Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Патоморфологические критерии диагностики смерти от гипотермии (обзор литературы) 11
Глава 2. Материал и методы исследования 37
Глава 3. Результаты собственных исследовании 55
3.1. Изучение патоморфологической картины «пятен Вишневского».. 55
3.2. Определение «тканевого стандарта» плоидности в гистологических среза слизистой оболочки желудка 57
3.3. Определение плоидности ядер клеток слизистой оболочки желудка в исследуемых группах наблюдений 60
3.4. Определение площади ядер клеток слизистой оболочки желудка в исследуемых группах наблюдений 74
3.5. Изучение «плоидометрического профиля» ядер клеток слизистой оболочки желудка в исследуемых группах наблюдений 76
3.6. Изучение пролиферативной активности клеток слизистой оболочки желудка в исследуемых группах наблюдений 81
Заключение 85
Выводы 87
Практические рекомендации 89
Список литературы 90 — 110.
- Определение «тканевого стандарта» плоидности в гистологических среза слизистой оболочки желудка
- Определение плоидности ядер клеток слизистой оболочки желудка в исследуемых группах наблюдений
- Изучение «плоидометрического профиля» ядер клеток слизистой оболочки желудка в исследуемых группах наблюдений
- Изучение пролиферативной активности клеток слизистой оболочки желудка в исследуемых группах наблюдений
Определение «тканевого стандарта» плоидности в гистологических среза слизистой оболочки желудка
В легких патоморфологические изменения при развитии смертельной гипотермии, выявила A.M. Смыслова (1909) при микроскопическом исследовании. Они заключались в изменениях эндотелия капилляров, обесцвечивания эритроцитов, склеивании их, образовании зернистых масс, набухании, отслойке и вакуолизации легочных альвеол. Автор наблюдал также изменение ядер и протоплазмы мышечных оболочек сосудов и газовые пузырьки в капиллярах, а пристеночные - и в более крупных сосудах.
Судебные медики осторожно отнеслись к признаку А.М. Смысловой. Из авторов учебников о нём упоминает только Д.П. Косоротов (1931).
Оптически прозрачные пустоты обнаружены С.А. Тумасовым (1974) в 28 % наблюдений при смертельной гипотермии, однако встречались они и при других причинах смерти, в частности, в случаях утопления. BJT. Науменко и Н.А. Митяева (1980) встречали пузырьки воздуха в капиллярах и пенистую кровь в легких при посмертном оледенении тканей. При исследовании легких В.П. Десятое (1970), К. Glowicki et М. Ryba (1983) кроме резкого полнокровия сосудов описывали признаки распространенного бронхоспазма, клетки эпителия которых большей частью набухшие, ядра их крупные. По сведениям Г.Н. Клинцевич (1973) легкие полнокровны, с субплевральными кровоизлияниями. У пятой части пострадавших автор наблюдал отёк легких, реже (9%) — пневмонии. Ателектазы и острая эмфизема легких встречались реже.
С.А. Тумасов (1974), D. Ross (1956) при исследовании лиц, погибших от гипотермии, в легких отмечали полнокровие, очаговую ярко-красную окраску на разрезе, светло-красную окраску трахеи и бронхов, пенистую слизь в просвете бронхов. При микроскопическом исследовании легких наблюдали ателектаз со значительными участками эмфиземы, резкое полнокровие посткапиллярной системы. Отмечается распространенный бронхоспазм, выраженное набухание эпителия бронхов. Отёк легких С.А. Тумасов наблюдал в 28,3%, субплевральные кровоизлияния — в 21% случаев.
Различного рода структурные изменения в легких погибших описали и другие авторы (Н.К. Козырева, 1959; Н.В. Коростовцева и В.Н. Фадеева, 1961; А.Г. Миланов с соавт., 1984; А. Моммадов, 1984; J. Georgieff et al., 1966.). Однако эти данные были получены при искусственной гипотермии на экспериментальных животных.
В.А. Осьминкин (1988, 1994) в результате проведенных исследований легких у погибших от гипотермии выявил комплекс характерных патомор-фологических признаков», свидетельствующий об адаптивной перестройке этого органа в случаях действия холода на организм. Этот комплекс включает: тотальный бронхоспазм с ущемлением волокнистой соединительной ткани и сосудов, утолщение эпителиального пласта, депонирование слизистого секрета в бокаловидных клетках, формирование «фигур колосьев», диффузную эмфизему, содружественный ангиоспазм артерий и вен большого и малого круга кровообращения на фоне полнокровия легочной паренхимы.
В печени патоморфологические изменения проявляются сразу же после наступления тканевой гипотермии. При продолжительном действии холода в течение шести часов просвет артерий и вен печени суживается и переполняется кровью (Ю.Г. Никитченко с соавт. 1989).
В печени, по мнению Б.А. Аптэра (1964), J.Tokunaga et al. (1983) при смертельной гипотермии наиболее выражены застойные явления в сосудах, а также нарушения жирового и углеводного обмена.
А.Ю. Чудаков (2000) при гистологическом исследовании печени описывал полнокровие центральных вен, внутридольковых капилляров, меж-дольковых вен. Автор также наблюдал расширение междольковых артерий, расширение перикапиллярных пространств по периферии долек, диссемини-рованные некрозы и пролиферативно - дистрофические изменения, лейкоцитарные стазы, периваскулярные инфильтраты.
Проведенные экспериментальные исследования (АЛО. Чудаков, В.Д. Исаков, Ю.Г. Доронин, 1999; Т. Higashizawa, К. Kawata, Т. Izumi, Y. Koda, 1997) подтвердили при действии холода существенные изменения в гепато цитах и печени в целом. Отмечены различной степени выраженности и распространенности дистрофические изменения гепатоцитов, вплоть до развития единичных некрозов.
М.Д. Шмерлинг и Е.Е. Филюшина (1993) наблюдали в печени чаще всего зернистую дистрофию гепатоцитов на фоне распшрения пространств Диссе и распшрения синусоидов, а также гиалиново-капельную дистрофию с образованием ацидофильных клеток в результате их сморщивания.
Подобные структурные изменения в печени указывают на нарушение белкового обмена и снижение функции гепатоцитов при повреждающем действии холода на организм.
Со стороны мочеполовой системы многочисленные исследования смертельной гипотермии подтверждают нарушения кровообращения в почках в виде резкого полнокровия сосудов, более выраженного на уровне капиллярного звена, выявляемого как в корковом, так и мозговом слоях почки.
Н. Kilian (1946), Е. Fischer с соавторами (1957) в результате собственных исследований находили в почках очаговые необратимые изменения (склероз клубочков) после глубокой гипотермии в отдаленные сроки эксперимента.
М.И. Касьянов (1954) в прямых канальцах почек и канальцах яичек обнаружил своеобразные пролиферативно-дистрофические изменения эпителия. Клетки канальцев принимают уродливую форму ядра и увеличиваются в числе, изменяя свою форму из округлой или овальной на продолговатую или веретенообразную. Наряду с этим были обнаружены очаговые некротические изменения эпителиальных клеток.
Л.И. Громов и Н.А. Митяева (1958) подтвердили изыскания М.И. Касьянова о пролиферативно-дистрофических изменениях в прямых канальцев почек и канальцах яичек. Ядра у большинства клеток прямых канальцев почек в 50% случаев вытягиваются и увеличиваются в числе (A. Parentela, P.Carania, С. Marchegiani, S. Messinetti, 1961).
Определение плоидности ядер клеток слизистой оболочки желудка в исследуемых группах наблюдений
В зависимости от действия на организм комплекса способствующих смерти факторов (температура окружающей среды, состояние одежды, возраст, концентрация алкоголя в крови и моче, условия, в которых он находился) исследуемые наблюдения смертельной гипотермии подразделены на 2 группы: 1 группа - с «быстрым» темпом переохлаждения (35 наблюдений); 2 группа - с «медленным» темпом переохлаждения (20 наблюдений). Группу сравнения составил аутопсийный материал неизмененной слизистой оболочки желудка 5 трупов лиц, причиной смерти которых явилось колото-резаные ранения (2 наблюдения), механическая асфиксия (1 наблюдение), острое отравление этиловым алкоголем (1 наблюдение) и алкогольная кардиомиопатия (1 наблюдение).
В качестве контроля послужил биопсийный материал неизмененной слизистой оболочки желудка 10 живых лиц в возрасте от 17 до 20 лет, проходившие призывной медицинский осмотр в 2005 году в Медсанчасти № 1 АМО ЗИЛ г. Москва.
Лабораторная подготовка гистологического материала. Кусочки слизистой оболочки желудка фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина при комнатной температуре.
Для гистологического и плоидометрического исследования вырезались кусочки размерами 10 мм 15 мм. После вырезки биоматериал проходил следующие этапы подготовки: спиртовая проводка, парафиновая заливка, порезка на микротоме и окрашивание.
Спиртовая проводка материала проводилась с целью обезвоживания и инфильтрации кусочков парафином с помощью автоматизированного вакуумного тканевого процессора ТР — 1050 (Leica, Германия). Биоматериал в строго определенной последовательности подвергался действию этилового спирта 70, 96 и 100 крепости, смеси этилового спирта с хлороформом (1:1), двух порций чистого хлороформа, смеси хлороформа с парафином (1:1) и трёх порций чистого парафина. Процесс проводки в автоматизированном аппарате происходил в условиях воздействия вакуума и давления при температуре в реторте от 40С до 60С Длительность спиртовой проводки в данном аппарате не превышала 4-5 часов.
После извлечения гистологических объектов слизистой оболочки желудка из автоматического процессора производили заливку их высокомолекулярным парафином (Hystovax, Германия) в заливочные ванночки размерами 24 х 24 х 5 мм на аппарате Гистоэмбеддер / Leica 1160.
Следующий этап подготовки гистологических микропрепаратов - это резание парафиновых блоков на санном микротоме Leica SM2000 R. Толщина срезов для обзорного патогистологического исследования не превышала 5 мкм, для плоидометрического исследования — 8 мкм.
Главным требованием к плоидометрическому исследованию является сохранение стандартной толщины и окраски изучаемых срезов, с последующим получением относительных показателей. Эти требования лежат в основе сравнительной микроспектрофотометрии по Г.Г. Автандилову (1984).
Готовые срезы наклеивали на предметные стекла, покрытые тонким слоем яичного белка. Толщина предметного стекла 0,8 мм. Дня одного метода окраски с каждого кусочка изготовляли не менее 3 срезов, наклеенных на 1 предметное стекло.
С целью изучения общепатологических процессов срезы слизистой оболочки желудка окрашивали универсальной апробированной методикой гематоксилином и эозином. Окрашивание срезов производилась на автоматическом аппарате для гистологической обработки тканей А Т— 4ММ.
Для плоидометрического исследования клеток слизистой оболочки желудка применялась окраска срезов по модифицированному методу Фёльгена (без применения окраски фона). В результате данного метода окрашивания выявляются группы молекул - хромофоров, которые в результате ряда превращений ковалентно связываются с одной молекулой ДНК.
С целью сравнения полученных результатов для возможного последующего использования в компьютерной плоидометрии широко распространенных методов окрашивания в практической работе судебного патогистоло-га, плоидометрическое исследование слизистой оболочки желудка проводили на гистологических срезах, окрашенных гематоксилином и эозином
Изучение «плоидометрического профиля» ядер клеток слизистой оболочки желудка в исследуемых группах наблюдений
При проведении плоидометрического исследования клеток слизистой оболочки желудка в поверхностном, среднем и базальном слоях (по 3 поля зрения в каждом слое) выбирали наиболее типичные участки с нормальным и патологически измененным строением клеток различных структурных элементов ткани.
Таким образом, в общей сложности изучено 11918 ядер клеток слизистой оболочки желудка, окрашенных по модифицированной методике Фёль-гена, и 4042 ядра клеток, окрашенных гематоксилином и эозином во всех исследуемых группах наблюдений.
При проведении общей оценки плоидности ядер достаточной выборки клеток во всех группах наблюдений средний арифметический показатель содержания ДНК (5Ц) оказался одинаковым, и не превышал уровня 2,5с. Эти данные показывают, что отобранный для плоидометрического исследования материал слизистой оболочки желудка не подвергнут ряду хронических и опухолевых заболеваний, при которых показатели содержания ДНК превышают пределы нормальных значений вследствие высокой пролиферативной активности клеток и нарушений процессов митотического деления.
При морфолого-статистического анализе плоидности ядер использовали взвешенной средней арифметической показатель (5И«ш) содержания ДНК в ядрах.
В группе контроля плоидометрическому измерению подвергли 717 ядер клеток слизистой оболочки желудка по 90 полям зрения, окрашенных по методике Фёльгена. Анализ результатов плоидометрических измерений клеток неизмененной слизистой оболочки желудка показал, что средневзвешенный показатель плоидности каждого ядра в клеточной популяции равен 2,36с ± 0,001, который соответствует физиологическому уровню содержания ДНК в ядре клетки.
Пример плоидометрыческого исследования клеток слизистой оболочки желудка в контрольной группе наблюдений. Окраска по Фёльгену. На рисунке 8 изображен пример плоидометрического исследования ядер клеток слизистой оболочки желудка, окрашенного по методике Фёльгена (без фоновой окраски) в группе контроля.
В исследуемом поле зрения видно, что клеточный состав представлен в основном ядрами парадиплоидных клеток в количестве 39 единиц, окрашенные на рисунке в синий цвет, и 27 ядрами паратриплоидных клеток, окрашенные зелёным цветом. Средневзвешенное значение плоидности каждого ядра представленных в этом поле зрения составило 2,36с. Данные статистической обработки (М, Мех, т, а) полученных показателей исследования представленного поля зрения представлены на рисунке в таблице.
В группе сравнения в результате проведения количественных измерений 1571 ядра клеток слизистой оболочки желудка, окрашенных по методике Фёльгена, получен средневзвешенный показатель плоидности каждого ядра несколько выше по сравнению с предыдущим результатом в группе контроля, и составил 2,41с ±0,001.
На рисунке 9 видно, что в клеточном составе исследуемого поля зрения преобладают клетки с парадиплоидными (2с) и паратриплоидными (Зс) ядрами, которые и определили уровень плоидности клеток всей группы сравнения.
Результаты проведенного плоидометрического анализа ядер клеток слизистой оболочки желудка в группах контроля и сравнения представлены в сводной таблице 4.
Данные плоидометрического измерения ядер клеток слизистой оболочки желудка, окрашенных по второй методике - гематоксилином и эозином - в группе контроля оказались следующими: всего исследовано 882 ядра, средневзвешенный показатель плоидности оказался несколько выше, чем при окрашивании по методике Фёльгена — 2,42с ± 0,003.
В группе сравнения измерению подвергли 822 ядра клеток слизистой оболочки желудка в препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином. При этом среднее значение средневзвешенного показателя плоидности каждого ядра клетки не превышает 2,45с ± 0,003.
Дальнейшее использование плоидометрического метода исследования клеток слизистой оболочки желудка было проведено в основных группах наблюдений смертельного исхода от гипотермии.
Иг. рисунке 10 представлен типичный очаг незначительной пролиферации эпителиальных клеток в среднем слое слизистой оболочки желудка, окрашенного по методике Фёльгена (без фоновой докраски).
Ядра эпителиальных клеток несколько увеличены в размере, отмечается неравномерно интенсивно окрашивание ДНК, что свидетельствует о синтезе ДНК в них. Также отмечается небольшая инфильтрация единичными лимфоцитами. При послойном исследовании гистологического среза по 9 последовательным полям зрения подобных очагов пролиферации эпителиоци-тов обнаруживалось в количестве всего до трёх-четырёх. Далее на тех же участках гистологического среза проведена плоидометрия ядер клеток с помощью компьютерного анализатора изображения.
Пример проведенного плоидометрического исследования типичных участков активации пролиферации клеток в слизистой оболочке желудка в группе с коротким периодом умирания от действия низкой температуры представлен на рисунке 11. Очаговая пролиферация клеток слизистой оболочки желудка в группе наблюдений с «быстрым» темпом переохлаждения. Окраска по Фёльгену. У в. 400.
В результате определения содержания ДНК в ядрах 3200 клеток слизистой оболочки желудка, окрашенных по методике Фёльгена, в группе наблюдений с «быстрым» темпом развития переохлаждения получен средневзвешенный показатель плоидности одного ядра, равный значению 2,35с ± 0,001. Этот показатель фактически не отличается от результатов измерений исследованной популяции клеток желудка в контрольной группе.
Изучение пролиферативной активности клеток слизистой оболочки желудка в исследуемых группах наблюдений
В случаях смертельной гипотермии в основных группах наблюдений видимы различия между показателями ПА клеточных популяций слизистой оболочки желудка, изменения которых зависят от продолжительности действия на организм холодового фактора. Так, при быстром наступлении смерти в условиях температуры окружающей среды от минус 20С до минус 45 С и наличия других предрасполагающих факторов (средняя и тяжелая степень опь -83 янения, увлажнение поверхности тела, физическое переутомление организма) функциональная активность клеток сохраняется на физиологическом уровне характерном для неизмененной слизистой оболочки желудка. Иная картина представляется в другой основной группе наблюдений — с «медленным» темпом развития гипотермии. При длительном и интенсивном холодовом воздействии на организм человека более 4-х часов в слизистой оболочке желудка регистрируется усиленная активация пролиферативных процессов в области сформированных «пятен Вишневского», проявляющиеся в увеличении содержания ДНК внутри ядер без изменения общего количества клеток. Этот факт при проведении количественного анализа отображается на возрастании уровня показателя ПА клеток до 0,7 , полученного при изучении препаратов, окрашенных по методике Фёльгена и до уровня 0,74 — при изучении препаратов, окрашенных гематоксилином и эозином.
Сравнили показатели ПА клеточных популяций слизистой оболочки желудка, полученных при плоидометрическом исследовании гистологического материала всех исследуемых групп наблюдений, окрашенных по двум методикам: гематоксилином с эозином и по Фёльгену (рисунок 18).
Анализ полученных данных показал, что вероятность возникновения отклонения полученных значений показателей при плоидометрическом исследовании материала, окрашенного гематоксилином с эозином, может достичь 12 % среднего арифметического показателя, полученного при окраске по методике Фёльгена.
Судебно-медицинская диагностика смертельной гипотермии основывается на комплексной оценке патоморфологических изменений, выявленных в результате секционного исследования с учётом известных сведений об обстоятельствах и особенностях её наступления, гистологических, биохимических и результатов других дополнительных методов исследований.
Настоящее исследование благодаря использованию современной методики количественного анализа позволяет решать спорные вопросы, связанные с развитием ответной реакции организма человека на повреждающее действие физических факторов внешней среды.
В ходе выполнения исследования, целью которого явилось изучение изменений пролиферативной активности клеток слизистой оболочки желудка в случаях смерти от гипотермии были определены критерии оценки темпа развития гипотермического состояния организма.
В результате впервые использованного нами в судебно-медицинской практике метода компьютерной плоидометрии — новейшей технологии гис-тоцитологической диагностики с количественным анализом выявляемых патологических изменений в клетках, изучены изменения морфофункциональ-ного состояния слизистой оболочки желудка при действии на организм низкой природной температуры.
С помощью этого метода получена возможность визуально оценивать по гистологическим препаратам вариабельность качественной и количественной характеристик клеточного состава слизистой оболочки желудка по плоидности их ядер, как в нормальном морфофункциональном состоянии, так и при различных видах смерти (смертельная гипотермия, механическая травма, механическая асфиксия, отравление этиловым алкоголем и сердечнососудистые заболевания). Также этот метод позволяет уточнять темп наступления смерти в условиях действия экстремального холода на организм.
В результате плоидометрического исследования ядер клеток слизистой оболочки желудка определены пределы возможных колебаний показателей физиологической регенерации ткани по значению средневзвешенной плоид-ности клеточных популяций, лежащей в интервале от 2,35с до 2,7с.
Анализ количественного содержания генетического материала (ДНК) в ядрах клеток ядер слизистой оболочки желудка установил зависимость активности пролиферативных процессов, как эквивалента функционально -приспособительной (адаптационной) реакции, от продолжительности повреждающего действия холодового фактора на организм.
В условиях смертельного действия холода на организм человека в слизистой оболочке желудка изменение «плоидометрического профиля» клеточных популяций проявляется появлением крупных полиплоидных клеток с увеличенным набором генетического материала (ДЬЖ), свидетельствующее об интенсификации обменных, метаболических и пролиферативных процессов в клетках и тканях. Эти явления продолжаются до истощения энергетических ресурсов организма и наступления биологической смерти.
Таким образом, с помощью компьютерной плоидометрии ядер клеток выявлено, что при развитии гипотермического состояния в слизистой оболочке желудка явления физиологической пролиферации клеток прекращаются незамедлительно при быстром развитии процесса переохлаждения организма и заметно возрастают при продолжительном действии отрицательной температуры окружающей среды.
Установленные дифференциально-диагностические критерии активации процессов физиологической пролиферации клеток в слизистой оболочке желудка могут применяться при решении ряда вопросов, поставленных правоохранительными органами перед судебно-медицинским экспертом, связанных с определением сроков наступления смерти погибшего и возможности совершения им тех или иных активных действий в период развития гипотермического состояния.
![Клинико-патогенетическое значение исследования продукции оксида азота и эндотелиальной функции у женщин с угрозой преждевременных родов [Электронный ресурс]](/i/i/4259/178869.png "Клинико-патогенетическое значение исследования продукции оксида азота и эндотелиальной функции у женщин с угрозой преждевременных родов [Электронный ресурс] Воробьева Юлия Сергеевна")
