Введение к работе
Актуальность темы. Остеоартроз (ОА) является гетерогенной группой заболеваний суставов различной этиологии со сходными биологическими, морфологическими и клиническими признаками. ОА характеризуется дегенерацией суставного хряща и структурными изменениями субхондральной кости, а также явно или скрыто протекающим умеренно выраженным синовитом. ОА — одно из распространенных заболеваний у людей старше 45 лет, проживающих в северных регионах, и у человека и животных, подвергающих физическим нагрузкам опорно-двигательный аппарат на фоне нарушений обмена веществ.
Развитие иммунологии и клеточной биологии за последние годы позволяет разработать новые подходы в лечении различных заболеваний и дефектов тканей и органов организма человека и животных. Особую перспективу в биомедицине приобрели методы лечения и замещения крупных повреждений тканей стволовыми клетками, характеризующиеся способностью высокой пролиферативной активностью.
Потенции к регенерации тканей мезенхимного происхождения и доступность ММСК позволили ученым рассматривать этот материал как наиболее перспективный в регенерационной и заместительной терапии, что и является актуальной задачей в клеточной терапии.
Преимущество клеточной терапии в ее терапевтической эффективности и относительно высокой толерантности организма к клеточному материалу по сравнению с трансплантацией тканей и органов.
Важной составляющей тканевой инженерии является матрикс, с помощью которого осуществляется доставка клеток в область дефекта и их пролиферация в месте патологического поражения. В качестве матрикса для мягких тканей используются гидрогели различного происхождения, характеризующиеся инъектабельностью и высокой эффективностью загрузки ММСК.
Цель исследований. Целью исследований является создание скаффолда с мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками (ММСК) на основе фибринового гидрогеля, изучение его влияния при внутрисуставном введении животным и оценка терапевтического эффекта при остеоартрозе (ОА).
Задачи исследований:
1. Получение и оптимизация среды культивирования клеток мезенхимального происхождения костного мозга (КМ) овец и мышей.
2. Определение морфологических характеристик, митогенной активности и кариотипа мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга клеточных культур и длительности пассирования in vitro.
3. Цитодифференцировки ММСК КМ в клетки хондрогенной линий in vitro.
4. Усовершенствование метода получения гидрогеля in vitro для создания скаффолдов с ММСК и их внутрисуставной трансплантации при ОА.
5. Экспериментальное воспроизведение ОА у лабораторных и продуктивных животных.
6. Изучение терапевтической эффективности скаффолдов с дифференцированными ММСК костного мозга при ОА запястного и коленного суставов у животных.
Научная новизна. Впервые проведен сравнительный анализ методов выделения ММСК из костного мозга овцы и мыши, охарактеризованы морфологические и иммунобиологические свойства мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) и установлена оптимальная концентрация FBS при направленной пролифераций ММСК костного мозга в хондроциты и разработан способ получения фибринового гидрогеля для создания скаффолдов с ММСК.
Впервые разработан метод индуцирования остеоартроза запястного и коленного суставов овец и мышей путем внутрисуставного введения трипсина и способ лечения ОА с использованием скаффолдов с ММСК.
Практическая значимость. Разработанный метод получения гидрогеля из фибрина плазмы крови, методика иммобилизации скаффолдов ММСК и их трансплантация представляют практический интерес для биомедицины, биотехнологии и ветеринарии, для получения новых методических подходов и лекарственных форм для лечения поврежденных тканей. Разработанный метод получения гидрогеля из фибрина плазмы крови для трансплантации ММСК представляет практический интерес для биомедицины, биотехнологии и ветеринарии, поскольку позволяет получить эффективный натуральный носитель (скаффолд) хрящевой ткани при относительно низкой стоимости его приготовления.
Метод выделения и наращивания ММСК мышей используется на кафедре иммунологии, а способ трансплантации гидрогеля используется на кафедре хирургии ФГБОУ ВПО МГАВМиБ в научно-исследовательской работе и в учебном процессе.
Личный вклад соискателя. Автором непосредственно выполнены исследования по получению и культивированию ММСК костного мозга, создании скаффолдов для проведения экспериментальных испытаний при ОА у животных. Проведен анализ, сделаны выводы и даны рекомендации по дальнейшему применению разработанной технологии в биомедицине. В работе использованы материалы, полученные в соавторстве с заведующим кафедрой иммунологии член-корр. РАСХН Девришовым Д.А.
Апробация результатов диссертации. Основные результаты диссерта-ционной работы обсуждались на заседаниях кафедры иммунологии и ученого совета ФГБОУ ВПО МГАВМиБ [Москва, 2010–2013].
Публикации. По результатам диссертации опубликовано 6 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, практического использования полученных научных результатов, рекомендаций по использованию научных выводов, списка использованной литературы (198 источников, из которых 23 отечественных и 175 иностранных). Материал изложен на 124 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц, 23 рисунка и 2 страницы приложений.
На защиту выносятся следующие положения и результаты.
-
Метод выделения ММСК костного мозга овец и мышей, их культурально-морфологическая характеристика и кариотип.
-
Индуцирование остеоартроза в коленных и запястных суставах лабораторных животных путем внутрисуставного введения трипсина.
-
Метод приготовления фибринового гидрогеля и иммобилизация скаффолдов ММСК КМ.
-
Доклинические испытания скаффолдов ММСК при ОА овец и мышей.
