) [37, 83, 136]. Их лечебный эффект обусловлен антиоксидант-ным, антитоксическим, мембраностабилизирующим, репаративным действием [5, 19, 148, 179, 244]. Терапевтическая эффективность растительных гепатопротекторов как в эксперименте, так и в клинике не всегда оказывается достаточной и воспроизводимой [42, 98, 210]. Проблема осложняется разной степенью биологической эквивалентности препаратов-дженериков, что связано с несовершенством их технологии и стандартизации [9, 12, 142]. Большинство представленных на российском рынке гепатопротекторов являются импортными средствами, поэтому поиск и разработка новых высокоэффективных отечественных гепатопротекторов не утрачивают актуальности.
Особого внимания заслуживает надземная часть солянки холмовой (Salsola collina Pall., сем. Chenopodiaceae), на основе которой получены экстрактивные комплексы - лохеин и салсоколлин, обладающие выраженным гепатопротективным действием при экспериментальном остром и хрониче ском гепатите токсической этиологии [27, 33, 66, 118, 127]. Клинические исследования подтверждают высокую терапевтическую эффективность лохеи-на и салсоколлина при заболеваниях гепатобилиарной системы, в том числе у детей [57, 118, 126,145].
В настоящее время лохеин получают экстракцией надземной части солянки холмовои водными растворами спирта этилового низкой концентрации (25%) [144]. Подобная технология производства лохеина обеспечивает исчерпывающую экстракцию лишь части биологически активных веществ, а именно: аминокислот, алкалоидов, солей органических кислот. Менее гидрофильные фенольные соединения, стерины с высокой гепатопротективной активностью экстрагируются 25% этанолом значительно слабее. Кроме того, сохраняется проблема обеспечения микробиологической чистоты экстракта.
Технология салсоколлина предполагает экстрагирование надземной части растения 70%) спиртом этиловым с предварительной обработкой сырья хлороформом [115], что обеспечивает извлечение части комплекса биологически активных соединений и не гарантирует переход в готовый продукт соединений более гидрофильного характера, проявляющих высокий гепатопро-тективный эффект [143].
Таким образом, актуальной научно-практической задачей является совершенствование технологии экстракта солянки холмовои с целью полного извлечения биологически активных веществ, расширения спектра их терапевтического действия и повышения гепатопротективной активности при патологии печени.
Цель исследования
Разработка ресурсосберегающей технологии экстракта надземной части солянки холмовои (Salsola collina Pall.) и изучение его фармакологической активности в сравнении с действием лохеина и силимарина при экспериментальном остром и хроническом гепатите токсической этиологии.
Задачи исследования
1. Разработать технологию экстракта из надземной части солянки холмовой жидкого (лохеин-Н) с использованием комплексного экстрагента, обеспечивающую эффективное извлечение различных групп биологически активных веществ.
2. Предложить параметры и методики стандартизации лохеина-Н по основным группам биологически активных веществ.
3. Изучить влияние лохеина-Н в сравнении с действием лохеина и силимарина на гиперферментемию, перекисное окисление липидов при экспериментальном остром гепатите, вызванном у крыс парацетамолом и D-галактозамином.
4. Оценить влияние лохеин-Н на содержание фракций коллагена и гликозаминогликанов при экспериментальном хроническом гепатите, вызванном тетрахлорметаном.
5. Исследовать желчегонное действие экстрактов солянки холмовой при экспериментальном остром гепатите, вызванном тетрахлорметаном.
Научная новизна работы
Впервые разработана технология экстракта из надземной части солянки холмовой (лохеин-Н), позволяющая максимально эффективно экстрагировать различные группы биологически активных веществ растения. Предлагаемая технология дает возможность перевести в извлечение водорастворимый комплекс веществ и обогатить его фенольными соединениями.
Разработана методика количественного определения флавоноидов методом дифференциальной спектрофотометрии в надземной части и экстрактах солянки холмовой.
Впервые установлена гепатопротективная активность лохеина-Н при экспериментальном остром гепатите, вызванном парацетамолом и D-галактозамином, а также при хронической интоксикации тетрахлорметаном. В условиях острого поражения печени лохеин-Н в равной степени с лохеи-ном препятствует развитию гиперферментемии, предупреждает структурно метаболические нарушения, восстанавливает антитоксическую и экскреторную функции печени, а также эффективнее референтных гепатопротекторов тормозит образование и накопление продуктов липопероксидации в гомогенатах печени. При хронической интоксикации тетрахлорметаном лохеин-Н, превосходя эффект силимарина и в равной степени с лохеином, препятствует накоплению в печени гликозаминогликанов и коллагена.
Выявлено желчегонное действие лохеина-Н, отсутствующее у лохеина.
Практическая значимость работы
Разработан способ экстракции надземной части солянки холмовой, позволяющий максимально эффективно извлечь биологически активные вещества растения. На основании комплексных биофармацевтических исследований получен экстракт из надземной части солянки холмовой (лохеин-Н), обладающий гепатопротективной и желчегонной активностью. Разработаны и включены в нормативную документацию (ТУ) нормы качества лохеина-Н. Экспериментально обоснована целесообразность клинических исследований лохеина-Н при острых и хронических заболеваниях печени токсической этиологии, вирусных гепатитах.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Технология получения экстракта надземной части солянки холмовой жидкого — лохеина-Н.
2. Методики стандартизации сырья солянки холмовой и его экстрактов.
3. Результаты экспериментальных исследований гепатопротективной активности лохеина-Н при остром гепатите, вызванном парацетамолом и D-галактозамином, а также при хроническом поражении печени тетрахлорметаном.
4. Результаты изучения желчегонной активности лохеина-Н при острой интоксикации тетрахлорметаном.
Апробация и публикации
Материалы настоящего исследования докладывались и обсуждались на Всероссийской научно-практической конференции «Новые достижения в создании лекарственных средств растительного происхождения», посвященной 100-летию со дня рождения профессора Л.Н. Березнеговской (г. Томск, 2006 г.), VII и VIII Международных конгрессах молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (г. Томск, 2006-2007 гг.), заседаниях Томского отделения Всероссийского научного общества фармакологов (г. Томск, 2006 гг.). Предложенная технология экстракции надземной части солянки холмовой апробирована в экстракционном цехе ООО «Биолит», разработана нормативная и технологическая документация на производство. По теме диссертации опубликовано 5 работ, подана заявка на изобретение «Способ получения средства, обладающего гепатопротективной активностью» (2007 г.).
Объем и структура работы
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, посвященного механизму действия и применению гепатопротекторов растительного происхождения, 4-х глав, отражающих результаты собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, списка использованной литературы и приложений. Работа изложена на 140 страницах, иллюстрирована 23 таблицами и 10 рисунками. Библиографические ссылки включают 260 источников, из них 106 на иностранных языках.
Солянка холмовая как источник гепатопротективных средств
Одним из наиболее перспективных источников гепатопротективных средств является надземная часть солянки холмовой.
Солянка холмовая (Salsola collina Pall., сем. Chenopodiaceae) -однолетнее растение, ареал которого пролегает от низовьев Волги по Средней Азии, Казахстану, югу Сибири до Дальнего Востока. Гепатопротектив-ный эффект солянки холмовой определяется комплексом БАВ. Ведущими веществами являются бетаины, сапонины, алкалоиды изохинолиновой структуры, стерины и их гликозиды, соли органических кислот, фенольные соединения, в том числе флавоноиды (трицин, изорамнетин, кверцетин и их гликозиды), аминокислоты, минеральные соединения [1, 50, 63, 143, 260]. Интерес к изучению химического состава, фармакологических свойств солянки холмовои и созданию на ее основе лекарственных средств проявляют ученые многих стран [66, 118, 129, 225, 260]. Результатом исследований явилось появление на рынке стран СНГ фитопрепарата «Салсоколлин» (Республика Казахстан, РК - ЛС № 005009) и биологически активной добавки «Лохеин» (ООО «Биолит», Россия), полученных на основе экстрактов надземной части растения. Преимуществом солянки холмовои перед другими растениями, проявляющими гепатопротективный эффект, является то, что она успешно культивируется, позволяя получить доступное и дешевое сырье. Химико-фармакологические исследования подтвердили идентичность химического состава интродуцированнои и дикорастущей солянки холмовои, а также высокую гепатопротективную активность экстракта, полученного из растений, выращенных на плантациях, не уступающую или превосходящую терапевтическую эффективность экстракта дикорастущего растения [144].
Субстанцией препарата салсоколлин, разработанного в Институте фитохимии Министерства образования и науки Республики Казахстан под руководством академика СМ. Адекенова, является экстракт солянки холмовои, полученный экстрагированием надземной части растения 70% спиртом этиловым с предварительной обработкой сырья хлороформом с целью освобождения от балластных веществ (липиды, хлорофилл). Химический состав сал-соколлина представлен в основном фенольными соединениями (рутин, кверцетин, изорамнетин-3-глюкопиранозид, трицин), аминокислотами, в том числе незаменимыми, дубильными веществами, углеводами [1, 107, 129]. В соответствии с результатами клинических испытаний, препарат включен в «Список основных жизненно важных лекарственных средств» Республики Казахстан (приказ Министерства здравоохранения Республики Казахстан № 4 от 30.04.02).
Фармакологические исследования салсоколлина на животных с гепатитом, вызванном тетрахлорметаном, выявили наличие антиоксидантного, ге-патопротективного, желчегонного, кардиопротективного, спазмолитического действия [62, 66, 127]. Салсоколлин препятствует накоплению в печени продуктов липопероксидации, увеличивает активность антиоксидантнои защиты клеток, снижает уровень холестерина, липопротеидов очень низкой плотности, общих липидов, активность ферментов-индикаторов цитолиза гепатоци-тов и концентрацию билирубина [26, 27]. В основе лечебного действия препарата лежит ингибирование свободных радикалов флавоноидами. Эти вещества превращают гидроперекиси полиеновых жирных кислот мембранных фосфолипидов в нетоксические оксикислоты, образуют комплексы с ионами железа — катализаторами липопероксидации, что способствует обрыву цепей перекисного окисления [79, 140, 208, 230, 244].
Терапевтическое влияние салсоколлина по ряду биохимических и структурно-механических тестов превосходит эффект известного гепатопро-тектора эссенциале [27].
Фармакотерапия салсоколлином больных с лекарственными поражениями печени, развивающимися как осложнение химиотерапии гемобласто-зов, сопровождается уменьшением синдромов цитолиза и холестаза, а также мезенхимально-воспалительного синдрома [57]. Салсоколлин улучшает течение хронического гепатита, циррозов печени вирусной этиологии, хронического холецистита [62, 66]. Его используют как вспомогательное средство при ишемической болезни сердца, атеросклерозе, хроническом гастрите, язвенной болезни желудка, энтероколите, синдроме спастического кишечника, железодефицитной анемии, хроническом пародонтите [25, 57, 126, 127].
Установлена слабая иммуномодулирующая активность салсоколлина у ВИЧ-инфицированных лиц с осложнениями в виде вирусных гепатитов В и С: фитопрепарат способствует увеличению числа CD3, CD4 и снижению количества CD20, CD8 и CD56 лимфоцитов. Терапия салсоколлином сопровождается повышением адгезии и фагоцитарной активности нейтрофилов и снижением числа моноцитов [57]. Побочное действие салсоколлина не выявлено. Несмотря на широкий спектр терапевтического действия салсоколлина, технология его получения (использование 70% спирта этилового в качестве экстрагента) обеспечивает извлечение лишь части БАВ и не гарантирует полное извлечение соединений гидрофильного характера, проявляющих высокую гепатопротективную активность, что не позволяет в полной мере реализовать терапевтический потенциал растения.
Лохеин представляет собой жидкий экстракт, полученный учеными Сибирского государственного медицинского университета под руководством профессора А.С. Саратикова многократным противоточным экстрагированием надземной части интродуцированной солянки холмовой 25% спиртом этиловым [144]. Лохеин зарегистрирован Министерством здравоохранения Российской Федерации в качестве биологически активной добавки к пище (регистрационные удостоверения № 000945.Р.643.06.99 и 000962.Р.643.06.99) и широко используется с 1992 г.
В состав лохеина входят бетаины, сапонины, каротиноиды, высшие жирные кислоты, стерины, флавоноиды, алкалоиды, а также минеральные соединения, включающие около 20 макро- и микроэлементов [118].
Лохеин обладает выраженным гепатопротективным влиянием при экспериментальном остром и хроническом гепатитах, вызванных введением ге-патотоксинов с различным механизмом повреждающего эффекта - тетра-хлорметана, парацетамола (прооксиданты), аллилового спирта (источник электрофильного метаболита акролеина) и D-галактозамина (индуктор про-оксидантных цитокинов) [33, 72, 118].
Лечебный эффект лохеина обусловлен наличием комплекса БАВ [33]. Высокая концентрация глицина и других аминокислот позволяет рассматривать лохеин в качестве поставщика аминокислот. Бетаин выполняет функцию донатора метальных групп для образования фосфатидилэтаноламина и фос-фатидилхолина, являющихся основным структурным материалом для построения клеточных мембран [162, 229]. Важно присутствие небольших количеств алкалоидов (0,02-0,03%), преимущественно изохинолиновой приро ды. В эксперименте показана их способность проявлять гепатопротективный эффект и устранять спазмы гладкой мускулатуры [143, 260]. Стерины и фла-воноиды обеспечивают антиоксидантные свойства лохеина, проявляющиеся нейтрализацией АФК с обрывом цепных свободнорадикальных реакций [33, 198, 199]. Высшие жирные кислоты, в том числе полиеновая у-линоленовая кислота, являются предшественниками простагландинов [67, 118].
В экспериментах на животных с интоксикацией тетрахлорметаном, парацетамолом, аллиловым спиртом и )-галактозамином лохеин эффективнее силимарина препятствует транспорту в кровь печеночноспецифических ферментов, развитию колликвационного некроза гепатоцитов, способствует восстановлению их ультраструктуры, тормозит образование продуктов липопе-роксидации в гомогенатах, микросомах и митохондриях печени с сохранением ресурсов эндогенных антиоксидантов и функции глутатионзависимой системы [33, 70, 144]. Прямое антирадикальное действие лохеина установлено при исследовании in vitro: экстракт солянки холмовой эффективнее силимарина снижает потребление кислорода при инициированном азобисизобу-тиронитрилом окислении кумола [117].
При остром гепатите, вызванном у крыс тетрахлорметаном, лохеин тормозит фосфолиполиз с ограничением продукции детергентных лизофос-фолипидов, снижает количество триглицеридов и эфиров холестерина, повышает уровень фосфолипидов с ростом в них содержания фосфатидилэта-ноламина и фосфатидилхолина, уменьшает жировую дистрофию печени, устраняет гиперлипидемию [118].
Методы изучения гепатопротективной активности
Для первичной оценки гепатопротективной активности лохеина-Н использовали скрининговые тесты: определяли выживаемость животных, динамику массы тела в течение срока наблюдения, коэффициент массы печени (отношение массы печени в мг к массе тела в г), гистохимически оценивали степень жировой дистрофии печени (окраска Суданом III срезов печени, фиксированных 10% нейтральным формалином). Пятибалльная шкала, по которой проводили полуколичественную оценку содержания нейтрального жира [20], представлена в таблице 2.
С целью углубленного изучения фармакодинамики гепатопротекторов использовали тесты, позволяющие оценить строение, функции и метаболизм печени [20].
Локализация АЛТ и ACT в гепатоцитах различна, они по-разному диффундируют в кровь: АЛТ присутствует в цитоплазме и сравнительно легко проникает в кровь. ACT преимущественно сосредоточена в митохондриях, поэтому элиминируется из печени с меньшей скоростью. Вследствие нарушения проницаемости клеточной мембраны, развивается гиперферментемия, что является маркером цитолитического синдрома [59, 104]. Отношение АСТ/АЛТ (коэффициент де Ритиса) рассматривают как диагностический индикатор, позволяющий оценить интенсивность воспалительной реакции в печени [39].
Активность АЛТ и ACT определяли с помощью метода S. Reitman и S. Fraenkel набором «Bio-Laest» фирмы «Lachema» [59]. Принцип метода заключается в том, что в процессе переаминирования, происходящего под действием аминотрансфераз, образуются соответственно оксалоацетат и пиру-ват, реагирующие с 2,4-динитрофенилгидразином. В результате реакции появляется окрашенное соединение - гидразон пирувата, интенсивность окраски которого, определяемая спектрофотометрически при длине волны 500-530 нм, пропорциональна активности аминотрансфераз. Активность щелочной фосфатазы (ЩФ) в сыворотке крови измеряли набором «Bio-Laest» фирмы «Lachema». Метод основан на ферментативном гидролизе я-нитрофенилфосфата, имеющего большую субстратную специфичность к ЩФ. Освобожденный и-нитрофенол в щелочной среде дает желтое окрашивание, пропорциональное активности фермента [59]. Значительное повышение активности ЩФ в сыворотке крови характерно для синдрома внутрипеченочного холестаза [111].
Кислая фосфатаза (КФ) является ферментом лизосом. Увеличение ее активности в крови свидетельствует о деструкции этих органоидов и некрозе паренхимы печени. Активность КФ исследовали с помощью набора «Ново-фосфацид» (АО «Вектор-Бест», г. Новосибирск). Метод определения основан на гидролизе в кислой среде л-нитрофенилфосфата с образованием окрашенного продукта я-нитрофенола, интенсивность окраски которого пропорциональна активности фермента.
Активность у-глутамилтранспептидазы (ГТП), локализованной преимущественно в микроворсинках и цитоплазме гепатоцитов, повышается при заболеваниях печени, сопровождающихся синдромом холестаза [111]. Активность ГТП в сыворотке крови определяли с применением стандартного набора «Bio-Laest» фирмы «Lachema» (Чехия) спектрофотометрически по интенсивности окраски раствора, появляющейся в результате ферментативного гидролиза у-глутамил-4-нитроанилида [59].
Активность фосфолипазы А, катализирующей гидролиз фосфолипидов, измеряли методом С.А. Тужилина и А.С. Салуэнья [128].
Белок в сыворотке крови определяли биуретовым методом с использованием стандартного набора «Bio-Laest» фирмы «Lachema» (Чехия). Метод основан на образовании в щелочной среде комплексного соединения фиолетового цвета между ионами меди и белками сыворотки крови. Интенсивность окраски раствора зависит от содержания белка и пропорциональна оптической плотности раствора, измеряемой спектрофотометрически [59, 125]. Содержание глюкозы в сыворотке крови оценивали ферментативным методом с помощью стандартного набора «Новоглкж» (АО «Вектор-Бест», г. Новосибирск). Сущность метода заключается в окислении глюкозы кислородом воздуха при участии глюкозооксидазы с образованием перекиси водорода и р-глюконолактона. Перекись водорода под влиянием пероксидазы окисляет 4-аминоантипирин в присутствии фенола в соединение розово-малинового цвета, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна содержанию глюкозы и измеряется с помощью спектрофотометра [59].
Уровень общих липидов в сыворотке крови определяли спектрофото-метрически, используя набор «Bio-Laest» фирмы «Lachema» (Чехия). Суть метода состоит в образовании карбониевого аниона смеси ненасыщенных липидов с серной кислотой и его реакции с активированной карбонильной группой ванилина фосфата. В результате реакции образуется окрашенный комплекс, поглощающий свет пропорционально содержанию липидов [59].
Состояние экскреторной функции печени оценивали по уровню билирубина в сыворотке крови и ретенции бромсульфалеина (БСФ), отражающей захват, конъюгацию и экскрецию гепатоцитами экзо- и эндогенных субстанций.
Общий и непрямой билирубин в сыворотке крови определяли спектро-фотометрически, измеряя с помощью стандартного набора «Bio-Laest» фирмы «Lachema» (Чехия) интенсивность окраски раствора после диазореак-ции пигмента с сульфаниловой кислотой. Коэффициент глюкуронирования билирубина вычисляли как соотношение концентраций конъюгированного с глюкуроновой кислотой и общего пигментов. Коэффициент позволяет судить о способности ферментов гепатоцитов осуществлять реакции конъюгации (в норме более 80% билирубина связывается с глюкуроновой кислотой) [59].
БСФ определяли модифицированным методом [84]. Коэффициент ретенции БСФ рассчитывали как отношение уровней красителя через 45 и 1 мин после его внутривенного введения (5 мг/кг). В гомогенатах печени измеряли содержание диеновых конъюгатов -перекисей полиеновых жирных кислот, появляющихся на начальных этапах ПОЛ, а также оснований Шиффа - вторичных продуктов взаимодействия N-концевых остатков белков, аминокислот, фосфолипидов с альдегидами, возникающими в ходе реакций ПОЛ. Количество диеновых конъюгатов устанавливали спектрофотометрически [21], оснований Шиффа - спектрофлюо-рометрически [249].
Скорость образования малонового диальдегида (МДА) — низкомолекулярного продукта деградации гидроперекисей жирных кислот — исследовали в сыворотке крови ферментативным путем по интенсивности окраски триметинового комплекса в реакции с тиобарбитуровой кислотой [124].
Состояние антитоксической функции печени оценивали также по уровню аммиака и мочевины в сыворотке крови. Высокая концентрация аммиака в сыворотке крови является неблагоприятным прогностическим показателем и свидетельствует о нарушении барьерной функции печеночных клеток, не обезвреживающих токсические вещества [88]. Концентрация аммиака в тканях здорового человека поддерживается на низком уровне с помощью механизмов, обеспечивающих его утилизацию в составе мочевины. В печени под действием карбамоилфосфатсинтетазы I аммиак превращается в аминогруппу карбамоилфосфата, которая включается в мочевину и выводится из организма.
Для определения содержания аммиака в сыворотке крови использовали модификацию фенолгипохлоридного метода [2, 8].
Содержание мочевины в сыворотке крови измеряли спектрофотометрически, используя стандартный набор «Bio-Laest» фирмы «Lachema» (Чехия). Метод основан на образовании окрашенного комплексного соединения в результате реакции между мочевиной и диацетилмонооксимом в сильнокислой среде в присутствии тиосемикарбазида и ионов трехвалентного железа [59, 125]. Основными компонентами коллагеновых волокон, образующих межклеточное вещество соединительной ткани, являются коллагеновые белки. Их количество может варьировать при различных патологических процессах, а также при приеме веществ, влияющих на обмен коллагена (глюкокорти-коиды и др.) [111]. Маркером коллагена принято рассматривать аминокислоту - оксипролин, на которую приходится 12-14% аминокислотных остатков коллагена. Кроме того, оксипролин отсутствует в других белках животной ткани за исключением эластина. Таким образом, коллагеновые белки гомоге-натов печени определяли по содержанию оксипролина в 3-х фракциях коллагена: нейтрально-солерастворимого, кислоторастворимого и нерастворимого (кислотоустойчивого) [52]. Метод основан на окислении оксипролина и последующей конденсации аминокислоты с реактивом Эрлиха (п-диметиламинобензальдегид). В результате реакции образуется продукт, окрашенный в красный цвет.
Другим компонентом основного вещества соединительной ткани являются гликозаминогликаны (ГАГ). Содержание ГАГ в гомогенатах печени регистрировали с помощью реакции с дифениламиновым реактивом [47].
Влияние экстрактов солянки холмовой на скорость желчеотделения оценивали при помощи метода изолированного желчного протока [71]. Суть метода состоит в канюлировании изолированного сегмента тонкого кишечника в месте входа желчного протока при сохраненной эвакуаторной функции желудочно-кишечного тракта. Объем выделившейся желчи измеряли в течение 4 ч.
Гепатопротективное действие экстракта солянки холмовой (лохеина-Н) при экспериментальном остром гепатите, вызванном парацетамолом
Парацетамол относится к препаратам с облигатным, то есть дозозави-симым и воспроизводимым на лабораторных животных гепатотоксическим действием [16]. Парацетамол практически не вызывает нежелательные эффекты при его использовании в дозе 4 г/сут. у взрослых и 60 мг/сут. у детей [77, 218, 256]. Токсическая доза вариабельна и составляет в среднем 10-20 г. У лиц, злоупотребляющих алкоголем, она повышается до 5-10 г. При приеме более 15 г парацетамола у 80% больных развивается тяжелое поражение печени: центролобулярный некроз и печеночная недостаточность [16, 77, 130, 186,214,255].
Гепатотоксичность парацетамола обусловлена особенностями его метаболизма (рис. 10) [195].
Основная часть парацетамола в терапевтических дозах конъюгирует по глюкуронидному (60% дозы) и сульфатному (35% дозы) пути; 5% введенной дозы подвергается окислению цитохромами Р-450 2Е1, 1А2 и, возможно, ЗА с образованием свободных радикалов и электрофильных интермедиатов, наиболее активным из которых является N-ацетил-я-бензохинонимин [154]. Токсические продукты метаболизма парацетамола обезвреживаются конъюгацией с восстановленным глутатионом и выводятся в виде меркаптурата -нетоксичного метаболита, экскретируемого почками [77, 201].
При передозировке парацетамола или повышенной чувствительности к нему, обусловленной индукцией цитохрома Р-450, истощением запасов восстановленного глутатиона, ослаблением процессов глюкуронирования и сульфатирования, функция системы детоксикации оказывается недостаточной. В результате значительная часть молекул парацетамола преобразуется в токсические вещества, которые оказывают повреждающее действие, инициируя ПОЛ и образуя ковалентные аддукты с тиолами внутриклеточных и мембранных белков [147]. Повышается проницаемость мембран, нарушается гомеостаз ионов кальция, активируются фосфолипазы, протеазы, эндонуклеа-зы. В печени накапливаются провоспалительные вещества - простагландин Е2, лейкотриены, тромбоксан А2, нарушаются белковый, углеводный обмены, биоэнергетика [15, 212, 233].
Парацетамол инициирует ПОЛ, активируя продукцию АФК и производных окиси азота [154, 232]. Источником супероксидных радикалов, обладающих цитотоксическим действием, служат митохондрии печеночных клеток [155]. Супероксид-анионы реагируют с окисью азота с образованием пе-роксинитрита - мощного окислительного и нитрирующего агента. Перокси-нитрит и свободные радикалы снижают трансмембранный потенциал митохондрий, вызывают формирование гигантских пор в их мембране, увеличивают образование ядерного фактора (NF-KB) [174]. Последний стимулирует продукцию цитокинов — интерлейкина-1, фактора некроза опухоли-а, хемо-аттрактанта-1 макрофагов [195, 197, 220, 233]. Через образующиеся поры из митохондрий выходят апоптозиндуцирующий фактор и эндонуклеаза G, вызывающие деструкцию ДНК в ядрах гепатоцитов [160, 196].
На гепатотоксичность парацетамола оказывают влияние возраст, уровень глутатиона в печени, прием препаратов, способных активировать цито-хром Р-450 (некоторые психотропные средства) и ингибировать изофермеи-ты УДФ-глюкуронозилтрансферазы 1А1, 1А6, 1А9 и 2В15 (противоэпилеп-тические средства), хронические заболевания печени (снижается содержание глутатиона) и почек (уменьшается клиренс парацетамола) [218, 221, 235].
Специфическая (антидотная) терапия предполагает использование N-ацетилцистеина для стимуляции образования глутатиона и предупреждения развития некрозов печени [15, 147].
В нашем эксперименте у животных, получавших парацетамол внутри-желудочно в дозе 2500 мг/кг в течение двух дней, возникали структурно-метаболические нарушения в печени (табл. распространялся практически на все отделы печеночных долек и достигал 4,2 баллов.
Парацетамол оказывал выраженное прооксидантное действие в печени. При интоксикации содержание в гомогенатах печени продуктов липоперок-сидации - диеновых конъюгатов и оснований Шиффа, а также интенсивность образования аскорбат- и НАДФ-Н-зависимого МДА повышались в 2,4-4,3 раза (табл. 15).
Таблица 15 - Влияние гепатопротекторов на содержание продуктов липопе-роксидации в печени крыс при острой интоксикации парацетамолом
Биохимические показатели животных, отравленных парацетамолом, значительно отличались от показателей нормы (табл. 1 б).
В сыворотке крови в 7,7, 5,4 и 5,1 раза соответственно возрастала активность ферментов-индикаторов цитолиза гепатоцитов - АЛТ, ACT и КФ. Отношение АСТ/АЛТ составляло 0,91 (в группе интактных животных - 1,29). Преобладание активности ACT над активностью АЛТ свидетельствует об остром характере поражения паренхимы печени. Активность печеночного фермента фосфолипазы А под влиянием парацетамола повышалась вдвое.
