Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 12
1.1. Эпизоотическая ситуация по бруцеллезу в РФ на современном этапе развития животноводства 12
1.2. Характеристика антигенной структуры бруцелл 18
1.3. Особенности иммунного ответа при бруцеллезе 22
1.4. Вакцины, применяемые для специфической профилактики бруцеллеза животных 26
2. Собственные исследования 33
2.1. Материалы и методы исследований 33
2.1.1. Материалы 33
2.1.2. Методы исследований 36
2.2. Результаты исследований 40
2.2.1. Получение посевных культур штаммов В. melitensis Rev-1 и B.abortus 19 ВА при культивировании их на плотных и жидких питательных средах 40
2.2.2. Культивирование В. melitensis Rev-1 и B.abortus 19 ВА в биореакторах марки «Биор 0,25» 46
2.2.3. Концентрирование нативных культур изучаемых бруцелл методом ультрафильтрации 51
2.2.4. Получение субклеточных фракций культуры штамма В. melitensis Rev-1 54
2.2.5. Получение корпускулярных антигенов культур штаммов B.melitensis Rev-1 и B.abortus 19 В А и приготовление комбинированного корпускулярного антигена бруцелл 64
2.2.6. Моделирование инфекционного процесса при бруцеллезе на лабораторных животных 68
2.2.7. Изучение иммуногенности полученных антигенов в опытах на лабораторных животных 77
2.2.8. Результаты изучения иммуногенности комбинированного инактивированного корпускулярного антигена в опытах на овцах 82
3. Обсуждение результатов исследований 90
4. Выводы 102
5. Практическое использование полученных научных результатов 104
6. Рекомендации по использованию научных выводов 105
7. Список использованной литературы 106
Приложения 119
- Вакцины, применяемые для специфической профилактики бруцеллеза животных
- Получение посевных культур штаммов В. melitensis Rev-1 и B.abortus 19 ВА при культивировании их на плотных и жидких питательных средах
- Получение субклеточных фракций культуры штамма В. melitensis Rev-1
- Изучение иммуногенности полученных антигенов в опытах на лабораторных животных
Введение к работе
Актуальность темы. Проблема ликвидации бруцеллеза животных в Российской Федерации окончательно не решена, что подтверждается возникновением новых очагов данного заболевания в различных регионах России (Янышев А.А., 2007, Скляров О.Д., 2008).
Наиболее значимым элементом в системе профилактики бруцеллеза является вакцинопрофилактика болезни (Литвинов О.Б., 2007).
В нашей стране и за рубежом проводятся исследования по разработке и оценке эффективности различных препаратов для специфической профилактики бруцеллеза. Несмотря на это, в РФ до настоящего времени официальное признание имеет живая вакцина на основе штамма В. abortus 19. С 1952 года данная вакцина широко используется для иммунизации животных. В то же время установлено, что напряженность иммунитета, обусловленного введением живой вакцины на основе аттенуированного штамма В. abortus 19, с течением времени быстро снижается. Это определяет сравнительно невысокий ее защитный эффект.
В качестве альтернативы живым вакцинам разрабатываются инактиви-рованные вакцины против бруцеллеза животных. В этом направлении поиск преимущественно направлен на изыскание щадящих способов инактивации микроорганизмов, а также на разработку методов выделения структурных компонентов бруцелл, сохраняющих полноценными их иммуно-генные свойства.
Поэтому, выбор оптимальной антигенной основы для создания проти-вобруцеллезных вакцин для животных является актуальной задачей для ветеринарии.
Цель и задачи исследований. Цель настоящих исследований - получить различные антигены культур штаммов Brucella melitensis Rev-1 и Brucella abortus 19 BA и оценить перспективность их использования в качестве основы противобруцеллезной вакцины для мелкого рогатого скота.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Получить посевные культуры штаммов В. melitensis Rev-1 и B.abortus 19 ВА при культивировании их на плотных и жидких питательных средах.
Провести культивирование В. melitensis Rev-1 и B.abortus 19 ВА в биореакторах марки «Биор 0,25» и сконцентрировать их биомассу методом ультрафильтрации.
Получить субклеточные фракции культур штамма В. melitensis Rev-1 различной функциональной направленности.
Получить корпускулярные антигены культур штаммов B.melitensis Rev-1 и B.abortus 19 ВА и приготовить комбинированный корпускулярный антиген изучаемых бруцелл.
Смоделировать инфекционный процесс при бруцеллезе на лабораторных животных и разработать метод обострения течения инфекции.
Изучить иммуногенность приготовленных антигенов бруцелл в опытах на лабораторных животных.
Изучить иммуногенность комбинированного инактивированного корпускулярного антигена в опытах на овцах.
Научная новизна. Впервые получен комбинированный инактивиро-ванный корпускулярный антиген на основе культур штаммов В. melitensis Rev-1 и B.abortus 19 ВА в соотношении 1:2, обладающий иммуногенными свойствами. Титр антител у иммунизированных морских свинок и овец составил не менее 1:50.
Применение комбинированного инактивированного корпускулярного антигена для специфической профилактики бруцеллеза у овец позволяет предотвратить заражение бруцеллезом 80% животных.
Полученные методом гель-хроматографии белковые фракции В. melitensis Rev-1 с молекулярной массой (135±15) кД, (50±10) кД и (25±5) кД обладают слабыми иммуногенными свойствами и являются не перспективными для создания на их основе вакцинных препаратов для специфической профилактики бруцеллеза животных.
Впервые установлено, что введение иммунодепрессанта циклофосфана в дозе 200 мг/кг веса животного на 21-30 сутки после инфицирования возбудителем бруцеллеза обеспечивает обострение инфекционного процесса и
повышает на 20% информативность бактериологического метода обследования искусственно зараженных морских свинок и овец.
Применение усовершенствованного бактериологического метода выявления больных бруцеллезом животных с обострением инфекционного процесса при использовании циклофосфана позволило доказать высокую антибактериальную эффективность пефлоксацина в отношении бруцелл у зараженных бруцеллезом морских свинок. Терапевтическая эффективность пефлоксацина в условиях смоделированного инфекционного процесса при бруцеллезе составила 90%.
Впервые разработан метод глубинного культивирования культур штаммов В. melitensis Rev-1 и B.abortus 19 ВА с использованием биореакторов марки «Биор-0,25». Выход биомассы при выращивании культуры штамма B.melitensis Rev-1 был выше в 1,3 раза, чем B.abortus 19 ВА.
Практическая значимость. На производственном участке ООО «Аг-ровет» (г. Киров-200) воспроизведена технология глубинного культивирования культур штаммов В. melitensis Rev-1 и B.abortus 19 ВА с использованием биореакторов марки «Биор-0,25». Получено по 3 серии культур штаммов бруцелл с высоким выходом бактериальной массы.
На базе лицензированной по работе с микроорганизмами I-IV групп патогенносте лаборатории НИИ микробиологии МО РФ (г. Киров) успешно проведено моделирование инфекционного процесса при бруцеллезе морских свинок и овец. Разработан метод обострения инфекционного процесса с использованием иммунодепрессанта циклофосфана.
Разработанный комбинированный инактивированный корпускулярный антиген на основе культур штаммов В. melitensis Rev-1 и B.abortus 19 ВА в соотношении 1:2 является перспективным для создания на его основе вакцинного препарата для специфической профилактики бруцеллеза животных.
По результатам исследований составлены и утверждены в установленном порядке 2 отчета о научно-исследовательской работе (промежуточный и заключительный) на тему: «Создание иммунобиологических средств защиты животных на основе корпускулярных коньюгированных и субъеди-
ничных компонентов микроорганизмов-возбудителей бактериальных и грибковых (Trichophyton) заболеваний».
Разработаны методические рекомендации: «Технология глубинного культивирования вакцинных штаммов B.melitensis Rev-1 и B.abortus 19 ВА», «Метод обострения инфекционного процесса при бруцеллезе животных», «Получение растворимых и корпускулярных антигенов бруцелл».
Материалы исследований используются в учебном процессе в ФГОУ ВПО МГАВМиБ при изучении дисциплин «Иммунология», «Ветеринарная микробиология» и «Биотехнология».
Личный вклад соискателя. Автору принадлежит непосредственное участие во всех этапах работы, в т.ч. в культивировании бруцелл поверхностным и глубинным методами, в получении различных белковых фракций бруцелл методом гель-хроматографии, создании комплексного корпускулярного инактивированного антигена изучаемых бруцелл, моделировании инфекционного процесса при бруцеллезе на морских свинках и овцах, определении реактогенности и иммуногенности полученных антигенов с использованием лабораторных животных и овец, анализе и обобщении полученных результатов исследований.
В работе использованы материалы, полученные лично автором, а также в соавторстве с микробиологом производственного участка ООО «Агро-вет», доктором биологических наук, профессором Кузнецовым СМ., которому выражаю глубокую благодарность за помощь и поддержку.
Апробация результатов диссертации. Основные результаты исследований доложены на научно-практической конференции молодых ученых (Москва, 2006); на XV Московском международном ветеринарном конгрессе, на секции «Болезни крупного рогатого скота» (Москва, 2008); на международной конференции «Наука и образование для целей биобезопасности» (Пущино, 2008); на международной научно-практической конференции «Проблемы увеличения производства продуктов животноводства в России и пути их решения» (г. Дубровицы, 2008).
Публикации. По результатам диссертации опубликовано 4 статьи, в т.ч.
3 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК.
Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 129 страницах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований, обсуждение полученных результатов, практическое использование полученных результатов, рекомендации по использованию научных выводов, список использованной литературы (121 источник, в т.ч. 39 - иностранных авторов). Работа содержит 25 таблиц, 14 рисунков, 10 страниц приложений.
На защиту вносятся следующие положения и результаты:
Способ получения биомассы культур штаммов В. melitensis Rev-1 и B.abortus 19 В А, методы ее инактивации, дезинтеграции и выделение антигенной основы.
Результаты изучения иммуногенности комбинированного корпускулярного антигена В. melitensis Rev-1 и B.abortus 19 В А в опыте на лабораторных и сельскохозяйственных животных.
Метод обострения инфекционного процесса при бруцеллезе животных с помощью иммунодепрессанта циклофосфана и повышение информативности бактериологического метода обследования зараженных возбудителем бруцеллеза животных.
Вакцины, применяемые для специфической профилактики бруцеллеза животных
Открытия возбудителей инфекционных заболеваний, определило в качестве одного из направлений их профилактики — создание вакцин, обеспечивающих невосприимчивость к данному инфекционному агенту. Их исполь-зование позволяет изменять развитие и течение эпизоотического процесса. Данная группа препаратов за период их использования претерпели большие изменения, пройдя путь от аттенуированных и убитых вакцин, до современных генно-инженерных и синтетических вакцин (19).
В отношении возбудителя бруцеллеза было разработано и испытано большое количество различных препаратов, которые предлагались для его вакцинопрофилактики. Результаты работ различных авторов показали, что проблемы при создании этих вакцин часто связаны с иммунобиологическими свойствами вакцинных штаммов, а также невозможностью создания "стерильного" иммунитета и индукцией вместе с иммунологической перестрой кой макроорганизма ряда нежелательных явлений, снижающих эффектив ность иммунизации, таких как поствакцинальные серологические и аллерги ческие реакции. , Живые вакцины. На ранних стадиях изучения бруцеллеза были предложены вакцины из живых аттенуированных штаммов бруцелл. Наибольшее распространение получила вакцина из штаммов В.abortus 19, которая до настоящего времени активно используется для профилактики этого инфекционного заболевания. Штамм был выделен в 1923 году из молока абортиро-вавшей коровы и с 1934 года он используется в качестве вакцинного. За время её применения было показано, что данный препарат обладает достаточной иммуногенностью, создавая невосприимчивость у КРС в течение одного года при однократном введении (13).
Другой аналогичной вакциной, широко используемой в различных странах, является вакцина из штамма В. melitensis Rev-1. Данный штамм был вы-делен в 1957 году в США. Эта вакцина обладает более выраженной иммуногенностью, сенсибилизирующими и реактогенными свойствами, чем препарат из штамма В. abortus 19. В настоящее время она используется для про-филактики бруцеллеза овец, крупного рогатого скота, оленей, против эпиди-димита баранов (82).
В настоящее время в России широко внедряется для профилактики бруцеллеза КРС живая вакцина из штамма-В.-abortus 82, разработанная в Казанском ветеринарном институте Салмаковым К.М.. Применение этого препарата, по данным одних авторов, показало его достаточную иммуногенность и сравнительно низкую сенсибилизирующую и антителообразующую активность. Другие исследователи отмечали низкую иммуногенность вакцины и стимулирование длительной циркуляции антител. Это обусловлено тем, что штамм В. abortus 82 находится в промежуточной RS-форме диссоциации, что и определяет его способность переходить в другие формы, S и R, причем их соотношение может варьировать. Именно эта нестабильность биологических свойств штамма и определяет разнообразие полученных экспериментальных данных (75, 78).
Не получили распространения другие живые вакцины, которые в разное время были разработаны, и предлагались для практического использования из за низкого защитного эффекта и значительной иммунизирующей дозы. При разработке этих вакцин авторы особое внимание обращали на проблему агглютиногенности, пытаясь получить культуры, лишенные этого свойства, что приводило к значительному снижению из патогенных свойств, что определяло низкую иммуногенность (7).
Оценивая многолетний опыт применения живых вакцин для профилактики бруцеллеза, можно заключить, что самым серьезным недостатком, ко-торый сдерживает их более интенсивное использование, является прямая зависимость иммуногенности с остаточной вирулентностью. Стремление достигнуть высокой иммуногенности неизменно приводит к эффекту высокой сенсибилизации и реактогенности, а также длительной серопозитивности и персистенции штамма. При использовании же диссоциированных штаммов, то есть лишенных в разной степени полисахаридной части ЛПС, остается опасность реверсии штаммов в вирулентную S-форму.
Инактивированные корпускулярные вакцины. Разработка и исполь-зование инактивированных противобруцеллезных вакцин является перспективным направлением, положительные моменты которого состоят из эпизоотической безопасности, отсутствием абортогенности, большие возможности для транспортировки и хранения готовой формы препарата (32, 56).
В России на протяжении длительного времени были проведены исследования по изучению инактивированной формолвакцины Муромцева — Тро-нина (с 1938 по 1951 год), полученной из штамма вида B.melitensis. Результаты проведенных исследований в различных лабораториях были противоречивы, что не позволило использовать данный препарат для практической ветеринарии (3). Аналогичные результаты были получены при изучении защитного действия формоловой вакцины, разработанной в 1944 г. Николаевым В.А. (78). В настоящее время подобные препараты находят применение в ветеринарной практике. К их числу можно отнести вакцину 53Н38 — «Абролан», которая представляет собой суспензию инактивированных формалином микробных клеток В. Melitensis штамма НЗ, находящихся в S-форме, и полидисперсного адъюванта; вакцину 45/20 — «Абортос», состоящую из суспензии инактивированных формалином микробных клеток В. abortus штамма 45/20 (R-форма) и полидисперсного адъюванта (29). В РФ запатентована «Вакцина против бруцеллеза крупного рогатого скота», которая содержит в своем составе инактивированную формалином с гидратом окиси алюминия бактериальную массу (300-4004109) микробных клеток в 1 мл В. abortus штамма № KB 17/100 в R-форме и неполный адъю вант Фрейда. Эта вакцина, не индуцирующая образование S-антител, способ на обеспечивать защиту от бруцеллеза 69-80% морских свинок при зараже нии их вирулентными культурами В. abortus-через 3 месяца после прививки (27). Таким образом, в России исследования по созданию вакцин на основе инактивированных культур для иммунопрофилактики бруцеллеза в настоящее время является одним из основных направлений.
Получение посевных культур штаммов В. melitensis Rev-1 и B.abortus 19 ВА при культивировании их на плотных и жидких питательных средах
Качество посевных материалов, включая порядок их приготовления и подготовки к работе, является существенным фактором выращивания микроорганизмов, не зависимо от способа культивирования.
Рост и развитие микроорганизмов происходят в результате протекания в микробных клетках сложных биохимических процессов потребления и ути t лизации компонентов питательной среды, каждый из которых может оказывать влияние на численность микробов и их физиологическое состояние. В связи с этим создание и использование питательных сред оптимально сбалансированного состава является одним из определяющих условий успешного осуществления различных биологических процессов, в основе которых лежит выращивание микроорганизмов. Бактерии рода Brucellae являются весьма прихотливыми микроорганиз мами. При этом активность ферментов, катализирующих реакций переамо нирования в клетках возбудителя бруцеллеза, позволяет выращивать данный возбудитель только с использованием питательных сред, приготовленных из гидролизатов различного белкового сырья, где в качестве источника азота выступают отдельные аминокислоты или аммонийные соли, а источниками углерода и энергии - углеводы. ; Указанные выше теоретические полр ения легли в основу приготовления глубинных культур возбудителя бруцеллеза, предполагающей восстановление основных биологических свойств возбудителя и накопление необходимого количества биомассы на плотной питательной среде, скошенной в пробирках и матрацах, приготовление посевных культур в аэрируемой среде в бутылях, а также в результате проведения управляемого процесса глубинного культивирования бактерий Brucellae в биореакторах. Учитывая это, целью наших исследований при получении антигенных комплексов бруцелл было накопление бактериальной массы штаммов В. melitensis Rev-1 и В. abortus 19 В А в необходимых для продолжения опыта количествах. Для получения достаточного количества биомассы бруцелл при культивировании их глубинным методом в биореакторах, перед нами стояло 2 зада-чи: 1. Подобрать оптимальный состав жидких и плотных питательных сред для культивирования В. melitensis Rev-1 и В.abortus 19 ВА. 2. Получить посевные микробные культуры бруцелл. Плотная питательная среда использовалась для выращивания бруцелл в пробирках, чашках Петри и матрацах. В настоящее время в практике широко используется коммерческая плотная среда для культивирования бруцелл - эритрит агар (г. Махачкала). Однако данная среда является высокоэффективной для выделения первой генерации возбудителя. При последующих пересевах на этом агаре изучаемая культура бруцелл может диссоциировать. т Поэтому, мы остановились на плотной питательной среде на основе Ft-агара, при культивировании на которой бруцелл их диссоциация не наблюдается. Плотную питательную среду на основе Ft-arapa готовили согласно инструкции. Посевы бруцелл производили на предварительно проверенные питательные среды. Для проверки агара из 2-суточной культуры В. melitensis и В.abortus готовили суспензии бруцелл в концентрации 200 микробных клеток в 1 мл (по стандарту мутности ГИСК им, Л.Д.Тарасевича). Посев проводили на 4 чашки по 0,1 мл - 20 мкл суспензии. Через 5 суток», пребывания в тер-мостате при 37С в среднем на 1 чашке Петри вырастало не менее 18 колоний бруцел, что свидетельствует о кондиционности плотной питательной среды. Матрацы с агаром располагали в слегка наклонном положении. После застывания агара матрацы выдерживали в течение 5-7 суток при комнатной температуре и использовали для выращивания бруцелл. Срок годности приготовленной среды составлял 20 суток при хранении в условиях бытового холодильника при температуре 2-6С. Жидкую питательную среду для выращивания бруцелл в бутылях, емкостью 20,0 дм3, готовили на основе гидролизата мяса, разведенного дистиллированной водой, по следующей прописи: Непосредственно перед культивированием в каждую бутыль вносили стерильные растворы тиамин хлорида, никотиновой кислоты и глюкозы. На первом этапе получения посевных" микробных культур бруцелл, рабочие лиофильно высушенные культуры штаммов. В. melitensis Rev-1 и В. abortus 19 В А, ресуспендировали фосфатным буферным раствором (ФБР) и высевали в 20 пробирок со скошенной плотной питательной средой (1111С) на основе Ft-arapa (по 10 пробирок на каждую культуру штамма бруцелл). Посевы микробных культур бруцелл инкубировали при температуре 36-38С в течение 72-96 ч. По истечении указанного времени выросшие на ППС культуры смывали ФБР. Часть из полученных таким образом микробных- суспензий использовали для оценки накопления биомассы бруцелл путем высева серийных разведений на ППС в чашках Петри, а часть микробной суспензии использовалась для пересева на скошенную в матрацах соответствующую ППС из расчета: смыв с 1 пробирки для засева 1 матраца. По окончании срока выращивания в течении 72-96 ч при температуре 36-38С, выросшую культуру смывали ФБР и оценивали накопление биомас сы микробных клеток с использованием бактериологического метода (метод БК). Результаты выращивания микробных клеток изучаемых бруцелл на скошенных в пробирках и матрацах ППС, приготовленных на основе Ft-агара, представлены в табл. 4.
Получение субклеточных фракций культуры штамма В. melitensis Rev-1
Концентрированную суспензию культуры штамма B.melitensis Rev-1 в количестве 50 мл подвергали ультразвуковой дезинтеграции (22 - 35 кГц, 70, 100 и 300 Вт/см ) в течение 2, 10 и 15 мин. Клеточные стенки отделяли центрифугированием (8000 об/мин в течение 30 мин), осадок ресуспендировали в 0,5%-ном растворе фенола и вновь озвучивали в течение 15 мин.
Контроль качества инактивации бруцелл проводили методом высева проб на чашки Петри с плотной питательной средой на основе Ft-arapa. Кроме того, проводили микроскопию окрашенных по Граму мазков из дезинте-гратов бруцелл, полученных при различных режимах озвучивания.
Было установлено, что слабая дезинтеграция на ультразвуковом дезинтеграторе при 100 Вт в течение 2 минут вела к разрушению конгломератов бруцелл и в последующем считалась цельноклеточным экстрактом бруцелл. Более глубокая дезинтеграция клеточной массы в двукратном объеме 0,15 М NaCl (рН 7,2) при 300 Вт в течение 15 мин. и после центрифугирования приводила к получению растворимого антигенного препарата - ультразвукового дезинтеграта, содержащего антигены цитоплазмы и клеточных оболочек бруцелл.
Однако в результате отработки режимов дезинтеграции бруцелл мы остановились на наиболее щадящих и эффективных режимах озвучивания клеточной массы - 100 Вт в течение 30 мин при интенсивном охлаждении ячейки ультразвукового дезинтегратора в спирте с сухим льдом. Полученный дезинтеграт ультрацентрифугировали при 60000 g в течение 1 часа. Из надосадочной жидкости протеиновую фракцию осаждали путем изо-электрического фокусирования при 4,0 рН. Далее в дезинтеграт добавляли PMSF (2 тМ) и определяли содержание белка по Брэдфорду. Концентрация белка в осадке составила 65 мг/мл. Часть дезинтеграта бруцелл замораживали при минус 40С и сохраняли для дальнейшей работы. Оставшуюся часть дезинтеграта бруцелл, используемую в работе, очи-щали методом диализа против 0,001 М фосфатного буфера в целлофановой диализной трубке в течение 18 часов. В результате проведенных исследований бцл получен дезинтеграт культуры штамма B.melitensis Rev-1 для последующего его фракционирования. Метод ультразвуковой дезинтеграции бруцелл имеет преимущества перед методом «замораживания-оттаивания», т.к. является менее трудоемким и непродолжителен по времени. Фракционирование суммарных белков бруцелл. Выделение антигенных комплексов B.melitensis Rev-1 из дезинтеграта проводили методом гель-хроматографии с использованием колонок размером 1,5x100, заполненных сефадексом G 100 (фирма Pharmacia, Швеция). Высота геля составила 80 см. , Колонка была уравновешена 0,9%-ным раствором NAC1 с рН 6,0-6,2. Обработку сорбента и заполнение колонки сефадексом G 100 проводили в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя. В качестве образца для гель-фильтрации был использован белок в концентрации 60 мг/мл, осажденный четырьмя объемами этанола из 20 мл надо-садочной жидкости дезинтеграта B.melitensis Rev-1. Белок растворили в 2 мл физраствора и нанесли на колонку. Заданный объем гель-фильтрации составил 28-30 мл/час. Со свободного объема колонки собрали в цилиндр 22 мл жидкости и определили на спектрофотометре при длине волны 280 нм концентрацию белка. Белка в жидкости не оказалось, и ее слили в канализацию. Элюат собирали в пробирки по 3-5 мл. Всего было отобрано 23 пробы элюата. Каждую пробирку с пробой измерили на белок на спектрофотометре при длине волны 280 нм. Элюат с высокой концентрацией белка (белковые пики) собрали отдельно, остальные пробы отбросили (табл. 13). При изучении УФ-спектров поглощения белковых фракций бруцелл было установлено, что фракции характеризовались двумя максимумами поглощения в области длины волны при 260-265 нм и 28 5-290 нм и содержали от 12,0±0,09% до 25,0±0,2% белка и от 13,2±0,9 до 31,0 ±0,9% нейтральных са-харов. Полученные белковые фракции бруцелл лиофильно высушивали. Далее определяли острую токсичность полученных антигенов на белых мышах. Для этого были созданы группы животных-аналогов - по 5 мышей на каждый вид антигена и 5 мышей — контрольная группа. Белым мышам опытных групп вводили по 0,05 мл суспензии определенного антигена, предварительно растворив лиофильно высушенный антиген в 2,0 мл физраствора, мышам контрольной группы аналогично вводили физраствор. За мышами вели клинические наблюдения в течение 7 дней. Оценивали общее состояние и гибель животных. При контроле острой токсичности полученных антигенов у белых мышей не было выявлено наличия местных и общих реакций организма на введенные антигены, аппетит и подвижность животных были сохранены, все животные остались живы. Следовательно, полученные антигены бруцелл не обладают острой токсичностью для белых мышей. В результате проведенных экспериментов была отработана технология получения экстрацеллюлярного антигена бруцелл с выделением из него низкомолекулярного компонента. Было получено по 3 серии каждого антигена.
Изучение иммуногенности полученных антигенов в опытах на лабораторных животных
Поиск высокоэффективных и безопасных для человека и животных средств иммунопрофилактики бруцеллеза в последние годы преимуществен-но направлен на изыскание щадящих способов инактивации бактерий и выделения структурных компонентов клетки, позволяющих сохранить полноценными их иммуногенные свойства.
В качестве альтернативы живым вакцинам неоднократно предпринима-лись попытки создания химических и инактивированных вакцин против бруцеллеза. Одним из достоинств таких препаратов считается возможность од-новременного их применения в комплексе с антибактериальными препарата-ми, так как при этом не нарушается течение иммуногенеза. .
В результате проведенной работы нами были получены 6 различных антигенов культур штаммов B.melitensis Rev-1 и В.abortus 19 ВА: - комбинированный инактивированный корпускулярный антиген B.melitensis Rev-1 и B.abortus 19 ВА в соотношении 1:2; - суммарные белки B.melitensis Rev-1 не отмытые; - суммарные белки B.melitensis Rev-1, дважды отмытые физраствором; - фракция I - белки B.melitensis Rev-1 с М.м. (135±15) кД; - фракция II - белки B.melitensis Rev-1 с М.м. (50±10) кД; - фракция III - белки B.melitensis Rev-1 с М.м. (25±5) кД. Данные литературы свидетельствуют.о том, что в «чистом виде» инак-тивированные культуры бруцелл и их антигенные компоненты достаточнобыстро элиминируются из организма и ввиду этого создают не продолжительный иммунитет. . Однако основной задачей нашей работы являлось обоснование перспек тивности использования полученных антигенов в качестве основы для созда ния новых вакцинных препаратов? \ Учитывая это, рассмотрение. , вопросов определения иммунизирующих доз, применения адъювантов и носителей, выбора эффективной схемы ис пользования антигенов не изучался. Изучение реактогенности и оценку иммуногённых свойств полученных \ антигенов проводили в опытах на морских свинках. Было создано 7 групп морских свинок-аналогов по 10 голов в каждой - 6 опытных и 1 контрольная. / ; Животным опытных групп вводили подкожно полученные антигены бруцелл в дозах, обеспечивающих иммунологическую перестройку организма при использовании бактериальных антигенов. Животным контрольной группы аналогично вводили физраствор. За весь период наблюдений за животными, который составил 30 суток,отмечали общее состояние животных, температурную реакцию, наличие или отсутствие аппетита, подвижность. ; На 7, 14, 21 и 28 сутки с момента постановки опыта у морских свинок отбирали пробы крови для постановки пластинчатой РА ц определения нали-чия антител. Оценивали процент положительно реагирующих (серопозитив-ных) животных (табл.-19). Анализ представленных в таблице данных свидетельствует о том, что комбинированный инактивированный антиген и суммарные белки клеток (СБК) B.melitensis Rev-1, как отмытые, так и не отмытые обеспечивали имму-нологическую перестройку организма морских свинок в 100% случаях, что подтверждалось положительными результатами Серологического обследования животных, проведенными на 28 сутки после их антигенов. В тоже время;динамика нарастания титров антител свидетельствовала о том, что наибольшее значение этот показатель достигал при введении СБК не отмытых, что обусловлено способом его приготовления. I Оценка иммунологического воздействия на гуморальную систему организма морских свинок белковьіх фракций бруцелл, полученных методом гель-хроматографии, показала,, что они по своей иммуног нности уступают как СБК, так и комбинированному инактивйрованному корпускулярному ,М антигену. Причем, иммуногенность белковых фракций снижалась параллельно с уменьшением их молекулярной массы (рис. 13). При оценке реактогенности полученных антигенов бруцелл было установлено, что патологических реакций после введения антигенов, а также во все дни исследований отмечено не было. Животные были подвижны, аппетит хороший, температурная реакция не наблюдалась, общее состояние морских свинок было удовлетворительное. Для определения защитных свойств экспериментальных образцов антигенов иммунизированных животных опытных групп инфицировали культурой штамма B.melitensis 16 М, как описано выше, подкожно в паховую область бедра задней конечности. Заражающий материал вводили в объеме 1,0 см3 в дозе 102 м.кл/мл. Аналогично инфицировали животных контрольной группы. Через 30 суток после заражения у морских свинок отбирали пробы крови для РА, а также проводили аллергическую пробу и бактериологическое обследование с использованием усовершенствованного бактериологического метода. Анализ данных, представленных в таблице 20, свидетельствует о том, что наиболее высокой профилактической эффективностью (80%) обладает комбинированный инактивированный корпускулярный антиген бруцелл. Данный антиген, полученный на основе комбинации в соотношении 1:2 инактивированных цельноклеточных культур В. melitensis Rev-1 и В. abortus 19 В А, является наиболее, перспективным для создания вакцинных препаратов для профилактики бруцеллеза животных. Использование антигенов, состоящих из суммарных белков клеток, вы 82 деленных из культуры штамма В. melitensis Rev-1, требует дальнейшего изучения и рассмотрения вопроса о повышении их иммуногенности. Белковые фракции, выделенные из культуры В. melitensis Rev-1 мето дом гель-хроматографии, являются не перспективными в качестве основы вакцинных препаратов. Таким образом, проведенные исследования показали, что экспериментальные образцы исследуемых антигенных препаратов и комбинации цель-ноклеточных инактивированных культур в опытах на лабораторных животных характеризовались определенной профилактической эффективностью при заражении вирулентным штаммом В. melitensis М 16.
Данное обстоятельство определило возможность проведения дальнейших исследований по оценке защитного эффекта комбинированного антигена, состоящего их инактивированных цельноклеточных культур видов В. melitensis и В. abortus, как наиболее перспективного в качестве основы вакцинного препарата в опытах на сельскохозяйственных животных.
