Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Современные представления о структурных превращениях нуклеиновых оснований
1.1. Взаимосвязь между структурой азотис тых оснований и функцией нуклеиновых кислот стр.
1.2. Методы изучения таутомерии, и их особенности применительно к нуклеиновым ОСНО-'
ваниям . ........ стр.15
1.3. Сравнение экспериментальных и теоретических данных о молекулярной структуре
оснований стр.24
1.3.1. Цитозин .... стр.24
1.3.2. Урацил, тимин . стр.31
1.3.3. Аденин. . стр.35
1.3.4. Гуанин. . стр.39
1.4. Расширение возможностей молекулярной спектроскопии в методе "матричной изоляции". . . стр.45
1.5. Постановка задачи и выбор экспериментальной методики стр.55
Глава 2. Описание экспериментальной установки стр.58
2.1. Основные технические требования. стр.58
2.2. Система криостатирования стр.61
2.3. Система приготовления образцов стр.63
2.3.1. Блок подложек стр.64
2.3.2. Испарители стр.65
2.3.3. Система напуска Аг стр.67
2.3.4. Кварцевые микровесы стр.69
2.3.5. Порядок приготовления образцов. . . . стр.73
2.4. Спектральное оборудование и исследуемые соединения стр.74
Глава 3. Новые экспериментальные данные о молекулярном строении изолированных оснований стр.76
3.1. Цитозин и его производные стр . 76
3.1.1. ИК-спектры стр. 76
3.1.2. Теоретический расчет колебательных спектров стр. 83
3.1.3. Электронно-колебательные спектры.стр. 91
3.2. Урацил, тимин стр. 94
3.3. Аденин, пурин, пиримидин ....стр.102
3.4. Гуанин, изоцитозин .стр.112
3.5. Сравнение полученных результатов с теоретическими расчетами и некоторые выводы стр.121
Глава ІV. Изучение ассоциации матрично-изолированных молекул стр.127
4.1. Автоассоциация стр. 129
4.2. Взаимодействия с водой стр.133
4.3. Выводы о влиянии межмолекулярных Н-свя-
зей на структуру оснований стр.136
Глава V. Возможные биологические приложения стр. 140
Заключение стр.147
Литература стр.149
Приложения с тр. 162
- Взаимосвязь между структурой азотис тых оснований и функцией нуклеиновых кислот стр.
- Система криостатирования
- Цитозин и его производные стр
- Автоассоциация
- Возможные биологические приложения
Взаимосвязь между структурой азотис тых оснований и функцией нуклеиновых кислот стр.
Развитие представлений о механизмах генетических процессов тесно связано с исследованиями структуры нуклеиновых кислот. На основе открытого Уотсоном и Криком /I/ специфического спаривания азотистых оснований в двойной спирали, возникли общепринятые в настоящее время модели сохранения и передачи, генетической информации. Прогресс в понимании взаимосвязи структуры и функции нуклеиновых кислот существенно зависит от решения проблемы таутомерии гетероциклических оснований. Эта проблема затрагивает такие фундаментальные биологические процессы, как реализация генетической информации, мутагенез и др. Так, одна из наиболее общепринятых теорий спонтанного возникновения мутаций основана на возможности существования оснований в различных таутомерных формах /2-5/. Таутомеры в гетероциклах образуются при миграции атома водорода от одного атома кислорода или азота к другому. Для азотистых оснований Q. pziozi можно) ожидать, например, что если, цитозин переходит из амино- в иминоформу, или урацил— из кето- в еноль-ную структуру, то это приведет к изменению системы водородных связей, стабилизирующих уотсон-криковские пары,и появится возможность образования так называемых "неправильных" А-Ц или Г-Т пар рис. I.
Действительно, биохимические исследования проведенные в последние годы показывают, что происхождение большинства генетических нарушений связано с заменой оснований в ДНК /2/. Причем, замена одного пурина на другой или одного пиримидина на другой,
Система криостатирования
Как уже отмечалось выше, для проведения всех экспериментов в которых в качестве матриц используется отвердевший аргон, достаточно интервала температур от 8 до 40 К. Исходя из этого была разработана оригинальная система криостатирования, представляющая собой комбинацию наливного и проточного типов криостатов (Рис.12). Необходимый для работы запас жидкого гелия заливается в стандартный криостат 2 -модели Р 147.00.00.00.(производства ФТИНТ АН УССР). В процессе заправки криостата и далее, в течение всей работы, часть испаряющегося газообразного Не, проходя через систему теплообменников 3, охлаждает съемный блок низкотемпературных опти ческих подложек 8. При этом направленный поток газообразного гелия (на рис. 12 изображен стрелками) охлаждает тонкостенные трубки из нержавеющей стали подвеса блока подложек и, таким образом, препятствует распространению тепла от образцов к гелиевой ванне. Благодаря этому удается проводить эксперименты при температурах, значительно превышающих температуру кипения жидкого Не, без существенного увеличения расхода хладоагента. Вентили I позволяют регулировать величину потока газообразного Не через теплообменники) 3 и, тем самым, обеспечивать грубую (с точностью I К) регулиг-ровку температуры блока подложек 8. Измерение температуры образ цов осуществляется с помощью арсенид-галиевого термометра-сопротивления 9, питаемого от стабилизатора тока 50 ± 0,02 мкА.Второй такой же термометр, находящийся в теле нижнего теплообменника 3, и нагреватель б включены в систему автоматического регулирования температуры, обеспечивающей при необходимости термостатирование подложек с точностью 0,02 К. Измерение температуры выше Є0 К осуществляется дифференциальной медь-константановой термопарой относительно днища азотной емкости криостата.
Предлагаемая система криостатирования показала хорошие эксплуатационные параметры. Она надежна и удобна в работе, а главное обладает высокой экономичностью расхода хладоагентов. Так одной заливки жидкого гелия объемом 4 л достаточно для 9 часов непрерывной работы, даже в условиях значительного теплопритока от источника ИК-излучения спектрофотометра.
Цитозин и его производные стр
Колебательные спектры цитозина и его производных представлены на рис. 15,16 и в таблице V . Число нормальных колебаний тринадцатиатомной молекулы цитозина равно 33. Однако в его ИК-спектре наблюдается более 50 хорошо разрешенных колебательных полос поглощения, что может свидетельствовать о существовании в равновесии более чем одной молекулярной формы. Если такое увеличение числа полос связано с переходом атома водорода в молекуле, то закрепление таутомерной структуры с помощью метилирования приводить к резкому упрощению колебательного спектра. Действи -тельно, в спектре 1-метилцитозина число наблюдаемых колебательных переходов резко снижается.
Проанализируем частоты колебаний групп, содержащих подвижные атомы водорода, которые непосредственно характеризуют возможет ные таутомерные формы молекул. В области 3590 3430 см в ИК спктре цитозина наблюдаются четыре пика, соответствующие валентным колебаниям этих групп (Рис.17). Каждая из этих полос действительно отвечает подвижному протону, а не является, например, обертоном или составной частотой. На это указывают характерные изотопные сдвиги rv л їГ всех четырех пиков после быстрого дейтеро-обмена в тяжелой воде. Две из указанных частот относятся к симметричному и асимметричному колебаниям аминогруппы :
(NH2)ac 3559 см 1 и 9 (NH2)CHM = 3438 см"1 , поскольку они согласуются с аналогичными частотами колебаний аминогруппы в 1-метилцитозине (см. рис. 17). Наиболее высокочастотная полоса Y = 3587 см""1 совпадает по частоте с колебанием ОН группы 2-окоипирамидина, который, как было показано в /89/ в газовой фазе полностью находится в енольной форме. Четвертая, слабая полоса принадлежит \ NjH = 3468 см-1 , как будет показано ниже,она близка по частоте к Y NjH урацила и его производных. Б низкочастотной области спектра наблюдается интенсивная полоса с частотой 1193 см , такая же полоса ( 1198 см ) имеется и в спектре 2-оксипиримидина и относится к деформационному колебанию ОН-группы. Эта полоса сдвигается при дейтерировании ( OQD » 947 см- ) и отсутствует в спектре 1-метилцитозина.
Автоассоциация
Для изучения гомоассоциации молекул в матрицах используе два методических приема. Первый, традиционный подход - изучен концентрационных зависимостей спектральных характеристик, ши] применяемый при исследовании ассоциации в растворах. В низкот пературных матрицах при уменьшении молярного соотношения меж? исследуемым веществом и аргоном в ИК-спектрах появляются харе терные для автоассоциатбв новые полосы. Обычно в наших опыта слабые полосы димеров начинали проявляться при соотношениях 1:600, а при концентрации 1:100 вместо относительно узких по; димеров или тримеров образуются широкие диффузные полосы агрє тов. Типичный для такой концентрации спектр урацила представь на рис. 29, а. Видно резкое отличие от спектра невзаимодейстЕ щих молекул (см. рис. 20).
Кроме этого, существует второй способ изучения ассоциаци который возможен только в матрицах. Суть его состоит в том, ч повышение температуры твердой матрицы выше определенного знач ния. (отжиг), резко усиливает в ней процессы диффузии, приводя к тому, что изолированные молекулы могут ориентироваться и с б жаться относительно друг друга. Указанная методика обладает т преимуществом, что процесс ассоциации можно остановить или во новить на любой стадии путем изменения температуры образца. П отжиге существует верхний предел температуры, обусловленный можным испарением матрицы. Оптимальным режимом отжига для наб дения ассоциации оснований является температура 33 35 К. На р 29,6 показано изменение спектра (а ) урацила после I часа о жига при 35 К.
Очевидно, что в отличие от растворов, процесс ассоциации молекул в матрицах необратим, вследствие чего получение термодинамических параметров ассоциатов невозможно. Однако, главным недостатком метода при изучении межмолекулярных взаимодействий молекул с большим числом донорных и акцепторных групп (как в слу -чае оснований) является то, что в матрицах реализуются различные термодинамические неравновесные конфигурации комплексов. При этом спектральная картина ассоциатов сильно осложняется /113,114/.
Спектр ассоциированного цитозина в матрице, полученный при соотношении компонент 1:500, представлен на рис. 30, а. Общей характеристикой спектра является существенное ухудшение разрешения полос вследствие их уширения и сдвигов, а также появления ряда новых полос. Ниже (Рис. 30,6) приведен тот же спектр после двух часов отжига при температуре 35 К. Оба рисунка, а также ряд не приведенных промежуточных стадий, позволяют наглядно проследить тенденции в изменении спектра при автоассоциации цитозина.
Проведем анализ этих изменений. В области валентных колебаний протонодонорных групп, по мере увеличения степени ассоциации, появляются и возрастают в интенсивности новые полосы димеров
Такие же полосы наблюдаются в спектре 1-метилцитозина и, следовательно, относятся к связанным симметричному и асимметричному колебаниям аминогруппы соответственно. Близкие значения частот №?)связ получены в спектрах ассоциатов аденина и 2-аминопиримидина.
Возможные биологические приложения
В результате проведенных исследований по изучению молекулярного строения азотистых оснований выявлен ряд принципиально важных особенностей. В частности показано, что среди оснований замещенных по первому или девятому положению соответственно в: пиримидинах или пуринах, специфическим свойством существовать, одновременно в двух таутомерных формах в большей степени обладает 9-метилгуанин и значительно слабее - 9-метилгипоксантин. В составе нуклеиновых кислот вместо метальной группы к основаниям присоединен сахарный остаток (рибоза или дезоксирибоза). Указанная особенность обнаружена при изучении: изолированных оснований и является их собственной физической характеристикой. Способность гуанина к таутомерным переходам в: составе нуклеиновых кислот под влиянием окружения должна сильно понижаться, в противном случае это приводило бы к значительным ошибкам в работе генетического аппарата по передаче и сохранению генетической информации. Однако такие, ошибки, называемые мутациями, происходят, правда довольно редко. Более того они необходимы, поскольку являются источником развития живой материи. Механизм мутаций в настоящее время окончательно не установлен. Полученные нами данные позволяют вернуться к предположению Уотсона и Крика /I/, что таутомерные переходы в основаниях являются источником мутаций, но теперь уже на более реальной основе. По-видимому, ошибки могут возникать только вследствие переходов гуанина в енольную форму. При этом могут образовываться "неправильные Г-У или Г-Т пары по механизму, изображенному на рис.34.
Примечательно, что Г-У пары реально существуют в составе большинства транспортных РНК /122-125/. Их термодинамическая стабильность, изученная на модельных пента- и додекамерных олигонуклео-тидах /126/, не уступает стабильности уотсон-криковских А-У пар.
Однако, структура и система водородных связей в Г-У парах не установлена.
Если предположить, что в некоторых специфических условиях окружения, на одной из стадий метаболизма нуклеиновых кислот гуанин переходит в енольную форму, удается объяснить ряд известных в молекулярной биологии фактов. Так, очень логичное объяснение находит экспериментально установленная Фризом /25/ и Дрейком /26/ концепция "горячих точек", по которой участки генома обогащенные Г-Ц парами подвержены мутациям.
Причина неустойчивости Г-Ц пар, вероятно, заключается в склонности гуанозина (единственного из канонических нуклеозидов) переходить в енольную форму.
Поскольку, на основании наших данных производные урацила не образуют таутомеров, то повышенную мутагенную способность 5-бром-урацила, по видимому, неправильно объяснять его переходами в енольную форму /2/. иб этом свидетельствует , в частности, опыт с фагами /2,б/.Оказывается, что выход мутаций сильно возрастает с увеличением Г_ц состава и слабо зависит от степени включения му -тагена в фаговую ДНК. Даже 100$ замена тимина в ДНК фага Т2 на 5-бромурацил, дает всего 10$ мутантов, причем мутации в них, как пишет автор /2/, "...возникают в результате незначительного и химически не выявленного включения 5-бромурацила вместо цитозина". По-видимому, механизм мутагенной активности 5-бромурацила может заключаться в повышении стабильности "неправильной" Г-У пары (см. рис. 34), по сравнению с таковой з случае тимина. Редкие включения 5-бромурацила вместо цитозина становятся возможными вследствие перехода гуанина в енольную форму.
