Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Роль клеток иммунной системы в развитии воспаления 13
Глава 2. Нарушение функции иммунокомпетентных клеток при воспалительных ревматических заболеваниях 29
Глава 3. Характеристика изучаемых ферментов 56
3.1 Биологическая роль 5-нуклеотидазы 56
3.2 Исследование сукцинатдегидрогеназы в медицине и биологии 67
3.3 Биологическая роль na+,k+-3abhchmoh аденозинтрифосфатазы 77
3.4 Миелопероксидаза: физико-химические свойства, распространение в природе, биологическая роль 90
Глава 4. Материалы и методы исследования 109
4.1 гистохимические методы 109
4.1.1 Метод выявления 5-нуклеотидазы при помощи солей металлов... 109
4.1.2. Метод определения активности сукцинатдегидрогеназы 110
4.1.3 Метод выявления Ма+,К+-зависимой аденозинтрифосфатазы 111
4.1.4 Метод выявления миелопероксидазы 112
4.2. Иммунологические методы 114
4.2.1 Определение антител к нативной ДНК 115
4.2.2 Определение антител к коллагену 115
4.2.3 Определение антител к нативной 5'нуклеотидазе 116
4.3 Общеклинические и лабораторные исследования 117
4.4 Статистическая обработка полученных данных 118
Глава 5. Клиническая характеристика больных 120
5.1. Больные ревматоидным артритом 120
5.2. Больные системной красной волчанкой 122
5.3. Больные системной склеродермией 123
5.4. Больные анкилозирующим спондилоартритом 125
5.5. Больные реактивными артритами 126
5.6. Здоровые лица 127
ГЛАВА 6. Содержание энзимов в клетках периферической крови у здоровых лиц и больных ревматическими заболеваниями 128
6.1 Здоровые лица 128
6.2 Больные ревматоидным артритом 129
6.3 Больные системной красной волчанкой 146
6.4 Больные системной склеродермией 156
6.5 Больные с болезнью бехтерева 170
6.6 Больные реактивными артритами 179
ГЛАВА 7. Определение активности внутриклеточных энзимов в клетках периферической крови как тест, способствующий дифференциальной диагностике ревматических заболевании .191
Глава 8. Прогнозирование иммунологических сдвигов при воспалительных ревматических заболеваниях путем определения внутриклеточных энзимов 196
8.1 Взаимосвязь между гистохимическими и иммунологическими показателями при РА 197
8.2 Взаимосвязь между гистохимическими и иммунологическими показателями при СКВ 202
8.3 Взаимосвязь между гистохимическими и иммунологическими показателями при ССД 203
Глава 9. Антителогенез к ферментам как вероятная причина снижения их активности при воспалительных ревматических заболеваниях 206
9.1 Распространенность антител к 5 нуклеотидазе при воспалительных ревматических заболеваниях 206
9.2 Взаимосвязь между уровнем аутоантител и снижением активности 5'нуклеотидазы при РА 208
Обсуждение полученных результатов 209
Выводы. 232
Практические рекомендации 236
Литература 237
Приложение 309
- Биологическая роль na+,k+-3abhchmoh аденозинтрифосфатазы
- Метод выявления Ма+,К+-зависимой аденозинтрифосфатазы
- Больные системной склеродермией
- Взаимосвязь между гистохимическими и иммунологическими показателями при РА
Введение к работе
Ревматические заболевания в последние годы привлекают все большее внимание ученых в силу своей высокой распространенности и социальной значимости. Поражая преимущественно лиц трудоспособного возраста, они приводят к ранней инвалидизации, имеют тенденцию к прогрессированию, значительно укорачивают продолжительность жизни. Количество зарегистрированных по обращаемости больных с БКМС в 1998 году достигло 11835,1 тыс. человек, увеличившись за 10 лет более чем на 42%. Первичная заболеваемость всеми РЗ составила 25,7 на 1000 для общероссийской популяции, в том числе 37,98 на 1000 для взрослых и подростков. Только больных РА по РФ регистрируется ежегодно около 300 тысяч, а болезненность по этому заболеванию по данным статистики составляет 2,75 на 1000 лиц 18 лет и старше (138). Трудовые потери общества, связанные с БКМС, постоянно возрастают. Среди всех причин временной нетрудоспособности по России БКМС занимают 2-е место в случаях и 3-е — в днях (139). РЗ ежегодно приводят к потере более 65 млн. трудовых дней (138). Системные варианты характеризуются высокой летальностью. Они требуют квалифицированного и дорогостоящего лечения, чаще всего пожизненного (157).
За последние десятилетия в борьбе с РЗ были достигнуты определенные успехи: улучшилась их первичная диагностика, внедрены в практику и продолжают разрабатываться новые лекарственные средства, замедляющие или приостанавливающие прогрессирование патологического процесса при отдельных нозологических формах.
Существенными звеньями или составляющими элементами борьбы с РЗ являются их своевременная диагностика, выяснение этиологии и патогенеза заболеваний, их профилактика и лечение. Многие аспекты этих вопросов окончательно не решены, остаются неясными и, как следствие этого, сохраняется и по сей день запоздалая диагностика этих заболеваний, хронизация их, отсутствие надежной этиопатогенетической терапии, позволяющей в ранние сроки прервать прогрессирование патологического процесса и, тем более, привести к регрессу наступивших патологических органических изменений. Работы в этом направлении не потеряли актуальности.
В отечественной и зарубежной литературе последних лет особый акцент делается на роль иммунологических нарушений в патогенезе этих заболеваний. Для оценки функционального состояния иммунной системы при РЗ был предложен ряд тестов: определение абсолютного и относительного количества ИКК, выявление их мембранных маркеров, исследование продуктов, синтезируемых клетками (цитокины, иммуноглобулины, компоненты системы комплемента), реакция бласттрансформации лимфоцитов.
В последние годы показана взаимосвязь между маркерами активации иммунокомпетентных клеток и уровнем активности внутриклеточных ферментов. Так, при активации лимфоцитов уже через 2 минуты в них нарастает количество Na+-K+ АТФ-азы ( 64 ), через 8 часов меняется уровень 5'нуклеотидазы ( 64 ), через 24-48 часов растет количество дегидрогеназ, например сукцинатдегидрогеназы ( 197 ). Аналогичные изменения выявляются и в клетках фагоцитарного ряда. При активации последних растет активность миелопероксидазы, лейцинаминопептидазы, щелочной фосфодиэстеразы I и снижается уровень 5'нуклеотидазы. Параллельно с этими процессами растет количество DR-антигенов на мембранах макрофагов, происходит выработка интерлейкинов ( 64 ). Показано, что тельца Голла, являющиеся маркерами покоящихся Т-клеток, хорошо идентифицируются при окрашивании на неспецифическую эстеразу, а цитотоксические лимфоциты значительно чаще содержат гранулы кислой фосфатазы (159).
Изучение внутриклеточных энзимов может дать дополнительную информацию о функции иммунокомпетентных клеток при воспалительных РЗ, уточнить отдельные звенья их патогенеза, разработать методы контроля за активностью патологического процесса, конкретизировать механизмы действия лекарственных препаратов, применяемых в ревматологической практике.
Таким образом, выяснение тонких механизмов патогенеза диффузных болезней соединительной ткани на субклеточном уровне и разработка новых методов диагностики этих заболеваний, адекватных способов контроля за обоснованностью и эффективностью терапии путем определения активности ферментов в клетках крови больных РЗ представляется актуальной задачей.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ:
Целью настоящего исследования является повышение качества диагностики, дифференциальной диагностики, уточнение отдельных звеньев
10 патогенеза, объективизация контроля за эффективностью проводимой терапии при воспалительных ревматических заболеваниях путем исследования внутриклеточных ферментов, являющихся маркерами активации иммунокомпетентных клеток.
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:
Изучить уровень активности 5НТ, СДГ, МП, АТФ-азы в лимфоцитах, моноцитах и нейтрофилах периферической крови больных РА, СКВ, ССД, ББ и РеА в зависимости от степени активности и клинического варианта заболевания.
Выявить значение определения активности 5НТ, СДГ, МП, АТФ-азы в лимфоцитах, моноцитах и нейтрофилах периферической крови для дифференциальной диагностики РА, СКВ, ССД, ББ и РеА.
Исследовать динамику активности 5НТ, СДГ, МП, АТФ-азы в лимфоцитах, моноцитах и нейтрофилах периферической крови на фоне лечения больных РЗ и оценить возможность использования этих тестов в качестве показателей эффективности проводимой терапии.
Изучить влияние базисных и противовоспалительных препаратов на активность 5НТ, СДГ, МП, АТФ-азы в лимфоцитах, моноцитах и нейтрофилах периферической крови больных РА и ССД.
Выявить связь между уровнем активности 5НТ, СДГ, МП, АТФ-азы в лимфоцитах, моноцитах и нейтрофилах периферической крови больных РА, СКВ, ССД, ББ и РеА и иммунологическими показателями.
Исследовать взаимосвязь между уровнем активности 5НТ в лимфоцитах, моноцитах и нейтрофилах периферической крови больных РА, СКВ, ССД, ББ и РеА и наличием антител к 5НТ.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ:
Дана комплексная оценка функционального состояния
иммунокомпетентных клеток при наиболее распространенных воспалительных ревматических заболеваниях путем исследования внутриклеточных энзимов. Впервые выявлены специфические особенности метаболизма лимфоцитов, нейтрофилов, моноцитов, что может быть использовано для уточнения этиопатогенеза РЗ и для их дифференциальной диагностики.
Оценена динамика активности ферментов в зависимости от проводимой терапии, впервые выявлено позитивное влияние базисных препаратов
(пеницилламина и делагила) на содержание энзимов в иммунокомпетентных клетках. Показана возможность использования гистохимических показателей для объективизации контроля за эффективностью проводимой терапии.
Продемонстрирована тесная взаимосвязь между интенсивностью метаболизма иммунокомпетентных клеток и иммунологическими показателями. Показано, что одной из причин снижения содержания внутриклеточных энзимов при РЗ может быть образование антител к ферментам.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ
Проведенные исследования показали, что активность внутриклеточных энзимов различна у больных РА, СКВ, ССД, РеА, ББ, что позволяет использовать данные тесты вместе с другими клинико-лабораторными показателями для дифференциальной диагностики этих заболеваний. Положительная динамика активности энзимов в изучаемых клетках крови коррелирует с клиническим улучшением при РЗ. Продемонстрировано положительное влияние активной базисной терапии на функциональное состояние иммунокомпетентных клеток при РА и ССД.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.
Активность внутриклеточных энзимов в клетках крови зависит от активности и тяжести воспалительных ревматических заболеваний.
Определение их активности в клетках периферической крови может использоваться для дифференциальной диагностики и для контроля за эффективностью проводимой терапии. Изменение активности энзимов в клетках крови больных опережает появление аутоантител в крови на 3 недели, что может использоваться для прогнозирования иммунных нарушений при РЗ.
Одной из причин снижения содержания внутриклеточных энзимов при РЗ может быть антителогенез к энзимам.
Наиболее выраженное позитивное влияние на интенсивность обмена веществ в иммунокомпетентных клетках оказывают базисные препараты.
ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ.
Методы определения активности внутриклеточных энзимов внедрены в работу Муниципального медицинского учреждения «Клиническая больница скорой медицинской помощи №25» г.Волгограда. С результатами работы и с
12 возможностями использования гистохимических показателей в диагностике ряда ревматических заболеваний систематически знакомятся практические врачи на курсах усовершенствования, научно-практических конференциях.
ПУБЛИКАЦИИ И АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.
Основные положения диссертации изложены в 50 печатных работах, из которых 8 - в центральной и 8 - в зарубежной печати. Результаты были представлены на симпозиумах EULAR (Женева, Швейцария 1998; Глазго, Шотландия 1999; Ницца, Франция 2000, Прага, Чехия, 2001, Стокгольм, Швеция, 2002, Лиссабон, Португалия, 2003 ), Съезде ревматологов России (Рязань, 2001), Конгрессе ревматологов России (Саратов, 2003), Юбилейной конференции, посвященной 70 летию ассоциации ревматологов России и 40 летию Института Ревматологии РАМН (Москва, 1998), Юбилейной конференции, посвященной 15-летию НИИ клинической и экспериментальной ревматологии РАМН (Волгоград, 2000), ежегодных научных конференциях студентов и молодых ученых Волгоградской медицинской академии (1998 г.-2000г.).
ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ.
Диссертация изложена на 309 страницах машинописного текста и состоит из введения, части I - обзора литературы, представленной 3 главами, в которых изложены обобщенные сведения об иммунопатогенезе РЗ, роли изучаемых иммунокомпетентных клеток в развитии воспаления, дана характеристика изучаемых ферментов, части II - собственных исследований, состоящей из 6 глав, содержащих клиническую характеристику больных, методики исследования, результаты исследований и их обсуждение, выводы и практические рекомендации.
Диссертация иллюстрирована 27 таблицами, 2 рисунками, приведено 7 выписок из историй болезни. Библиографический указатель содержит 829 источников, в том числе 209 отечественных и 620 зарубежных.
Биологическая роль na+,k+-3abhchmoh аденозинтрифосфатазы
Методики 1-й группы, в основном, были разработаны Calckar (1946). Активность 5НТ, выделенной из различных источников и многократно очищенной, определялась спектрофотометрически при длине волны 262.5 нм по изменению экстинкции при превращении 5 -АМФ в аденозин. Методика достаточно проста, но возникают сложности с оптимальной концентрацией субстрата и требуется четко отрегулированная спектрофотометрическая аппаратура. Впервые о наличии 5НТ в сыворотке крови было сообщено в 1954 г. (348).
Методики 2-й группы весьма многочисленны. Активность 5НТ определяется в них по освобождению неорганического фосфора при дефосфорилировании 5 -АМФ, который при взаимодействии с молибдатом аммония дает голубую окраску реагирующей смеси. Это позволяет использовать фотоэлектрокалориметр при длине волны свыше 600 нм. Подобные методики доступны для любой клинической лаборатории (703,806).
Методики 3-й группы основаны на определении свободного аммиака, образующегося при дезаминировании аденозина, для чего требуется введение в инкубационную среду дополнительного фермента - аденозиндезаминазы (253). Эти методики достаточно чувствительны и позволяют определять активность 5НТ в минимальном количестве сыворотки крови (20-50 мкл) с точностью до 0.0005 МЕ/мин, используя фотоэлектрокалориметр с длиной волн 600-630 нм (654). При высокой активности 5НТ в сыворотке крови, когда освобождается много аммиака, эти методики не отличаются особой точностью, и приходится сыворотку разводить физиологическим раствором. Весьма удобны, надежны и точны методики определения активности 5НТ с введением в инкубационную среду 2-х дополнительных ферментов: аденозиндезаминазы и глутаматдегидрогеназы, что позволяет определять ее на спектрофотометре при длине волны 340 нм (233). Существует методика определения активности 5НТ с использованием дополнительных 4-х ферментов: нуклеозидфосфорилазы, КО, каталазы и альдегиддегидрогеназы (437). Несомненно, что ферментные методы точны и надежны, но коммерческая стоимость чистых энзимов не позволяет широко использовать их в клинической практике. Достаточная простота определения 5НТ в сыворотке крови позволила унифицировать методики и использовать с этой целью автоанализаторы (305,713).
Весьма чувствительны и точны хроматографические методы определения активности 5НТ (637). Но они используются чаще всего при исследовании тканевой активности энзима, достаточно трудоемки и дороги для практических лабораторий. В научно-исследовательских целях широко используются методы определения активности 5НТ с использованием радиоизотопов (808), а также метод ядерной магнитно-резонансной спектроскопии (577). Реже используются флуорометрические методы исследования активности энзима, и хотя они очень точны и чувствительны, флуоресцирующие аналоги субстратов дефицитны и дороги (467). Достаточно редко используются иммунологические методы (464). При выборе той или иной методики определения активности необходимо руководствоваться конкретными целями, стоимостью проведения исследований и их количеством, наличием соответствующего оборудования.
Для внутриклеточного определения 5НТ методами световой и электронной микроскопии наибольшее распространение получил метод с использованием солей тяжелых металлов (197).
Наибольшее количество работ по определению активности 5НТ в сыворотке и форменных элементах крови посвящено заболеваниям печени и желчевыводящих путей. У больных с острым вирусным гепатитом в сыворотке крови большинства больных выявлено существенное повышение активности 5НТ (373), хотя при хроническом течении выраженность изменений не была столь очевидной (386). У больных с диффузным поражением печени с и без холестаза, механической желтухой различного генеза также выявлено повышение сывороточной активности 5НТ (103,678). У больных циррозом печени в лимфоцитах крови обнаружено повышение активности энзима, которое коррелировало с уровнем гамма-глобулинов (575). При поражении печени различными ядами (4-х хлористый углерод и др.) результаты исследований активности энзима в сыворотке крови противоречивы (546,579). В клинических и экспериментальных работах при желчекаменной болезни и при перевязке желчного протока выявлено незначительное повышение активности 5НТ в сыворотке крови (672). Противоречивость результатов исследований активности фермента при заболеваниях печени, вероятно, объясняется использованием различных субстратов (нуклеотидов) в применяемых методиках и рН в инкубационных средах. Так, у больных с желчекаменной болезнью при использовании в качестве субстратов уридинмонофосфата и цитидинмонофосфата активность 5НТ в сыворотке крови была несколько выше, чем у здоровых. При использовании ГМФ и ИМФ в 2 раза ниже, а при АМФ и ТМФ - еще в 2 раза ниже. Поэтому к интерпретации показателей энзима при различных заболеваниях надо подходить весьма осторожно (469).
При инфаркте миокарда активность 5НТ в сыворотке крови чаще всего увеличивалась на 4-5 сутки и держалась повышенной еще в течении 5-6 суток, но при обычном течении ИБС активность энзима оставалась на уровне нормы (42). Более раннее повышение активности фермента при инфаркте миокарда (в 1-2 сутки) благоприятно сказывается на течении болезни и даже способствует ограничению размеров инфаркта (499). Подтверждением этому служит и ряд экспериментальных работ (234,582,826).
У больных с раком молочной железы выявлено существенное повышение активности 5НТ в сыворотке крови (15,795), но значительное ее снижение в лимфоцитах крови (15,574). Повышенная активность в сыворотке крови выявлена при раке желчного пузыря (318,529), опухолях печени (405) и сниженная - в тканях при опухоли гортани (353). Пролиферация меланомы сопровождается ростом концентрации 5НТ в клетках (798).
У больных с острой лейкемией в большинстве случаев определялся повышенный уровень активности 5НТ (418,649), причем при общей острой лимфобластной лейкемии активность была выше, чем при Т лимфобластной (598). У больных с хронической лимфобластной лейкемией активность 5НТ снижена в Т-лимфоцитах, но повышена в В-клетках (762,787). Гемолитическая анемия в большинстве случаев сопровождается сниженной активностью в эритроцитах крови, и возможно, что дефицит энзима является непосредственной причиной гемолитической анемии (516,792). Активность 5НТ в сыворотке крови беременных не превышает уровня нормы в первые 2 триместра беременности, немного повышается в 3-м триместре и значительно - при патологии беременности (1,418).
Метод выявления Ма+,К+-зависимой аденозинтрифосфатазы
В работе нами использовался метод с солями свинца по Wachestein.Meisel (104), заключающийся в следующем: Приготовлялась инкубационная среда из следующих компонентов:
Аденозин- или инозин-5 -монофосфат натрия (можно использовать соответствующие кислоты после нейтрализации) в количестве 20 мг растворялся в 20 мл дистиллированной воды. Далее в среду добавлялся трис-малеатный буфер рН 7,2 в количестве 20 мл, 0,2%-ный нитрат свинца (3 мл), 2,5%-ный сульфат магния (5 мл). Далее добавлялась дистиллированная вода в количестве 2 мл.
Смесь хорошо перемешивалась и подогревалась в термостате (37 градусов), затем профильтровывалась. Общий объем реакционной среды составлял 50 мл.
Забор венозной крови проводился с гепарином (1 капля на 10 мл). После инкубирования крови в термостате 37 градусов 45 минут с помощью пипетки отсасывался надосадок лейкоцитов. После центрифугирования 1000 оборотов 5 минут из осадка готовился лейкоконцентрат, из которого делались мазки. Фиксация проводилась в парах 10% формалина 3 минуты. Далее мазки опускались в инкубационную среду на 24 часа при температуре 37С в темноте.
Окончательная обработка была следующей: Инкубационная среда сливалась, мазки споласкивались дважды по 1 мин в дистиллированной воде и помещались в 1 %-ный сульфид натрия на 2 мин. После ополаскивания в дистиллированной воде мазки высушивались на воздухе и микроскопировались.
Места с ферментативной активностью окрашивались в коричневато-черный цвет. Контроль данного метода осуществлялся путем отличия 5 -нуклеотидазы от щелочной фосфомоноэстеразы с помощью параллельного инкубирования материала в среде, в которой аденозин-5 -монофосфат заменили эквимолярным количеством 2-глицерофосфата (8,4 мг) .При этом мест окрашивания в коричневато-черный цвет установлено не было.
Активность 5НТ учитывалась с использованием гистохимического коэффициента, определяемого в соответствии с принципом Астальди (97 ).
Определение активности СДГ в лимфоцитах периферической крови осуществлялось гистохомическим методом (М.М.Нахласа с соавторами в модификации Р.П. Нарциссова). Метод основан на восстановлении солей тетразолия при окислении сукцината в виде водонерастворимого осадка (ярко окрашенных гранул диформазана), по которому можно количественно судить об уровне активности изучаемого фермента (49,97).
Реактивы: 60% раствор ацетона, насыщенный трилоном Б, Vis М фосфатный буфер (рН 7,2), сукцинат натрия, паранитротетразолий фиолетовый, трилон Б, 0,5% раствор метилового зеленого на ацетатном буфере (рН 5,0),
Инкубационная среда (общий обьем - 50 мл): 540 мг сукцината натрия растворяют в 10 мл дистиллированной воды, добавляют 10 мл буферного раствора (реактив 2) и 10 мл раствора паранитротетразолия в дистиллированной воде (1 мг/мл), 13 мг трилона Б и дистиллированной воды до 40 мл. Среда может быть пригодна 1-2 недели при хранении в холодильнике.
Специальное оборудование - термостат или водяная баня, холодильник.
Ход определения. Производился забор венозной крови у доноров и пациентов в обьеме 10 мл. Во избежании свертывания, на каждые 10 мл крови добавлялась 1 капля гепарина (5000 ЕД/мл). Пробирки с исследуемым материалом инкубировались в термостате в течение 45 минут при температуре 37С. Затем извлекалась сыворотка и центрифугировалась в течение 5 минут со скоростью 1000 об/мин. С помощью пипетки отсасывалась надосадочная жидкость, и из полученного осадка лейкоконцентрата осуществлялось изготовление мазков, которые фиксировали ацетоном (реактив №1) при комнатной температуре в течение 30 с. Ополаскивали дистиллированной водой 3-5 с и высушивали. Опускали в инкубационную среду и ставили в термостат на 2 часа. Затем ополаскивали дистиллированной водой 3-5 с. Докрашивали метиловым зеленым 5-10 минут. Промывали в проточной воде 5 с. Дополнительно фиксировали мазки парами формалина в течение 30 минут (для предотвращения растворения формазана нитротетразолия фиолетового в иммерсионном масле).
Мазки рассматривали под микроскопом, производился количественный подсчет гранул диформазана (фиолетового цвета) в 100 лимфоцитах. Активность фермента выражали средним числом гранул продукта реакции в одной клетке.
Для выявления мембранной Ма+,К+-зависимой АТФ-азы был использован гистохимический метод с солями свинца по Вахштейну и Мейзель (1957) (104,21).
Для исследования бралось 10 мл венозной крови, взятой из локтевой вены путем венепункции с добавлением 2 капель гепарина (5 тыс.ед./мл) в качестве антикоагулянта. После центрифугирования в режиме 1500 об./мин. из полученного осадка лейкоконцентрата на обезжиренное предметное стекло был нанесен мазок, который после высушивания в течение 50 минут затем фиксировался в парах 10% формалина в течение 3 минут. После фиксации мазок был помещен в инкубационную смесь следующего состава: аденозинтрифосфат натрия - 60 мг, 0,2М трис-малеатный буфер, рН 7,2 - 20 мл, магний сернокислый - 5 мг, 0,4М раствор нитрата свинца - 0,25 мл, дистилированная вода - до 50 мл.
Приготовление 0,2М трис-малеатного буфера, рН 7,2, выполнялось следующим образом: к 25 мл 0,2М раствора трис-(гидроксиметил)-аминометана добавлялось 45,0 мл 0,1 н. раствора соляной кислоты. Далее путем добавления дистилированной воды объем доводился до 100 мл. Величина рН контролировалась при помощи рН-метрии.
Мазки инкубировались в течение 20 часов в термостате при 37С. После инкубации предметные стекла промывались в трех сменах дистилированной воды, по 1 минуте в каждой. На следующем этапе мазки помещались в 1% раствор сульфида аммония на 2 минуты. Затем вновь промывались дистилированной водой в течение 1 минуты, высушивались. Для окраски ядер препараты погружались на 15 минут в 1% водный раствор метилового зеленого, после чего промывались дистилированной водой в течение 1 минуты и высушивались
Таким образом, выявление мембранной Ма+,К+-зависимой АТФ-азы происходило при помощи двух этапов. На первом этапе происходила реакция ферментативного расщепления АТФ с образованием и осаждением фосфата свинца белого цвета. Для осуществления данной реакции в инкубационную смесь были добавлены ионы Мд2+ в качестве активатора. На втором этапе происходила реакция превращения фосфата свинца в сульфид свинца темно-коричневого цвета, гранулы которого определялись визуально при микроскопировании. Мазок помещался под световой микроскоп (окуляр х15) с использованием иммерсионного объектива с 90-кратным увеличением. Подсчитывался процент клеток, положительных на содержание АТФ-азы, т.е. содержащих на периферии цитоплазмы гранулы темно-коричневого цвета.
Больные системной склеродермией
Активность СДГ в лимфоцитах периферической крови при серопозитивной форме заболевания была достоверно ниже по сравнению с серонегативным вариантом. При быстропрогрессирующем течении было также отмечено снижение активности изучаемого фермента, однако оно не было достоверным. Выявлено достоверное снижение активности СДГ в лимфоцитах при увеличении степени активности патологического процесса (наибольшее снижение уровня СДГ отмечено при III степени активности заболевания, наименьшее - при I степени активности патологического процесса), но достоверность с донорами определена только при II и III степенях. Из приведенных в таблице данных видно, что уровень СДГ достоверно снижался у больных с суставно-висцеральной формой заболевания. При суставной форме РА различия с донорами оказались не достоверными. Исследование зависимости величины активности СДГ от рентгенологической стадии, степени функциональной недостаточности суставов, наличия или отсутствия внесуставных проявлений не выявило достоверных различий. Однако, наблюдалась тенденция к снижению активности СДГ с ростом степени ФНС.
Достоверное увеличение активности АТФ-азы в лимфоцитах и нейтрофилах происходило при III степени активности РА по сравнению с I (р 0,05 и р 0,01 соответственно). Отмечалась достоверная зависимость уровня фермента в лимфоцитах и нейтрофилах от рентгенологической стадии заболевания (р 0,01 и р 0,001 соответственно), активности АТФ-азы в нейтрофилах - от степени ФНС (р 0,001). Кроме того, уровень фермента в нейтрофилах достоверно повышался при быстропрогрессирующем течении заболевания (р 0,01). Подобная тенденция отмечалась и в отношении АТФ-азы лимфоцитов, но она не являлась достоверной. При анализе зависимости уровня активности АТФ-азы от наличия РФ выявлено достоверное повышение активности фермента в нейтрофилах при серопозитивном варианте заболевания по сравнению с серонегативным (р 0,01). Также имела место тенденция к повышению содержания АТФ-азы в лимфоцитах серопозитивных больных по отношению к серонегативным, но она была недостоверной. При наличии системных проявлений РА имел место достоверный рост активности АТФ-азы в лимфоцитах и нейтрофилах по сравнению с суставной формой заболевания (р 0,01 и р 0,05 соответственно). Уровень АТФ-азы в лимфоцитах и нейтрофилах достоверно повышался в случаях поражения скелетной мускулатуры (р 0,001 для лимфоцитов и р 0,01 для нейтрофилов). Кроме того, наблюдалось достоверное увеличение количества АТФ-азы в нейтрофилах при наличии у больных патологии щитовидной железы по типу хронического аутоиммунного тиреоидита (р 0,01).
Активность МП в клетках крови также зависела от клинического варианта РА. Так, наблюдалось достоверное увеличение уровня МП в моноцитах (р=0,023) и снижение его в нейтрофилах (р=0,044) при росте активности заболевания. Отмечалась достоверная зависимость содержания МП в изучаемых клетках от степени ФНС: уровень фермента в нейтрофилах снижался, а в моноцитах повышался с увеличением степени ФНС (р=0,022 и р=0,041 соответственно). Достоверное повышение уровня активности МП в моноцитах отмечено у пациентов, имеющих суставно-висцеральную форму РА (р=0,039). Выявлена тенденция к снижению уровня МП в нейтрофилах и повышение его в моноцитах при быстропрогрессирующем течении (р=0,069 и р=0,087), увеличении рентгенологической стадии (р=0,071 и р=0,11) и снижение его в нейтрофилах при суставно-висцеральной форме РА (р=0,091), но оно не было достоверным. Отмечалась тенденция к снижению активности МП в нейтрофилах и повышению ее в моноцитах серопозитивных по РФ пациентов по сравнению с серонегативными, однако различия не были достоверными (Р 0,05).
Уровень МП в нейтрофилах достоверно снижался при поражении кожи (р=0,032), нервной системы (р=0,017) и хроническом аутоиммунном тиреоидите (р=0,048). Активность МП в моноцитах была значительно выше при анемии (р 0,001). Нам представляется, что обнаруженные гистохимические изменения в моноцитах могут отражать замедление рециркуляции железа, типичное для «анемии хронических заболеваний» (2,81,794). Наблюдалась тенденция повышения уровня МП в моноцитах и снижения его в нейтрофилах у больных с лихорадочным синдромом (р=0,23 и р=0,056 соответственно).
Мы также исследовали корреляционные связи между уровнем ферментов в клетках периферической крови больных РА с одной стороны и показателями, отражающими интенсивность суставного синдрома (индекс Лансбури, суставной счет, индекс припухлости, функциональный индекс Ли, продолжительность утренней скованности и др.) и активность воспалительного процесса (скорость оседания эритроцитов, лейкоцитоз крови и др.) с другой. Полученные результаты представлены в таблице 6.
Наблюдалась достоверная прямая корреляционная зависимость между уровнем активности АТФ-азы в нейтрофилах и величиной суставного индекса, счетом боли и индексом припухлости (во всех случаях р 0,05). Кроме того, активность изучаемого фермента в лимфоцитах и нейтрофилах коррелировала с величиной СОЭ (р 0,05).
Имелась корреляционная связь между уровнем МП в моноцитах и нейтрофилах и некоторыми показателями интенсивности суставного синдрома. Характер связи указывает на то, что с усилением выраженности показателя увеличивается степень отклонения цитохимических показателей от уровня здоровых лиц. Активность МП в моноцитах также коррелировала с количеством эритроцитов крови и лейкоцитозом. Кроме того, была обнаружена достоверная положительная корреляционная связь средней силы (г=0,47, р=0,005) между титром РФ и уровнем МП в моноцитах. Графически полученная зависимость изображена на рисунке 1. Достоверной зависимости уровня фермента в изучаемых клетках крови от пола, возраста пациентов и продолжительности заболевания выявлено не было.
Взаимосвязь между гистохимическими и иммунологическими показателями при РА
История болезни 2218. Больная Г-ко Н.В., 43 года. Находилась на стационарном лечении в ревматологическом отделении ГКБСМП г.Волгограда с 10.11.1997 г. по 11.12.1997 г. Клинический диагноз: ревматоидный артрит с множественным поражением суставов, активность II степени, суставно-висцеральная форма, серопозитивный по ревматоидному фактору, быстропрогрессирующее течение с поражением сердечно-сосудистой системы, печени, аутоиммунная анемия, стадия II, ФНС-2.
При поступлении жалобы на боли в мелких суставах верхних и нижних конечностей, ограничение объема движений в них, утреннюю скованность, выраженную общую слабость, температуру 38-38,5 головокружение, головные боли, чувство скованности на протяжении всего дня, сердцебиение, одышку при физической нагрузке.
Считает себя больной с 1995 г. Обострение - третий раз. Лечилась стационарно. Принимает НПВП, ГКС внутрь. Последнее ухудшение в октябре 1996 г. Аллергических реакции не выявлено. Туберкулез, вен.заболевания отрицает.
При поступлении состояние средней тяжести, сознание ясное. Кожа и видимые слизистые бледной окраски. Увеличения периферических лимфоузлов не выявлено. Межфаланговые, пястно-фаланговые, коленные суставы с явлениями экссудации. Пальпация их болезненна. Движения в суставах ограничены как из-за болей, так и из за отечности.
Суставной индекс -14, индекс Лансбури - 96, индекс общей боли 3, число пораженных суставов - 7, функциональный индекс Ли - 17, счет боли - 21, индекс припухлости -10. В легких дыхание ослабленное везикулярное, хрипов нет. Частота дыхания 16 в минуту. Левая граница относительной сердечной тупости на 1 см кнутри от срединноключичной линии, верхняя - во 2 межреберье, правая - по правому краю грудины. Тоны сердца приглушены, короткий систолический шум на верхушке сердца, не проводящийся в аксиллярную область. Частота сердечных сокращений 92 удара в минуту, ритм правильный. АД 110/70 мм рт.ст. Язык влажный, слегка обложен белым налетом. Живот мягкий, умеренно болезненный в правом подреберье. Размеры печени по Курлову: 10 х 9 х 7 см. Селезенка не пальпируется. Симптом Пастернацкого отрицателен с обеих сторон. Дизурических расстройств не отмечает. На голенях легкая пастозность. Анализы крови при поступлении: эритроциты 2,98 х Ю1 , НЬ 95,0 г/л, цв. показатель 0,96, лейкоциты 3,3 х 10 , СОЭ 61 мм/час. Общий белок 63,5 г/л, общий Ві 22,48 мкмоль/л, тимоловая проба 5,1, АлАТ=0,31. Сахар крови 4,7 ммоль/л. Серомукоиды 0,42 ед. СРВ (++). Фибриноген 3,59 г/л. Тромботест 5 баллов. АНФ (-). Ревматоидный фактор (латекс-тест) 1:16 (норма отрицательная реакция). ЦИК 4,5 ед(норма до 4,0 ед.). IgM = 0,54г/л ( норма 0,8-1,0 г/л ), IgG = 14,5г/л (норма 10-12 г/л), lgA=2,2 г/л (норма 1,8-2,2 г/л). Анализ мочи: уд. вес 1018, реакция кислая, белок не обнаружен. Микроскопия осадка: лейкоциты единичные в поле зрения. ЭКГ: ритм синусовый, 94 в минуту. Отклонение ЭОС влево. Диффузные изменения в миокарде. Рентгенография органов грудной клетки: легкие без очаговых и инфильтративных теней. Корни структурны. Синусы свободные. Талия сердца сглажена за счет 11-ІII дуг слева. Увеличен левый желудочек. Аорта без особенностей. Рентгенография кистей: выраженный околосуставной остеопороз, резкое сужение суставных щелей межфаланговых и пястно-фаланговых суставов, единичные узуры. Признаки II стадии поражения суставов. УЗИ печени и поджелудочной железы: диффузные изменения в паренхиме печени. Активность внутриклеточных энзимов: АТФ-аза лимфоцитов 25%, АТФ-аза нейтрофилов 34%, 5НТ в нейтрофилах 42 ед, лимфоцитах 46 ед, моноцитах 46 ед., СДГ лимфоцитов 20 ед, МП нейтрофилов 196 ед, МП моноцитов 151 ед. Лечение: преднизолон 20 мг/сутки внутрь, вольтарен 200 мг/сутки, курантил, гемодез. Через 3 недели лечения отмечалось некоторое улучшение клинического состояния: уменьшилась продолжительность утренней скованности в суставах 139 до 30 минут, исчезло головокружение, уменьшились головные боли, одышка, сердцебиение, нормализовалась температура. Анализы крови: эритроциты 3,95 х 10п2) НЬ 110,0 г/л, цв. показатель 0,93, лейкоциты 8,0 х 109, СОЭ 10 мм/час. Общий белок 67,3 г/л, общий Ві 14,32 мкмоль/л, тимоловая проба 3,8, АлАТ=0,25. СРБ (+). Фибриноген 3,20 г/л. АНФ(-). Ревматоидный фактор (латекс-тест) 1:2 (норма отрицательно). ЦИК 3,9 ед(норма до 4,0 ед.). IgM = 0,54г/л ( норма 0,8-1,0 г/л ), IgG = 12,85г/л (норма 10-12 г/л), 1дА=1,73 г/л (норма 1,8-2,2 г/л). Суставной индекс - 7, индекс Лансбури - 96, индекс общей боли 2, число пораженных суставов - 7, функциональный индекс Ли - 8, счет боли -14, индекс припухлости - 8. Активность внутриклеточных энзимов: АТФ-аза лимфоцитов 18%, АТФ-аза нейтрофилов 22%, 5НТ в нейтрофилах 61 ед, лимфоцитах 64 ед, моноцитах 62 ед., СДГ лимфоцитов 25 ед, МП нейтрофилов 200 ед, МП моноцитов 142 ед. Данный клинический случай демонстрирует связь между активностью внутриклеточных энзимов больной РА и тяжелой формой заболевания с висцеральными проявлениями, а также нормализацию данных лабораторных показателей на фоне адекватной терапии. Таким образом, проведенные исследования у больных РА показали, что определения энзимов: 5НТ, МП, СДГ, АТФ-аза в клетках периферической крови являются чувствительными показателями активности и тяжести ревматоидного процесса, могут способствовать уточнению степени активности, разграничению форм заболевания, прогнозированию течения и оценке эффективности проводимой терапии. Исследование динамики изучаемых показателей на фоне лечения дало следующие результаты. Средние показатели активности 5НТ в клетках периферической крови у больных РА после лечения составили: в нейтрофилах 70,50±4,29 (до лечения 59,56+6,67), в лимфоцитах 75,77+4,81 (до лечения 56,07+8,01), в моноцитах 69,81+3,89 (до лечения 54,54+6,30, везде динамика достоверна, р 0.05). Повышение активности фермента коррелировало с клиническим улучшением больных.
![Клинико-диагностическое значение исследования активности энзимов гуаниловой ветви пуринового метаболизма у больных анкилозирующим спондилоартритом [Электронный ресурс]](/i/i/4362/184008.png "Клинико-диагностическое значение исследования активности энзимов гуаниловой ветви пуринового метаболизма у больных анкилозирующим спондилоартритом [Электронный ресурс] Кузнецов Владимир Иванович")
![Клинико-патогенетическое значение исследования активности ксантиноксидазы, ксантиндегидрогеназы, пуриннуклеозидфосфорилазы и 5'-нуклеотидазы в лизатах лимфоцитов, эритроцитов и плазме крови больных ревматоидным артритом [Электронный ресурс]](/i/i/4391/194221.png "Клинико-патогенетическое значение исследования активности ксантиноксидазы, ксантиндегидрогеназы, пуриннуклеозидфосфорилазы и 5'-нуклеотидазы в лизатах лимфоцитов, эритроцитов и плазме крови больных ревматоидным артритом [Электронный ресурс] Агафонова Наталья Львовна")
