Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современное состояние диагностики отравлений наркотическими веществами в судебно-медицинской практике 1 4
1.1. Диагностика отравлений наркотическими веществами 15
1.2. Морфологические критерии наркотической интоксикации 16
1.3. Химические критерии наркотической интоксикации .21
1.4. Биохимические критерии наркотической интоксикации .33
Глава 2. Материалы и методы .38
2.1. Определение опиатов в крови и моче методом иммуноферментного анализа с использованием диагностических наборов 41
2.2. Определение опиатов в крови и моче методом газовой хромато-масс-спектрометрии 42
2.3. Определение опиатов в трупном материале методом тонкослойной хроматографии 42
2.4. Исследование мочи трупа на наличие наркотических веществ группы опиатов методом высокоаффинной жидкостной хроматографии 42
2.5. Антроновый метод определения гликогена по Рою и Моррису в модификации Зейфтера 43
2.6. Определение количества глюкозы крови, мочи, перикардиальной жидкости глюкозооксидазным методом 43
2.7. Определение концентрации мочевины и креатинина в крови 43
2.8. Определение концентрации миоглобина в крови, моче, перикардиальной жидкости 45
2.9. Определение концентрации гликированного гемоглобина в крови .46
2.10. Определение активности холинэстеразы в крови методом Хистрина в модификации Эйдельмана 46
2.11. Хемилюминесцентный метод определения антиокислительной активности биологического материала в модельной системе гемоглобин- люминол-перекись водорода (Нв-ЛМ-Н2О2) 47
2.12. Статистический анализ данных 48
Глава 3. Определение опиатов методом иммуноферментного анализа при гнилостной трансформации трупа 49
3.1 Сопоставление результатов с данными тонкослойной хроматографии и газовой хромато-масс-спектрометрии 49
3.2. Определение опиатов методом иммуноферментного анализа при гнилостной трансформации трупного материала в течение 6 недель 55
3.3 Определение опиатов методом иммуноферментного анализа при гнилостной трансформации трупного материала в течение 6 месяцев (26 недель) 62
3.4. Оценка разности оптических плотностей по отношению к 1 дню измерения; каждого последующего измерения к предыдущему .68
3.5. Количественная оценка наличия наркотических веществ группы опиатов 70
3.6. Оценка влияния пробоподготовки в виде центрифугирования на результаты иммуноферментного анализа .71
3.7. О влиянии опиатов на антиоксидантную активность трупной крови и мочи .73
Глава 4. Оценка биохимических показателей трупного материала в группах объектов с наличием опиатов 77
Глава 5. Обсуждение полученных результатов (заключение) 97
Выводы .107
Практические рекомендации 108
Список литературы 109
Приложение 1 .126
Приложение 2 .132
- Морфологические критерии наркотической интоксикации
- Определение опиатов в крови и моче методом газовой хромато-масс-спектрометрии
- Определение активности холинэстеразы в крови методом Хистрина в модификации Эйдельмана
- Определение опиатов методом иммуноферментного анализа при гнилостной трансформации трупного материала в течение 6 недель
Введение к работе
Актуальность исследования.
Проблеме диагностики смертельного отравления наркотическими веществами посвящены' многочисленные работы отечественных и зарубежных авторов.
По официальным данным число лиц, употребляющих наркотические средства, за последние годы постоянно увеличивается (2,13,21,33,34,40,41). В России в настоящее время наркоманией страдает более 1 млн. человек. Из общего числа насильственной смерти отравления составляют в среднем 23% (42). Проблема наркомании принимает угрожающие масштабы, растущее разнообразие наркотических и одурманивающих средств способствует вовлечению в свой мир все большего количества людей, как правило, молодого и юного возраста (29,30,31,36,42,53). Перестали быть редкостью случаи острого отравления наркотиками детей до 14 лет (42). Постоянным спутником наркомании являются такие страшные заболевания как ВИЧ и гепатиты В, С и некоторые другие, передающиеся парентеральным путем (26,31,115). По данным зарубежных исследователей большой процент потенциальных доноров злоупотребляет наркотиками (123,134).
Повышение уровня отравлений и смертности от передозировки наркотических средств влечет за собой увеличение количества судебно-медицинских экспертиз на наркотики.
Одним из распространенных наркотических средств, возможно, более доступным для населения, злоупотребляющего наркотиками, является морфин, представитель группы опиатов.
На рис. 1 представлены данные отделения общих химических методов исследования Бюро судебно-медицинской экспертизы Департамента Здравоохранения г. Москвы по определению наличия веществ группы опиатов в трупном материале за 2000-2003 г:
Рис. 1. Случаи определения опиатов в трупном материале за 2000-2003 гг.
Прослеживается тенденция к сокращению случаев обнаружения наркотических веществ группы опиатов. Однако, этот факт не свидетельствует об однозначном уменьшении употребления наркотиков этой группы. Эти данные говорят лишь о возможном сокращении смертельных случаев отравлений.
Диагностика наркомании у живых лиц не представляет проблемы вследствие широкого выбора исследуемого материала. Гораздо больше затруднений возникает при судебно-медицинской экспертизе трупов, в том числе на наличие наркотических средств, в связи с тем, что, как правило, отсутствует анамнестические данные, обстоятельства дела. При проведении судебно-медицинской экспертизы достаточно часто секционное исследование проводится спустя некоторое время после смерти (на 1-е, 2-е, 3-е сутки). В отдельных случаях после наступления смерти может пройти значительно больший промежуток времени. В связи с этим судебно-медицинским экспертам приходится сталкиваться с трупами, подвергшимися в какой-то мере гнилостному разложению, что значительно затрудняет постановку диагноза. По данным Российского центра судебно-медицинской экспертизы за 2003 год на территории РФ было зарегистрировано 57 тыс. гнилостно измененных трупов с неустановленной причиной смерти. По данным Бюро судебно-медицинской экспертизы Департамента Здравоохранения г. Москвы за 2003 год насчитывается 150 таких случаев в Москве. Таким образом,
возникают определенные проблемы, связанные с исследованиями частично или полностью путрифисцированного биологического материала (1,32,66). Многие эксперты лабораторной службы не считают возможным исследовать такие объекты, мотивируя свой отказ недостоверностью возможных результатов.
Учитывая факт наличия определенных морфологических критериев диагностики наркотической интоксикации, необходимо отметить, что решающая роль в постановке данного диагноза принадлежит все-таки результатам судебно-химического исследования.
Традиционные методы определения наркотиков в трупном материале при проведении судебно-медицинской экспертизы включают хроматографические методы анализа, такие как тонкослойная хроматография (ТСХ), газовая хромато-масс-спектрометрия (ГХ/МС), высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) (21). Эти методы требуют пробоподготовки образца и занимают много времени (обычный срок исполнения судебно-химической экспертизы на наличие наркотических веществ составляет в среднем до 1 месяца по данным Бюро судебно-медицинской экспертизы Департамента Здравоохранения г. Москвы).
Существующие ныне иммунохимические методы позволяют провести исследование на наличие наркотических средств гораздо быстрее, в частности, иммуноферментный анализ может дать результат в течение 1 дня. Такие методы достаточно просты, не требуют специальной пробоподготовки, обладают чувствительностью и специфичностью. Среди иммунохимических методов исследования в судебной токсикологии наиболее распространены следующие: иммуноферментный анализ (ИФА), радиоиммунный анализ (РИА) и поляризационный флюороиммуноанализ (ПФИА) (21,34).
Как было указано выше, исследование гнилостно измененных трупов, в частности на наличие наркотиков, представляет значительные трудности.
Вопрос о сохранности наркотических веществ в тканях и органах трупа
при гнилостных изменениях недостаточно изучен. По данным литературы
опиаты достаточно быстро метабол изируются. Период полужизни
морфина в плазме 2-3 ч, связывание с белками 20-30% (10). Кинетика
элиминирования из плазмы свободного и связанного морфина различны.
После введения 1 мг/кг морфина (инъекции в спинномозговой канал)
максимальная концентрация в плазме 100 нг/мл в интервале 2-5 мин
уменьшается до 60 нг/мл в течение 1-1.5 часов и до 15-10 нг/мл в через 2-4
часа. Концентрация связанного морфина увеличивается при этом от 9 до
80 нг/мл в интервале 2-20 мин и затем остается неизменной по крайней
мере до 4 часов (10). Выведение морфина происходит через почки. За 8
часов выводится 80% введенной дозы морфина, за 24 ч - 64-90%, через 72-
100 ч в моче определяют следы морфина (10). По данным С.Н. Сучковой и
В.А. Томилина (1995) период полужизни морфина в крови составляет 2-3
ч, экскреция опиатов с мочой завершается в течение 2 суток, при
абстиненции (через 1-3 суток после последней интоксикации) опиаты
обнаруживались в моче и не выявлялись в сыворотке крови (62). При
определении наркотиков в крови и моче от 52 добровольцев методом ГХ-
МС морфин удалось обнаружить в течение 270 часов, 6-
моноацетилморфин в течение 34.5 часов, в сыворотке крови морфин определяется в течение 121 часа. Кодеин в моче присутствует 123 часа, в сыворотке до 29 часов (136).
В отношении стабильности морфина и кодеина в биологических жидкостях данные литературы противоречивы. Концентрация общего морфина и кодеина в моче при хранении в замороженном состоянии при -20С была стабильна в течение года (90). По литературным данным содержание общего морфина и кодеина в моче снижается на 10-40% в течение 11 мес при хранении охлажденными до 4-8 С или замороженными при -15С, при этом концентрация свободных морфина и кодеина постоянно возрастает. В комнатных условиях (25-30С) за 11 мес
концентрация общего морфина может уменьшиться на 70-100%, а концентрация свободного морфина меняется непредсказуемо (в зависимости от рН, наличия бактерий, концентрации коньюгатов), значительно увеличиваясь в некоторых образцах мочи в течение 30-90 дней хранения (120). Морфин свободный и морфин коньюгированный стабильны в образцах мочи и крови в течение 10 дней хранения при температуре 4С, 18-22С и 37С (10).
В литературе есть данные о сохранности наркотиков и лекарств в волосах, ногтях в течение длительного времени (103,111). В волосах наркоманов присутствие наркотиков, в том числе и опиатов, адекватно выявляется только с помощью высокочувствительных химико-токсикологических методов как радиоиммунный анализ, газовая хромато-масс спектрометрия, высокоэффективная жидкостная хроматография вследствие их низкой концентрации (нг/мл) (138). Проведение исследования волос на присутствие наркотических веществ оправдано в случае необходимости подтверждения диагноза хронической интоксикации при клиническом исследовании, а также в судебно-медицинской практике для выяснения причин летального исхода при подозрении на острую интоксикацию. Показано, что после одноразового употребления наркотики обнаруживаются в волосах не ранее, чем через 5-7 дней (когда они уже не выявляются в крови, слюне и моче), и сохраняются в волосах, не метаболизируясь, в течение нескольких лет (87,94). Однако, анализ такого материала требует значительной пробоподготовки и времени (34).
В судебно-медицинской практике часто бывает необходимо в самом начале судебно-медицинской экспертизы правильно сориентировать танатолога в вопросе о наличии наркотических веществ в трупном материале, помочь в выборе хода исследования. В таких случаях серьезным недостатком является срок исполнения судебно-химической экспертизы. Кроме того, судебно-химическое исследование на наркотики
не всегда дает истинный положительный результат, что связано с недостаточно высокой чувствительностью традиционных химических методов (31,34). Многие авторы считают оптимальным вариантом использование высокочувствительного иммунохимического анализа с применением стандартизированных реагентов для лабораторной диагностики наркотической интоксикации (46,62). Использование иммуноферментного анализа позволяет выявить скрытые формы наркомании в случае отсутствия употребляемого вещества в организме (46,62). Для иммуноферментного исследования требуется кровь и моча, не нуждающиеся в специальной пробоподготовке, срок исполнения экспертизы значительно меньше (до 1 дня), чувствительность и специфичность метода достаточно высоки, чтобы применять ИФА на предварительном этапе судебно-медицинского исследования (21). По данным литературы, есть возможность использования биохимических показателей при постановке диагноза наркотической интоксикации — определение концентрации глюкозы, гликогена и миоглобина (48). Помимо этого, при длительном злоупотреблении наркотическими препаратами, возможны полиорганные нарушения, которые можно выявить на основании изменений концентраций мочевины, креатинина. В трупном материале возможно качественное выявление билирубина, уробилиногена и ацетона в моче, что также способствует диагностике нарушений функциональной активности печени и почек. Обнаружение рядом с трупом приспособлений для инъекций наводит на мысль о злоупотреблении наркотиками, однако, не исключена возможность наличия сахарного диабета у потерпевшего. Для диагностики данного заболевания необходимо проводить исследование гликозилированного гемоглобина, глюкозы и ацетона. Активность холинэстеразы также, по литературным данным, может свидетельствовать об употреблении морфина - морфин угнетающе воздействует на данный показатель (55). Возвращаясь к вопросу о недостаточном изучении сохранности
наркотиков в трупном материале в условиях гниения представляется
весьма актуальным исследование трупного материала при наличии
гнилостных изменений методом иммуноферментного анализа с
обязательным сопоставлением результатов указанного метода с данными стандартных судебно-химических методов.
Цель работы: применить метод иммуноферментного анализа для выявления наличия наркотических веществ группы опиатов в крови и моче при гнилостной трансформации и разработать критерии экспертной оценки наркотической интоксикации по биохимическим показателям органов и тканей.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи.
Задачи исследования:
Провести исследование крови и мочи из трупов методом иммуноферментного анализа и тонкослойной хроматографии, газовой хромато-масс-спектрометрии, высокоэффективной жидкостной хроматографии для сравнения полученных результатов по наличию наркотических веществ группы опиатов.
Провести иммуноферментное исследование крови и мочи из трупа, содержащей опиаты, в условиях хранения материала при температуре +4С в течение 6 мес (1 деньД неделя, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 20, 24, 26 недель) и при температуре +18-20С в течение 6 мес (1 деньД неделя, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 20, 24, 26 недель).
3.Провести иммуноферментное исследование крови и мочи из трупа, не содержащей опиаты, в условиях хранения материала при температуре +4С в течение 6 мес (1 деньД неделя, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 20, 24, 26 недель) и при температуре +18-20С в течение 6 мес (1 день,1 неделя, 2, 4, 6, 8, 12, 16,20, 24,26 недель).
4. Оценить влияние пробоподготовки трупного материала с элементами гемолиза и гниения (центрифугирование в течение 10 мин при 3 тыс. об/мин) на результаты иммуноферментного анализа.
Оценить антиокислительную активность крови и мочи с элементами путрификации с наличием опиатов и без таковых.
Оценить изменение биохимических показателей (глюкозы, мочевины, креатинина, миоглобина, гликогена, активности холинэстеразы, гликированного гемоглобина) в крови, моче, перикардиальной жидкости, печени, миокарде, скелетной мышце при наличии опиатов. Апробация работы. Материалы диссертации были доложены и обсуждены на 2-ой Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы судебной биохимии» (Санкт-Петербург, 2003), на заседании научного общества судебных химиков Российского Центра судебно-медицинской экспертизы (2004), совместном заседании кафедры судебной медицины МГМСУ, 9-ого танатологического отделения и химического отделения Бюро СМЭ ДЗ Москвы (2004).
Внедрение в практику. Результаты, полученные в ходе проведения диссертационного исследования, внедрены в практическую деятельность Бюро судебно-медицинской экспертизы ДЗ г. Москвы. Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных статей. Получена приоритетная справка №2004109841.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена в 1 томе на 135 страницах компьютерного текста и состоит из введения, 5 глав, выводов и практических рекомендаций, списка литературы, включающего 153 источника (73 отечественных и 80 зарубежных авторов), приложений 1 и 2, иллюстрирована 17 таблицами и 47 рисунками. На защиту выносятся положения:
1. Иммуноферментный анализ с использованием диагностикума обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Указанное положение подтверждено с помощью стандартных химических методов (тонкослойной хроматографии, газовой хромато-масс-спектрометрии, высокоэффективной жидкостной хроматографии), примененных для выявления наркотических веществ группы опиатов.
Иммуноферментный анализ информативен при выявлении наличия опиатов в крови и моче с гнилостными изменениями при хранении трупного материала при температуре +4С и при температуре +18-20С.
Пробоподготовка в виде центрифугирования в течение 10 мин при 3 тыс. оборотов/мин достоверно не влияет на результаты иммуноферментного анализа.
Проведение комплексной оценки биохимических показателей крови, мочи, перикардиальной жидкости, печени, миокарда и скелетной мышцы способствует постановке диагноза наркотической интоксикации и позволяет исключить диагноз сахарного диабета при подозрении на наркоманию.
Научная новизна.
Впервые в судебно-медицинской практике применен метод иммуноферментного анализа с использованием диагностикума для обнаружения опиатов при гнилостных изменениях крови и мочи. Доказано, что гнилостное разложение объектов (кровь и моча) в сроки до 6 месяцев при хранении объектов при температуре +4С и при температуре +18-20 С не препятствует установлению наличия опиатов.
Впервые проведено исследование методом хемилюминесценции трупного материала, содержащего опиаты и раствора морфина.
Впервые для обоснования диагноза наркотической интоксикации использованы биохимические показатели - содержание глюкозы, гликогена, мочевины, креатинина, миоглобина, активности холинэстеразы, гликозилированного гемоглобина, билирубина, ацетона, уробилиногена в крови, моче, перикардиальной жидкости, печени, миокарде, скелетной мышце. Доказана возможность использования указанных показателей также для диагностики сахарного диабета.
Морфологические критерии наркотической интоксикации
Симптомами морфинизма визуально являются: сужение зрачков, резкое истощение, желтушность кожи, рубцы и пигментные пятна на локтевых сгибах и бедрах после частых инъекций (10). Также при обследовании наркоманов отмечаются следующие соматические признаки: дряблость кожных покровов (27.5%), кариес и пародонтоз (80%), атрофия произвольной мускулатуры (38.8%), клиническая картина хронического бронхита (58.8%), кожно-венерических заболеваний (63.8%), различные виды сердечных аритмий (52.5%), признаки гепатита и поражения гепатобилиарной системы (60%). Возможно обнаружение наличия педикулеза, чесотки, туберкулеза и других социальных заболеваний. При наружном осмотре тела часто наблюдается истощение, желтоватая кожа у морфинистов, землистая у предпочитающих барбитураты. Характерными признаками являются разнообразные трофические расстройства со стороны придатков (50). При секционном исследовании выявляются признаки васкулитов, тромбофлебита, фасциита, инфаркта мозга, ангиопатий головного мозга, хронических воспалений слизистой оболочки верхних дыхательных путей, инфекций вследствие иммунодефицита, ассоциированного с ВИЧ, кардиомиопатий, поражений органов пищеварения (при употреблении барбитуратов - острые эрозии слизистой оболочки желудка), гломерулонефрита, синдрома позиционного сдавления, печеночной недостаточности (50). О.В. Кригер и соавторы (2001) приводит следующие морфологические критерии острой интоксикации при злоупотреблении наркотиками - отек мозга, дистрофические изменения в миокардиоцитах, признаки хронического гепатита, гиперплазия фолликулов селезенки, очаговый склероз, продуктивные васкулиты в дерме. Авторы считают, что при непонятной для эксперта причине смерти после проведения исследования трупа ориентирующими показаниями для взятия материала на наличие наркотических веществ следует считать: молодой возраст, любые проявления длительной экзогенной интоксикации, следы инъекций. Особое внимание обращается на неординарный подход к гнилостно измененным трупам и сложность исследования путрифисцированного материала (31).
СВ. Шигеев (2001) предпринял попытку классифицировать признаки острого отравления опиатами на основании исследования 163 трупов лиц, в тканях и средах которых была обнаружена летальная концентрация морфина, часто в сочетании с 6-МАМом. Средний возраст погибших составил 24,6+4,1 года, лиц мужского пола было 147 (87,7%), женского -16 (9,8%). Автор рассматривал следующие признаки: синюшность, одутловатость лица, кровоизлияния: в полнокровные оболочки глаз, внутрикожные на фоне разлитых пятен, под мягкие мозговые оболочки, периваскулярные в стволовые отделы мозга, под плевру и в ткань легких, субэпикардиальные, периваскулярные в миокард, в поджелудочную железу, под капсулу и в паренхиму тимуса и селезенки, отек и полнокровие мягких мозговых оболочек. Сравнивая признаки, автор выявил две группы симптомов, характеризующих синдром острого отравления наркотическими веществами. I-я группа включает признаки быстро наступившей смерти, II-я включает признаки синдрома геморрагических нарушений, выраженность которого определяется по наличию комплекса из трех проявлений: синюшность, одутловатость лица, кровоизлияния в полнокровные оболочки глаз, внутрикожные кровоизлияния на фоне трупных пятен, которые в совокупности тесно связаны с остальными признаками (71).
По данным литературы, возрастает количество отравлений веществами группы опиатов преимущественно среди молодых мужчин, трупы которых обнаруживаются в квартире (9). Д.В. Богомолов (2001) считает, что отравление наркотическими веществами вызывает комплекс морфологических изменений, которые в своей совокупности носят черты специфичности именно для данного вида отравлений и могут быть использованы в судебно-медицинской диагностике. По мнению указанного автора острое отравление наркотиками морфологически отличается от хронической наркомании явлениями острого первичного поражения субкортикальных структур головного мозга с последующей его ишемизацией и острыми дисциркуляторными нарушениями. Для хронической интоксикации характерен специфический набор поражений хронический дермато-панникулит в исходе множественных инъекционных поражений, хронический портальный гепатит С или Д с преобладанием фибропластической реакции, фолликулярная гиперплазия лимфоидных органов, наркогенная кардиомиопатия, очаговый легочный гемосидероз, бактериальный эндокардит, диссеминированные гранулематозы, прогерическая перестройка гистоархитектоники эндокринных органов (9). В pаботе Солохина Е. В., Каниболоцкого А. А., Чеpнолиховой И. А. с соавторами (2002) представлены результаты проведенного анализа секционного материала умерших в течение 1998—1999 гг. в pезультате отpавления наpкотиками. Полученные pезультаты свидетельствуют, что отpавление наpкотическими пpепаpатами связано с пpименением опиатов или их комбинацией с дpугими веществами (в пеpвую очеpедь с этиловым спиpтом). Смеpтность мужчин пpевышает смеpтность женщин в соотношении 3:1. Выявляемая концентpация моpфина/геpоина в кpови и моче постpадавших pазлична и колеблется в очень шиpоких пpеделах. Развитие острой почечной недостаточности, миоглобулинуpийного нефроза и синдрома сдавления не характерно для случаев остpого отpавления наpкотическими пpепаpатами. Авторы считают, что применение иммунотеста на наличие моpфина/геpоина в моче тpебует дальнейшего изучения (60).
С.В. Шигеевым (2003) был разработан комплекс критериев для судебно-медицинской диагностики смертельных отравлений веществами из группы опиатов на основе обстоятельств и условий наступления смерти, данных макро и микроскопических исследований, эпидемиологических и лабораторных данных и был создан алгоритм судебно-медицинского исследования погибших в этих случаях. Диагностические критерии были разделены на ориентирующие - мужской пол; молодой возраст; смерть вечером или ночью; смерть в подъезде жилого дома; наличие на месте обнаружения трупа инъекционных приспособлений; данные катамнеза, - и определяющие - положительный результат при использовании тест полосок для определения наркотиков в моче; инъекционные повреждения на коже погибшего; развернутая картина выраженных гемодинамических нарушений; комплекс признаков хронического токсического поражения внутренних органов. Обнаружение в тканях и органах погибшего токсической концентрации метаболитов опиатов в сочетании с описанными признаками свидетельствует о наличии острого отравления (72).
Павленко Е. Ю., Зиминой Л. Н., Галанкиной И. Е., Бариновой М. В. (2003) изучены морфологические изменения в органах и тканях в случаях смерти от острого отравления наркотическими веществами, структурная основа острой дыхательной недостаточности при скоропостижной "героиновой" смерти и смерти в более поздние сроки интоксикации. Материалом для исследования явились умершие от острого отравления опиатами на догоспитальном этапе (контрольная группа, 106 случаев) и умершие в НИИСП им. Н.В. Склифосовского (основная группа, 55 случаев). Контрольная группа была разделена на 5 подгрупп - 1) токсическая концентрация морфина и других алкалоидов опия в сочетании с алкоголем в некоторых случаях, 2) следовые количества морфина в сочетании с алкоголем в некоторых случаях, 3) положительный результат на морфин (тест-полоски) при отрицательном результате судебно-химического исследования, 4) опиаты не обнаружены, 5) токсические концентрации психотропных препаратов и алкоголя у лиц с морфологическими проявлениями наркомании. Проведенный клинико-анатомический анализ материала с учетом данных иммунологических, биохимических, химических и спектрального методов исследования представляет интерес. Авторы выявили закономерность патологических изменений во всех группах. У умерших на догоспитальном этапе наиболее характерными признаками являлись - следы уколов на коже, циркуляторные расстройства в органах, умеренный отек легких на фоне тяжелых соматических изменений, грубые изменения в миокарде. Спектральное исследование в случаях отравления наркотиками было применено впервые для изучения кожи и мягких тканей из зоны инъекций и показало повышение концентрации железа, кремния, алюминия, свинца, серебра, а также титана и хрома, которые обычно в норме в коже у человека не определяются. При исследовании кожи из мест инъекций умерших от других причин повышенное содержание каких-либо элементов не выявлено (48). Wehner F, Wehner HD, Subke J, Meyermann R, Fritz P. (2000) применили иммуногистохимический метод для обнаружения скоплений морфина в веществе головного мозга. По сравнению с контрольными случаями (при внезапной смерти без употребления морфина или злоупотребления героином) в случаях передозировки опиатов было обнаружено наличие скоплений морфина в ткани нервного узла, аксона и дендритов. Таким образом, предполагается наличие массивной концентрации морфина в нейрональных структурах (150).
Определение опиатов в крови и моче методом газовой хромато-масс-спектрометрии
Определение количества глюкозы исследуемой жидкости производилось энзиматическим колориметрическим методом с депротеинизацией (набор ООО VITAL DIAGNOSTICS SPb). Принцип метода: при окислении P-D-глюкозы кислородом воздуха при каталитическом действии глюкозооксидазы образуется эквимолярное количество перекиси водорода. Под действием пероксидазы перекись водорода окисляет 4-аминоантипирин в присутствии фенола в окрашенное соединение розово-малинового цвета, определяемое спектрофотометрически. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации глюкозы в крови. Данный метод чувствителен, прост, не содержит особо опасных реактивов, специфичен к глюкозе, в отличие от метода с орто-толуидином (канцероген), который определяет не только глюкозу, но и другие альдосахара (44). 2.7. Определение концентрации мочевины и креатинина в крови. Биохимическое определение мочевины и креатинина может оказать существенную помощь для выявления почечной недостаточности при неполном клиническом обследовании, отсутствии клинических данных, признаков поражения почек как основного заболевания или конкурирующего заболевания в пожилом возрасте. Результаты биохимических исследований крови должны сочетаться с клинико-анатомическим синдромом, т.к. повышение концентрации азотистых веществ возможно не только при почечной недостаточности, но и при пневмонии, перитоните, кишечной непроходимости, черепно-мозговой травме. Особенно перспективны эти исследования у детей грудного возраста, у которых картина острой почечной недостаточности бывает нечеткой. Наличие глубоких дистрофических изменений почек и высокие показатели мочевины и креатинина позволяют диагностировать диабетическую кому и азотемическую кому, обусловленную почечной недостаточностью в случаях смерти в коматозном состоянии неясной этиологии (38,39). Нормальные значения мочевины в крови варьируют от 2.5 до 8.3 ммоль/л. Синтез мочевины происходит в печени из аммиака, который образуется при дезаминировании аминокислот, и аспартата при участии СО2 и АТФ (38). Повышение показателя имеет место при почечной недостаточности, при обструкции мочевыводящих путей; при дегидратации (любой этиологии), при уменьшении почечного кровотока. Снижение показателя имеет место при поражении печени, нефрозе, кахексии.
Креатинин представляет собой ангидрид креатина, который содержится в мозге, мышцах, крови. Суточное выделение креатинина с мочой у каждого индивидуума постоянно и пропорционально мышечной массе, норма составляет 0.15-0.22 ммоль/л (38). Повышение показателя имеет место при острой или хронической почечной недостаточности, закупорке мочевыводящих путей и нарушении функции почек, вызванном некоторыми лекарственными препаратами (38). Принцип метода определения мочевины - мочевина образует с диацетилмонооксимом в сильнокислой среде в присутствии тиосемикарбазида и ионов трехвалентного железа красный комплекс. Принцип метода определения креатинина в крови по Яффе. В щелочной среде пикриновая кислота взаимодействует с креатинином с образованием оранжево-красной окраски, которую измеряют фотометрически.
Миоглобин является внутриклеточным белком, локализованным в поперечно-полосатых мышцах. В норме этот белок в крови и в моче отсутствует или встречается в следовых количествах, однако при повреждении мышц миоглобин попадает в кровь и мочу и развивается миоглобинемия и миоглобинурия (38,63).
В судебно-медицинской практике тест на определение повышенной концентрации миоглобина в сыворотке и моче целесообразно проводить при подозрении на инфаркт миокарда, для подтверждения диагноза электротравмы, при синдроме позиционного сдавления, краш-синдроме, токсических поражениях (отравления, укусы змей и т.д.) (47,63,69). Нормальное содержание миоглобина в сыворотке и моче до 80 нг/мл, повышенное содержание - от 160 нг/мл и выше; в трупной крови 6-10 тыс нг/мл (28,63). О содержании миоглобина в перикардиальной жидкости данных в литературе нам не встретилось. Принцип метода - определение миоглобина исследуемом материале производили с применением эритроцитарного диагностикума, который представляет собой лиофилизированную 1% взвесь формалинизированных эритроцитов, сенсибилизированных иммуноглобулинами против миоглобина, в реакции пассивной гемагглютинации (разработан в НПП «Диагностические системы» и РГИСК им. Л.А. Тарасевича).
По уровню глюкозы и гликозилированного гемоглобина возможна посмертная диагностика сахарного диабета, который иногда остается нераспознанным при жизни, а также гипо- и гипергликемической комы (27). Уровень глюкозы крови изменяется в течение суток и зависит от места взятия крови, скорости умирания, приема пищи, что не позволяет диагностировать диабет, как мы упоминали ранее (23). Но повышение глюкозы крови способствует неферментативному гликозилированию белков, которое пропорционально концентрации глюкозы и продолжительности жизни циркулирующих белков. Поскольку среднее время полу-жизни эритроцитов 60 дней, измеряемый гликозилированный гемоглобин отражает лучше, чем просто определение глюкозы, среднюю концентрацию глюкозы в крови и степень нарушения углеводного баланса за два предшествующих месяца (78,86,95,112,132). Содержание гликозилированного гемоглобина в норме составляет 4.2-6.2% от общего гемоглобина (12,28,39,112).
Посмертная экспертиза отравления веществами антихолинэстеразного действия (в частности фосфорорганическими соединениями или ФОС) представляет значительные трудности, т.к. морфологические признаки отравления неспецифичны. Судебно-химические методы определения антихолинэстеразных веществ ограничены малым количеством вещества, вызвавшего смерть, биохимическое определение активности холинэстеразы крови (АХЭ) является наиболее чувствительным, специфичным и быстрым способом выявления отравления веществами антихолинэстеразного действия. Гнилостные изменения крови практически не влияют на АХЭ крови. Кроме диагностики отравлений ФОС, активность холинэстеразы снижается при анемиях, раке, ревматизме, туберкулезе, некоторых инфекционных заболеваниях (59,73), есть данные о снижении АХЭ при отравлении наркотическими веществами группы опиатов (55). При взаимодействии ацетилхолина (АХ) с щелочным раствором гидроксиламина образуется ацетилгидроксамовая кислота, которая в кислом растворе дает цветную реакцию с хлорным железом. Интенсивность окраски зависит от концентрации ацетилхолина. Активность холинэстеразы выражают в мкмоль разрушенного ацетилхолина (норма 1.9-2.6 мкмоль АХ).
Определение активности холинэстеразы в крови методом Хистрина в модификации Эйдельмана
Метод хемилюминесценции (ХЛ) относят к прямым методам изучения свободных радикалов и их реакций. Процесс свободнорадикального окисления модельной системы Нв-ЛМ-Н2О2 сопровождается испусканием квантов света хемилюминесценции. Зависимость интенсивности ХЛ от времени называют кинетикой ХЛ. Основными параметрами кинетики ХЛ являются: величина латентного периода (время от момента индукции СРО до начала развития свечения), светосумма (площадь под хемилюминесцентной кривой за время t), максимальная интенсивность ХЛ. При взаимодействии с активными формами кислорода (АФК) люминол подвергается свободнорадикальному окислению (СРО), в ходе которого испускаются кванты ХЛ(11). Сравнение организованных пользователем групп данных проведено с использованием статистических непараметрических критериев, не зависящих от характера распределения – точного метода Фишера и критерия Хи-квадрат (параллельно вычислялся также используемый в биомедицинских исследованиях Т-критерий Стьюдента для нормального распределения переменных). Также вычислялись диагностические коэффициенты для табличной диагностики и список информативных признаков, упорядоченных по убыванию информативности. Первые два критерия непосредственно применимы для сравнения дискретных переменных (обозначающих, например, наличие или отсутствие какого либо признака или степени выраженности какого-либо нарушения), причем, точный метод Фишера может применяться даже тогда, когда какое-либо значение признака встречается очень редко (вплоть до нуля раз). При проведении попарного сравнения групп объектов (реализаций) определяли достоверность различия между всеми признаками. При этом использовались следующие уровни значимости различий: p 0.05; p 0.01; p 0.001. После сравнения групп по каждому признаку в отдельности, оценивалась информативность полного признакового пространства для различия всех заданных пользователем групп. Для получения такой оценки проводился экзамен (или скользящий экзамен) правильности автоматического отнесения каждой реализации к одной из сравниваемых групп с помощью последовательной байесовской процедуры распознавания. Высокие результаты экзамена (высокий процент отнесения реализаций к своей группе) позволяет сделать вывод о высокой информативности признакового пространства для различия заданных групп. При необходимости полученные в результате проведенного анализа частоты появления отдельных информативных градаций (значений) признаков в различных группах могут быть использованы для создания алгоритма диагностики или прогнозирования (18).
Все образцы трупного материала были исследованы методом тонкослойной хроматографии, газовой хромато-масс-спектрометрии и методом иммуноферментного анализа. Образцы трупного материала, содержащие опиаты и не содержащие опиаты, хранили при температуре +18-200 С и при температуре +40 С в течение 6 месяцев (26 недель), проводя определение опиатов методом иммуноферментного анализа через 1 неделю, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 20, 24, 26 недель. На рисунке 6 представлены результаты исследований методом иммуноферментного анализа на предмет выявления опиатов в трупном материале. Рис.6. Случаи обнаружение опиатов в исследуемом материале. Наркотические вещества группы опиатов были выявлены в 46% случаев, соответственно, в 54% случаев опиаты обнаружены не были. Данные, представленные на рисунке 7, отражают обнаружение опиатов в крови и моче. На следующих рисунках приведены сведения о наркотических веществах других групп, обнаруженных при химических исследованиях объектов.
Среди взятых в исследование 334 объектов в 41% случаев не было обнаружено наркотических веществ, в 43% случаев были обнаружены опиаты. 3% составили случаем обнаружения опиатов вкупе с другими наркотическими веществами, в 13% случаев было обнаружено другое наркотическое вещество. На следующем рисунке показано, какие именно другие наркотики обнаружены в 13% случаев. Преобладающее большинство случаев осталось за метадоном. На втором месте находятся барбитураты, наименьшем количестве случаев выявлен кокаин. В таблице представлены данные по сравнению результатов, полученных методом ИФС и ГХ-МС с результатами, полученными методом тонкослойной хроматографии. В таблице №1 и №2 приложения 1 представлены данные по определению наличия опиатов в трупной крови и моче на примере 60 объектов (30 объектов кровь и 30 - моча) (см. приложение 1). В таблице №5 представлены средние значения концентраций наркотических веществ группы опиатов, полученные методом ГХ-МС и значения оптической плотности, полученной методом ИФА, по сравнению с результатами, полученными методом ТСХ. Таблица №5. Средние значения концентраций опиатов в крови и моче. Метод отрицательные по ТСХ положительные по ТСХ ГХ-МС 0±0 (нг/мл) 574.77±201.15 (нг/мл) р 0.001 ИФА 0±0 (нг/мл) 2.93±0.03 (А х 100, соотв 300 нг/мл) р 0.001 Таким образом, метод иммуноферментного анализа сопоставим с методом тонкослойной хроматографии и методом газовой хромато-масс-спектрометрии. Рис. 13. Сравнение результатов ИФА с ТСХ и ГХ-МС. Сравнение результатов ИФА с ТСХ и ГХ-МС (334 объекта) положительные результаты отрицательные результаты не совпали с ТСХ и ГХ-МС 44%(149) 3%(10) 53%(175) Поскольку метод ИФА позволяет определять пикограммовые количества веществ, допустимым является вариант выявления минимальных количеств опиатов в объекте исследования, которые не могут быть обнаружены стандартными методами за счет более низкой чувствительности. В 3% случаев результаты, полученные методом ИФА, не совпали с данными тонкослойной хроматографии и газовой хроматомасс-спектрометрии. Сомнительные случаи рассмотрены на рис.14. ГХ-МС; Положительные результаты, в которых обнаружены опиаты в концентрации менее 150 нг/мл, можно объяснить более высокой чувствительностью метода ИФА. Результаты, соответствующие концентрации наркотических веществ группы опиатов от 150 до 300 нг/мл и более 300 нг/мл можно объяснить специфичностью диагностикума на опиаты, используемого в данной работе. 3.2. Определение опиатов методом иммуноферментного анализа при гнилостной трансформации трупного материала в течение 6 недель. На первом этапе работы было проведено исследование 187 образцов трупного материала (из них 45 образцов мочи) с целью обнаружения опиатов методом иммуноферментного анализа (рис.2), что описано нами ранее (24).
Определение опиатов методом иммуноферментного анализа при гнилостной трансформации трупного материала в течение 6 недель
Средние значения оптической плотности в группе объектов, отрицательной на опиаты колебались в диапазоне от 38.61±1.40 до 47.08±1.25, что соответствует отсутствию веществ группы опиатов в образцах трупного материала. Средние значения оптической плотности в группе объектов, положительной на опиаты, находились в диапазоне от 0.48±0.09 до 0.84±0.11. Данные по исследованию содержащих (на примере 25 объектов) и не содержащих опиаты образцов при хранении при температуре +18-200 С и +40 С представлены в таблицах №3,4,5,6 приложения 1. Термином «якорь» обозначен отрицательный контроль, представляющий собой 50 мкл буфера №1 и 50 мкл специфических антиморфиновых антител, меченных пероксидазой хрена. Стандарт представляет собой раствор морфина в дистиллированной воде в конечной концентрации 6 нг/мл. Обязательным является исследование контрольной мочи (модельная система, в которой заведомо отсутствуют опиаты). Эти параметры готовились и исследовались в каждом эксперименте.
Значения ОП исследуемых объектов необходимо сравнивать со значениями ОП указанных параметров ИФА для правильной оценки полученных результатов. Учет результатов производится спектрофотометрически при длине волны 492 нм. Реакцию считают положительной, если оптическая плотность исследуемого образца равна или ниже ОП стандартного раствора, рекомендованного для набора, что соответствует содержанию веществ группы опиатов в опытном образце не менее 300 нг/мл. Результаты, представленные в таблицах №3-6 (см. приложение 1), были подвергнуты статистической обработке. Согласно статистическим критериям, оптическая плотность образцов достоверно отличалась (р 0.001) от ОП отрицательного контроля и ОП контрольной мочи на протяжении 26 недель, при этом, оптическая плотность каждого образца достоверно не отличалась от каждого последующего значения оптической того же образца (р 0.001). На рис. 20 представлена динамика значений оптической плотности трех выборочно взятых образцов, положительных на опиаты, измеренной методом иммуноферментного анализа, в динамике (в течение 26 недель) при хранении образцов в условиях температуры +18-200 С. Рис. 20. Динамика оптической плотности 3-х положительных на опиаты образцов при температуре хранения +18-20 С.
Кривые, помеченные ромбом и треугольником, отображают динамику значений ОП отрицательного контроля и контрольной мочи, видно, что значений их достоверно не отличаются друг от друга, что дает возможность сделать заключение о правильности заключений, касающихся наличия наркотических веществ в исследуемых образцах. Очевидным является факт наличия опиатов в указанных образцах трупного материала. К моча 2 4 6 8 10 Как видно из графика, значения ОП якоря и контрольной мочи достоверно не отличаются, значения ОП стандарта достоверно отличаются от ОП якоря и контрольной мочи. Значения ОП опытных образцов достоверно отличаются от значений ОП стандарта и достоверно не отличаются от значений ОП якоря и контрольной мочи, что свидетельствует об отсутствии наркотических веществ группы опиатов в объектах. Оптическая плотность образцов достоверно отличается от оптической плотности стандартного раствора, несмотря на достоверные отличия от оптической плотности отрицательного контроля и образца контрольной мочи. На рисунке 25 представлены данные по изменению оптической плотности «отрицательных» образцов №4-10 в динамике при хранении в условиях температуры +18-20 С. Вызывает сомнения оптическая плотность образца №5. Рис.25. Динамика оптической плотности «отрицательных» образцов №4-10.
В условиях комнатной температуры особенно отчетливо проявляется бактериальный пророст образцов трупного материала. Несмотря на это, большинство образцов показало стабильность в отношении значений оптической плотности, указывающей на отсутствие опиатов. Однако, некоторые образцы, в частности, №5, вызывает сомнения. На следующем рисунке 26 представлена А образца №5 в динамике.
Изменение оптической плотности образца №5. ОП №5 начала снижаться, начиная с 1 недели измерения, затем повышалась незначительно, на 8 неделе ОП образца равнялось ОП стандарта, что привело бы к даче ложноположительного результата. Затем, начиная с 8 недели, ОП образца начала повышаться, и осталась на одном уровне с 16 по 26 неделю.
Для того, чтобы определить характер изменения оптической плотности образцов была проведена статистическая обработка разностей А по отношению к 1 дню измерения. Результаты представлены в таблице №13 в виде М+м с указанием достоверности изменений.
Оптическая плотность отрицательных на опиаты образцов на 1 неделе хранения достоверно уменьшилась по отношению к А от 1 дня измерения. Далее А начала увеличиваться. На 26 неделе А достоверно не отличалась от А исходной. Сходная динамика наблюдалась в отношении положительных на опиаты образцов. В ходе исследования было показано, что температурный фактор достоверно не влияет на изменения оптической плотности образцов в обеих группах.
Как было упомянуто выше, оптическая плотность образцов, полученная при проведении ИФА через 1 неделю хранения образцов, снизилась как в группе, отрицательной на опиаты, так и в группе, положительной на опиаты. Через 2 недели хранения отрицательных образцов ОП достоверно увеличилась по сравнению с ОП на 1 неделе. Через 4 недели хранения ОП отрицательных образцов начала уменьшаться, снижение происходило на 6 и 8 неделе хранения. Начиная с 12 недели, ОП увеличивалась. Оптическая плотность образцов при проведении ИФА значительно выросла на 24 неделе хранения и практически не изменилась на 26 неделе хранения образцов.
В группе, отрицательной на опиаты, оптическая плотность уменьшилась на 1 неделе хранения, увеличивалась вплоть до 4 недели хранения, затем начала снижаться (6 недель). На 8 неделе опять наблюдалось незначительное возрастание ОП. Начиная с 12 недели – снижение оптической плотности. На 20 неделе замечено увеличение ОП, на 24 снижение. Оптическая плотность, полученная при ИФА через 26 недель хранения, практически не отличалась от ОП на 24 неделе. Многофакторный анализ с применением скользящего экзамена по Байесу показал, что выявление наркотических веществ группы опиатов возможно в трупном материале при хранении объектов, как при комнатной температуре, так и в условиях бытового холодильника возможно в 100% случаев.
Теоретически была выведена формула для количественного определения наркотических веществ группы опиатов в исследуемом материале. Наличие опиатов в диагностически значимой концентрации 300 нг/мл устанавливают по значению оптической плотности (А), если Аив в диапазоне Аположительный крАив 0.
Пример 2. Исследовали мочу от трупа, предположительно употреблявшего наркотические средства. Мочу развели в 50 раз (980 мкл раствора 2 + 20 мкл крови. При измерении А в лунке, содержащей отрицательный контроль получен результат 0.76; 0.77 (на каждый образец 2 лунки), А в лунке с положительным контролем (морфин 6 нг/мл) = 0.04;0.05; А в лунке, содержащей разведенный опытный образец составила 0,72; 0,74. По значению оптической плотности в опытном образце можно сделать заключение об отсутствии наркотических веществ группы опиатов в исследуемом образце.
