Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы
1.1. Этиология, патогенез и современное состояние вопроса диагностики некоторых видов гипоксическои смерти у новорожденных и детей грудного возраста 9-26
1.2. Биохимические методы исследования в судебно-медицинской практике 27 - 40
1.3. Обмен углеводов в тканях в условиях физиологического покоя 41-57
1.4. Заключение 58-59
2. Материалы и методы
2.1. Материалы исследования 60-61
2.2. Методы исследования
2.2.1. Определение глюкозы орто-толуидиновым методом 62 - 63
2.2.2. Определение гликогена по методу Kemp, Kitaes van Heijningen (колориметрический микрометод) в модификации Б. Н. Сиднева с использованием данных Т. М. Уткиной, Т. И. Чистовой 64 - 66
2.2.3. Определение молочной кислоты по методу Н.П.Мешковой и С. Е. Северину (колориметрический метод с параоксидифенилом) 67 - 69
2.2.4. Определение активности лактатдегидрогеназы по методу Sevela, Tovarek в модификации Б. Ф. Коровкина 70 - 73
2.2.5. Методы статистической обработки полученных данных 74 - 75
3. Результаты и их обсуждение
3.1. Сравнительный анализ биохимических показателей углеводного обмена в тканях организма новорожденных и детей грудного возраста с биохимическими показателями у взрослых 76 - 83
3.2. Сравнительный анализ биохимических показателей углеводного обмена у новорожденных и детей грудного возраста в норме и при гипоксии 84 -86
3.2.1. Сравнительный анализ показателей содержания гликогена в тканях организма 87-91
3.2.2. Сравнительный анализ показателей активности ЛДГ в тканях организма 92 - 95
3.2.3. Сравнительный анализ показателей содержания молочной кислоты в тканях организма 96 -99
3.2.4. Сравнительный анализ показателей содержания глюкозы в крови 100 -101
3.3. Создание диагностического алгоритма гипоксии, как причины смерти, с использованием биохимических показателей углеводного обмена в тканях организма 102 - 107
4. Выводы 108
5. Практические рекомендации
5.1. Рекомендации по изъятию и хранению тканей внутренних органов 109
5.2. Диагностическое правило выявления гипоксии у новорожденных и детей грудного возраста 110 - 111
6. Приложение 112-115
7. Указатель литературы 116 - 142
- Этиология, патогенез и современное состояние вопроса диагностики некоторых видов гипоксическои смерти у новорожденных и детей грудного возраста
- Обмен углеводов в тканях в условиях физиологического покоя
- Определение активности лактатдегидрогеназы по методу Sevela, Tovarek в модификации Б. Ф. Коровкина
- Создание диагностического алгоритма гипоксии, как причины смерти, с использованием биохимических показателей углеводного обмена в тканях организма
Введение к работе
Актуальность проблемы.
При судебно-медицинском исследовании трупов новорожденных и детей грудного возраста не всегда возможно решить вопрос о причине смерти у секционного стола. В связи с тем, что при различных острых патологических состояниях не успевают развиться характерные морфологические изменения в органах и тканях, а при секционном исследовании определяются только признаки, так называемой, «острой смерти», затруднительна, а порой и совсем невозможна диагностика гипоксии, и в тоже время она является одной из основных причин смерти новорожденных и детей грудного возраста (В.В. Колкутин, Е.Х. Баринов, К.В. Ноздряков, Т.И. Русакова, 2002; Э.К. Цыбулькин, 1999; И.М. Воронцов, ИА. Кельмансон, А.В. Цинзерлинг, 1997; Н.П. Шабалов, В.К. Ярославский, Д.А. Ходов, ВА. Любименко, 1990; В.В. Гаврюшов, К. А Сотникова, 1985; Т.Е. Ивановская, 1976; А.Ф.Тур, 1967; J. S. Wigglesworth, J. W. Keeling, D.I. Rushton, P.J., 1987; IA. Kelmanson, 1994), В таких случаях в диагностике причины смерти могут помочь только лабораторные методы, с помощью которых определяют активность биологических веществ на органно-тканевом, клеточном, субклеточном и молекулярном уровнях. Одним из таких методов является биохимический, неоспоримым его достоинством является то, что он дает точную количественную характеристику явления или процесса и динамику их изменений. Таким образом, в руках специалиста появляется объективная информация, позволяющая приходить к конкретным выводам и объективным решениям.
За последние десятилетия значительно возрос интерес к ранним биохимическим изменениям, возникающим во внутренних органах при гипоксии организма различного генеза у лиц зрелого возраста (Т.М. Уткина, 1969; Л.Г. Александрова, Н.Ш. Нигматулин, 1999; ГА. Ботезату, 1979; АП. Загрядская, АЛ. Шершевский, Б.Н. Сиднее и др., 2001; Ю.С. Исаев, 1995; А.В. Любовицкий, В.Н Коротун, Н.В. Чемурзиева, 1992; ПА. Мачинский, В.К. Цыкалов, Т.Н. Гаваева, 1998). По данным литературы, биохимические показатели новорожденных существенно отличаются от таковых у взрослых (Н.П. Шабалов, В.К. Ярославский, ДА. Ходов, ВА. Любименко, 1990; И.И. Иванов, 1969; И.П. Елизарова).
Анализируя литературные данные, мы пришли к выводу, что наиболее чувствительными реагирующими на нарушение снабжения тканей кислородом биохимическими показателями, являются уровень гликогена, глюкозы, активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и уровень молочная кислота (Ф.И. Комаров, Б.Ф. Коровкин, В.В. Меньшиков, 1981; И.И. Иванов, 1969; Ю.В. Вельтищева, Н.С. Кисляк, 1979; R. Berger, A. Jensen, J. Krieglstein, J.P. Steigelmann, 1991; Marta L. Blumenfelds, Clara R. Krismans, 1985).
Так же анализируя литературные данные, мы пришли к выводу, что опубликованные материалы получены на основании не комплексного изучения, а единичных наблюдений. Так, отсутствуют публикации, посвященные биохимическим изменениям в крови и органах новорожденных и детей грудного возраста при гипоксии. Нами не обнаружены данные об использовании биохимических методов для диагностики ряда патологических состояний новорожденных и детей грудного возраста - внутриутробная асфиксия, родовая травма, некоторые виды перинатальной патологии, механической асфиксии, утопление и т.д. Все вышеперечисленное и побудило нас предпринять в этом направлении специальное исследование.
Цель исследования. Изучение биохимических показателей и выработка биохимических критериев, позволяющих диагностировать гипоксическое состояние организма новорожденных и детей грудного возраста.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
Задачи исследования:
І.Установить количественное содержание гликогена, молочной кислоты, активность общей ЛДГ в печени, сердечной, скелетной мышцах и глюкозы в крови у новорожденных и детей грудного возраста, умерших почти мгновенно от механической травмы («норма») и провести сравнительное исследование этих показателей с такими же у взрослых (по литературным данным).
2.Провести сравнительное исследование активности общей ЛДГ, количества гликогена, глюкозы, молочной кислоты в сердечной, скелетной мышцах, в печени и крови у новорожденных и детей грудного возраста, умерших почти мгновенно от механической травмы («норма» - контрольная группа) и у новорожденных и детей грудного возраста, умерших от гипоксии различного генеза.
3.Оценить диагностическое значение количественного содержания глюкозы в крови, гликогена, молочной кислоты и активности ЛДГ в сердечной, скелетной мышцах и печени при гипоксии новорожденных и детей грудного возраста.
4.Выработать биохимические критерии для диагностики гипоксического состояния организма новорожденных и детей грудного возраста.
Научная новизна.
І.Впервьіе определено количественное содержание показателей углеводного обмена (глюкоза, гликоген, молочная кислота, ЛДГ) в сердечной, скелетной мышцах, печени и крови у новорожденных и детей грудного возраста при гипоксии и при травме («норма»).
2.Выработаны биохимические критерии для диагностики гипоксического состояния организма новорожденных и детей грудного возраста.
Научные положения диссертации, выносимые на защиту:
1.Биохимические показатели крови и тканей печени, миокарда и скелетной мышцы у новорожденных и детей грудного возраста существенно отличаются от таковых у взрослых.
2.У новорожденных и детей грудного возраста биохимические показатели крови и тканей печени, миокарда и скелетной мышцы в норме и при гипоксии отличаются.
3.Отличия в биохимических показателях можно использовать в качестве одного из критериев для диагностики гипоксии у новорожденных и детей грудного возраста в судебно-медицинской практике.
Практическая значимость работы.
Проведенные нами исследования позволяют утверждать, что полученные биохимические показатели можно использовать для диагностики гипоксии у новорожденных и детей грудного возраста.
Установлены различия между показателями углеводного обмена в контрольной («норма») и исследуемой («гипоксия») группах, которые могут быть применены в качестве одного из признаков для диагностики гипоксии у новорожденных и детей грудного возраста в судебно-медицинской практике.
Внедрение результатов исследования.
Результаты нашего исследования внедрены в практику судебно-биохимического отдела Московского областного Бюро судебно-медицинской экспертизы.
Апробация работы.
Официальная апробация работы состоялась на совместной научно-практической конференции сотрудников кафедры судебной медицины ГОУ ВПО РГМУ и сотрудников кафедры судебной медицины РМАПО (сентябрь 2004г.). Основные положения данной диссертации были доложены на XVII Пленуме Всероссийского общества судебных медиков (г. Владимир, сентябрь 2003г.).
Публикации по теме диссертации.
По теме диссертации опубликовано 5 статей, из них 1 в центральной печати.
Объем и структура диссертации.
Этиология, патогенез и современное состояние вопроса диагностики некоторых видов гипоксическои смерти у новорожденных и детей грудного возраста
Судебно-медицинская экспертиза в случаях гипоксической смерти новорожденных и детей грудного возраста является одной из основных проблем судебной медицины. Неожиданная гибель ребенка долгое время не рассматривалась как некое экстраординарное явление, и подобные случаи растворялись в общей массе многочисленных случаев смерти детей раннего возраста от различных заболеваний. Достигнутый к середине прошлого столетия существенный прогресс в снижении младенческой смертности, прежде всего связанной с инфекционными заболеваниями, необычайно повысил интерес к внезапной гибели грудных детей. Оказалось, что подобные случаи не так уж редки и играют значительную роль в общей структуре младенческой смертности [15, 145, 143, 147, 148].
Гипоксия плода является одним из тех состояний, которое часто приводит к мертворождаемости, ранней детской смертности и заболеваемости ребенка в периоде новорожденности. Несмотря на большое количество исследований, патогенез гипоксии плода еще недостаточно изучен и методы ее диагностики несовершенны. Среди причин перинатальной гибели детей асфиксия и гипоксически-травматические поражения мозга, по данным многих авторов, остаются ведущими [24, 36, 82, 94].
Дети, перенесшие в родах асфиксию, но оставшиеся в живых, в дальнейшем часто (по данным А.Ф. Тура, в 20-30%) погибают от ее последствий [108].
При изучении некоторых видов гипоксической смерти новорожденных и детей грудного возраста мало используются биохимические методы. М. И. Райский (1953) писал, что «для сколько-нибудь углубленного понимания смерти и умирания надо знать и «химию смерти», а в этой области наши знания более чем скромны. Мы полагаем, что морфология и физиология только в единстве и неразрывной связи с химией разрешат эту основную проблему биологии» [88].
Интерес исследователей к этой проблеме значительно возрос в последние годы. Так, в Приложении 4 к приказу-постановлению Минздрава РФ и Госкомстата РФ от 4 декабря 1992 г. № 318/190, гипоксические состояния отнесены к «основным патологическим процессам, вызывающим смерть плода и новорожденного».
По данным большинства отечественных авторов асфиксия встречается у 5,0-6,5% общего числа новорожденных [24, 121].
Так что же такое «гипоксия»? В широком смысле этот термин имеет ряд синонимов, таких как, «асфиксия», «аноксия». При этом асфиксия может возникать внутриутробно - асфиксия плода или после рождения - асфиксия новорожденного [8].
Асфиксия новорожденного может наблюдаться при рождении ребенка при нарастании синдрома дыхательного расстройства в первые часы и сутки внеутробной жизни [48]. При этом поражается весь организм с неразрывной патогенетической связью отдельных звеньев патологического процесса, вызванных гипоксией и нарушениями гемодинамики.
Гипоксемия, или снижение парциального давления кислорода в артериальной крови, является следствием дыхательной недостаточности - состояния, при котором усиленная функция аппарата внешнего дыхания не способна поддерживать адекватный газообмен. Острая дыхательная недостаточность возникает при нарушении любого из механизмов, обеспечивающих внешнее дыхание: центральной и периферической регуляции легочной вентиляции, проходимости дыхательных путей, проницаемости альвеоло-капиллярной мембраны, кровообращения в малом круге. Каждый из этих механизмов в большей степени ответственен за какую-либо одну составляющую газообмена [119,144].
Развитие гипоксии является одним из ведущих признаков декомпенсации дыхательной недостаточности (наряду с пшеркапнией), усугубление которых и приводит к развитию ведущих нарушений, таких как смешанный метаболический и дыхательный ацидоз, неврологические расстройства на фоне отека мозга, недостаточность кровообращения. У детей, родившихся в асфиксии, при рождении имеется гораздо более выраженный, чем у здоровых новорожденных, ацидоз, причем он уже носит смешанный - респираторно гемодинамический генез и держится в дальнейшем дольше. Тканевая гипоксия у таких детей сохраняется до конца первой недели жизни. Это подтверждается результатами прямого определения напряжения кислорода в тканях полярографическим способом, показателями окислительно-восстановительного потенциала - редокс-потенциала, а также низкой активностью у них таких ферментов в лимфоцитах, как сукцинатдегидрогеназа и аг-глицерофосфатдегидрогеназа митохондриалытя. У детей, родившихся в асфиксии, в первый день жизни активность процессов перекисного окисления липидов резко повышена, как у новорожденных с острой асфиксией, так и перенесших хроническую гипоксию и родившихся либо без признаков асфиксии или в асфиксии средней тяжести и тяжелой. Если у детей, родившихся в острой асфиксии, активность ключевого фермента антиоксидантной защиты - супероксиддисмутазы в эритроцитах повышена адекватно более высокому уровню конъюгированных диенов, то у детей, развивавшихся внутриутробно в состоянии гипоксии на последних сроках беременности, этого феномена не отмечается. Особенно очевидны эти «ножницы» у детей, родившихся в тяжелой асфиксии. Такие же закономерности отмечают и у недоношенных детей [3, 146]. Низкая активность супероксиддисмутазы - надежный маркер перенесенной гипоксии [121].
Ряд ученых занимался изучением функции внешнего дыхания у детей, находившихся в состоянии асфиксии [3, 121]. Ведущая роль в механизме развития асфиксии отводится нарушениям процессов микроциркуляции, расстройствам центральной и периферической гемодинамики.
Отдельное внимание уделялось изучению состояния сердечнососудистой системы в условиях гипоксии у новорожденных и детей грудного возраста [94, 121]. Так, установлено, что поражения сердечно-сосудистой системы тем чаще и тяжелее, чем тяжелее асфиксия и чем длительнее была гипоксия. Возникновению энергетически-динамической недостаточности сердца у детей, родившихся в асфиксии, способствуют следующие факторы:
1. Долго сохраняющаяся у них тканевая гипоксия.
2. Повышенное сопротивление кровотоку в легких как вследствие спазма артериол под влиянием гиперкатехоламинемии, гипоксии, так и вследствие аспирации.
3. Аспирационная пневмония.
4. Пневмопатии.
5. Изменения объема циркулирующей крови и ее компонентов.
6. Изменение реологических свойств крови - она становится более вязкой и менее текучей.
При асфиксии претерпевают изменения водно-электролитный обмен и функция почек [3, 7, 94]. У детей в асфиксии олигурия по сравнению со здоровыми новорожденными гораздо более выражена. Это объясняется избытком в течение длительного времени адреналина и других катехоламинов и антидиуретического гормона при более низком уровне в крови ренина и секреции альдостерона. В крови из пуповины детей, родившихся в тяжелой асфиксии, отмечались гиперкалиемия (в плазме) и гипокалийгистия (в эритроцитах уровень калия снижен), а также снижение уровня натрия, как в плазме, так и в эритроцитах.
Изучены и описаны следующие транзиторные неонатальные дисфункции желез внутренней секреции у детей в тяжелой асфиксии: острая недостаточность надпочечников, вторичный гипоальдостеронизм, синдром неонатальной неадекватной (избыточной) секреции вазопрессипа и транзиторный неонатальный гипотиреоз (у глубоконедоношенных) [7, 94, 102, 121, 151].
При изучении особенностей гемостаза у детей на фоне гипоксии выявлена роль нарушений функциональной активности тромбоцитов в развитии геморрагических осложнений асфиксии новорожденных [7, 94, 121].
Обмен углеводов в тканях в условиях физиологического покоя
В совокупности всех энергетических процессов организма наиболее заметную роль играют углеводы. Их влияние на общий энергетический баланс почти вдвое превышает таковое для жиров и белков вместе взятых [55].
ГЛЮКОЗА является основным энергетическим субстратом организма. Главный источник глюкозы - сахароза, крахмал, запасы гликогена в печени, а также реакции синтеза из аминокислот, лактата. Концентрация глюкозы в крови является производной активности процессов гликогенеза, гликогенолиза, глюконеогенеза, и гликолиза. Основным гормоном, ответственным за утилизацию глюкозы и регуляцию гомеостаза глюкозы, является инсулин. В регуляции энергетических изменений принимают также участие контринсулярные гормоны: глюкагон, кортизон, адреналин, гормоны роста, тироксин. Под воздействием инсулина концентрация глюкозы в крови понижается, под влиянием остальных гормонов -повышается. Содержание глюкозы практически одинаково в плазме и форменных элементах крови. Содержание глюкозы в артериальной крови несколько выше, чем в венозной, что объясняется непрерывным использованием глюкозы клетками тканей и органов. В тканях наибольшее количество глюкозы и гликогена содержится в печени и скелетных мышцах [87].
ГЛИКОГЕН - полисахарид, являющийся одним из основных биологических субстратов в тканях человека и животных. В настоящее время установлено, что гликоген представляет собой не просто "запасной резерв" углеводов, но и специальную форму их утилизации, принимает участие в регуляции физиологического уровня глюкозы крови, в энергетике мышечного сокращения, выполняет коллоидно-пластическую роль в тканях и антитоксическую функцию в печени.
Все виды гликогена - а они отличаются степенью полимеризации - построены из остатков а-глюкозы. Более 90% остатков глюкозы соединены ое-1, 4 - глюкозидными связями. Оставшиеся 7 - 9% мономеров связаны а-1, 6 - глюкозидными связями, которые легко гидролизуются с образованием глюкозы при нагревании в кислой среде [156].
В тканях гликоген присутствует в двух формах: лабильный (лиогликоген) и стабильный (десмогликоген). Для выделения лиогликогена достаточно действия горячей воды и слабого раствора трнхлоруксуснои кислоты, а десмогликоген прочно связан с белками, и извлекается только после обработки ферментами или щелочами [70, 91, 125, 127, 150, 153].
Принято считать, что лиогликоген является доступным резервом и поэтому подвержен изменениям. Что касается десмогликогена, то, по мнению ряда ученых, он прочно связан с основными структурными элементами клетки и поэтому химически стабилен [162]. Стабильность десмогликогена объясняется наличием ковалентных связей с белками [124]. Некоторые считают десмогликоген таким же, находящимся в непрерывном обновлении, резервом, как и лиогликоген [149, 153].
Фракции гликогена по-разному распределяются в тканях организма. В печени это соотношение выглядит как 85% и 15% соответственно [125].
Гликоген является энергетическим запасом углеводов и одновременно специальной формой их утилизации, он регулирует физиологический уровень глюкозы крови, влияет на энергетику мышечного сокращения, а также участвует в детоксикационной работе печени.
Гликоген является важным энергетическим резервом для миокарда [131]. Как было показано Shelley H.J., это соединение занимает 2% объема кардиомиоцитов у взрослого и около 30% у плода или новорожденного [160]. Хотя в норме содержание гликогена в сердце стабильно, в экстремальных условиях, например, при аноксии - он легко утилизируется под влиянием адреналина, -упоминается в работах ряда авторов [89, 92, 103, 116, 135]. Множеством авторов показано, что доступность гликогена в период гипоксии обеспечивает сердцу защиту от ишемических повреждений [132, 158, 159, 164, 165]. В то же время Doenst Т., Guthrie Р.Н., and Taegtmeyer Н. показали, что высокая концентрация гликогена в миокарде в предишемический период не улучшает сократимость сердца после приступа [133].
Отмечено, что самостоятельно ни адреналин, ни значительная гипоксия (усиленная нагрузка) или голодание не способны вызвать утилизацию сердечного гликогена [135]. Он отвечает за энергетику сердца лишь в случае экстремальной аноксии. Однако позднее рядом ученных было показано, что и адренергическая стимуляция способна вызвать значительное усиление сердечных сокращений. Причем источником энергии для этого является в большей мере гликоген, чем глюкоза или жирные кислоты [134].
Однако, в нормальных условиях сердце получает энергию из других источников, а количество гликогена остается в миокарде постоянным [89].
Сердечный гликоген, как показали исследования, не расходуется даже при зимней спячке животных (байбаков), хотя в это время происходит активная утилизация его в печени и скелетных мышцах [116].
Как показали ряд авторов, даже неблагоприятные условия и расход гликогена не прекращают процессы его синтеза [142].
Синтез и метаболизм гликогена в значительной степени составляют энергетические процессы, необходимые для сокращения сердечной мышцы [66].
Установлено, что гликоген синтезируется из молочной кислоты, которая поступает в кровь из скелетных мышц при физической нагрузке, после чего попадает в печень, где и происходит синтез гликогена [135].
МОЛОЧНАЯ КИСЛОТА является конечным продуктом гликолиза углеводов. Для нее характерна оптическая изомерия -существуют d и 1-формы. В живых организмах наибольшее значение имеет 1-изомер. Эта форма молочной кислоты содержится во всех органах, тканях и физиологических жидкостях.
Сведения о том, что миокард способен утилизировать молочную кислоту, впервые опубликовал Himwich в 1928 году [141]. При стабильной скорости коронарного кровотока ее поглощение происходит с постоянной интенсивностью, однако зависит от состояния вегетативной нервной системы. Как выяснилось позднее, молочная кислота в миокарде не используется для синтеза гликогена, а подвергается дальнейшему окислению. То есть является для сердечной мышцы энергетическим материалом [129, 135, 154].
В сердечной мышце метаболизм молочной кислоты зависит от снабжения миокарда кислородом. При достаточном его количестве происходит полное окисление, а при гипоксии миокард накапливает молочную кислоту. Это количество молочной кислоты называется кислородным долгом, который растет при развитии сердечной недостаточности.
Энергия окисления молочной кислоты необходима миокарду, чтобы в диастолическую фазу восполнить запасы АТФ (аденозинотрифосфорной кислоты), в физиологических условиях этот процесс - окислительное фосфорилирование - восстанавливает энергию для сокращения, не уменьшая запасы гликогена или глюкозы в миокарде.
В норме сыворотка крови содержит 5-20мг% молочной кислоты. Умеренная мышечная работа увеличивает этот показатель в несколько раз, а экстремальные условия - до 100-200 мг% [152]. Высокие концентрации молочной кислоты свидетельствуют о преобладании гликолитического метаболизма углеводов над окислительным.
В фазу аэробного отдыха в мышцах 80% полученной гликолизом кислоты идет на ресинтез гликогена, а 20% окисляется, чтобы обеспечить процесс ресинтеза необходимой энергией.
Среднее содержание гликогена и молочной кислоты в сердце, мышцах и печени у человека и различных лабораторных животных представлены в таблицах №№ 1, 2, 3.
Определение активности лактатдегидрогеназы по методу Sevela, Tovarek в модификации Б. Ф. Коровкина
Лактатдегидрогеназа или лактикодегидрогеназа, дегидрогеназа молочной кислоты, - гликолитический фермент, принимающий участие в последнем этапе гликолиза - превращения пировиноградной кислоты в молочную. При этом направленность реакции в сторону образования пировиноградной кислоты зависит от присутствия в достаточном количестве кофермента никотинамид-адениндинуклеотида /НАД/ в восстановленной /НАД.Н2/ или окисленной /НАД/ формах. Таким образом, лактатдегидрогеназа /ЛДГ/ связывает два пути тканевого обмена глюкозы - гликолиз и окисление, которые направлены на обеспечение организма энергией.
При недостатке кислорода реакция идет по пути гликолиза с образованием из одной молекулы глюкозы двух молекул молочной кислоты и освобождением 47 ккал энергии (в условиях избытка НАД.Н2) При достаточном поступлении кислорода к ткани в присутствии необходимого количества окисленной формы НАД реакция сдвигается в сторону образования пировиноградной кислоты, которая декарбоксилируется и включается в цикл трикарбоновых кислот с выделением 680 ккал энергии - в 15 раз больше, чем при анаэробном превращении глюкозы.
Материал для исследования
1. Кусочки тканей стенки левого и правого желудочков сердца изымаются по средней линии, проходящей между коронарной бороздой и верхушкой сердца.
2. Скелетная мышца изымается из подвздошной мышцы.
3. Печень правой доли около вырезки круглой связки на глубине около 1 см от поверхности, не содержащей крупных и средних размеров желчных протоков.
Ткани изымались не более чем через 24 часа с момента наступления смерти. Тщательно освобождались от соединительной ткани, крови и тканевой жидкости на обеззоленных фильтрах, взвешивались на торсионных весах. Навески в фарфоровых чашечках с кварцевым песком помещались в морозильную камеру для охлаждения, затем растирались до гомогенной массы. Кусочки тканей, взятые из трупа, могут исследоваться сразу, либо после заморозки в морозильной камере бытового холодильника. Концентрация молочной кислоты не меняется в замороженных кусочках тканей до 10 суток.
Принцип метода: L-лактат в щелочной среде в присутствии лактатдегидрогеназы гомогената и добавленного никотинамидадениндинуклеотида /НАД/ окисляется в пируват. Положение равновесия системы сильно сдвинуто влево, то есть в сторону образования оксикислоты. Оно может быть смещено вправо добавлением избытка оксикислоты, что и используется в данной методике определения ЛДГ. По количеству образовавшегося пирувата (содержание которого определяется с помощью 2,4-динитрофенилгидрозина) судят об активности фермента. Разведение гомогената исследуемых тканей - 1:500.
Реактивы: 1) 0,45 М раствор молочнокислого натрия - 5 мл 80%-ной молочной кислоты нейтрализуется 2N раствором едкого натра до слабо щелочной реакции по фенолфталеину (слабо розовая окраска), объем доводится до 100 мл дистиллированной водой; 2) 0,08 М раствор пирофосфорнокислого натрия /рН=8,8/ - 6,69 г растворяется в 50 мл дистиллированной воды, с помощью 1 N раствора соляной кислоты доводят рН до 8,8 и объем дополняют до 500 мл дистиллированной водой; 3) раствор никотинамид-аденин-ди-нуклеотида - 3 мг НАД 80%-ной чистоты растворяется в 1 мл дистиллированной воды; 4) раствор 2,4-динитрофенилгидразина -19,8 мг 2,4-ДНФГ растворяется в 100 мл 1 N раствора соляной кислоты; 5) 0,4N раствор едкого натра; 6) Фосфатный буфер /рН=7,4/ -1,088 г КН2Р04 и 7.480 г Na2P04 растворяется в 500 мл дистиллированной воды.
Ход определения: Навески тканей по 50 мг растирались с кварцевым песком и 5-ю мл фосфатного буфера /рН=7,4/ в охлажденных фарфоровых ступках, переносились в пробирки, центрифугировались 10 минут при 3000 об/мин., надосадочная жидкость использовалась для исследования /разведение 1:500/. В пробирку (опыт) вносили по 0,3 мл раствора НАД и по 0,1 мл разведенного гомогената (1:500), в контроль - только 0,3 мл раствора НАД. В отдельную пробирку наливались растворы пирофосфорнокислого натрия и молочнокислого натрия в соотношении 4:1. Затем все пробирки помещали в термостат на 10 минут при Е= + 37 С. В опытные и контрольные пробирки добавляли по 1 мл смеси (0,8 мл раствора пирофосфорнокислого натрия и 0,2 мл раствора молочнокислого натрия). После инкубации в течение 15 минут в опыт и контроль приливали по 0,5 мл раствора 2,4-ДНФГ, пробирки извлекали из термостата, в контрольную пробу добавляли 0,1 мл разведенного гомогената ткани (1:500). Пробы оставляли при комнатной температуре на 20 минут. Затем в каждую пробирку добавляли по 5 мл 0,4N раствора едкого натра. Через 10-15 минут содержимое пробирок колориметрировалось на КФК-3 против воды, в кювете 10 мм, со светофильтром с максимумом пропускания в 633 нм.
Активность фермента рассчитывалась по формуле: активность ЛДГ = (Ео-Ек)х 1000/0,2 ед/г, где Ео - экстинция опыта, Ек - экстинция контроля, 0,2 - количество ткани, попавшей в пробу, 1000 - пересчет на 1 г ткани.
Создание диагностического алгоритма гипоксии, как причины смерти, с использованием биохимических показателей углеводного обмена в тканях организма
Как следует из результатов, приведенных в таблице 5, каждый из измеренных биохимических показателей крови и тканей имеет характерные особенности распределения в сравниваемых группах по причинам смерти (гипоксия и смерть в результате травмы), однако, ни один из них не может рассматриваться как патогномоничный признак, то есть признак, наличие (или отсутствие) которого указывает на одну из причин смерти со 100% уверенностью.
Поэтому мы попытались оценить информативность всей совокупности измеренных биохимических показателей для дифференциальной диагностики гипоксии, как основной причины смерти ребенка, для чего была использована Байесовская последовательная диагностическая процедура, а также ее вариант -диагностика с использованием весовых диагностических коэффициентов.
Известно, что точность диагностического правила, полученного на обучающей выборке, должна быть оценена (проверена) на контрольной выборке, для чего из общих данных выделяют около 1/3 данных, обучаются на первых 2/3 данных и проверят точность диагностики на выделенной контрольной выборке.
Так как в большом числе медицинских задач зачастую не удается собрать выборку большого объема, а потому нежелательно из небольшой выборки еще выделять часть для контроля, то мы используем для оценки точности диагностики (а по существу для оценки информативности используемого списка признаков для решения поставленной диагностической проблемы), так называемую процедуру «скользящего экзамена». В этом случае последовательно из общей выборки размером (N) удаляется один из «случаев», на оставшейся выборке размером (N-1) строится правило диагностики, которое проверяется на контрольной выборке, содержащей данные одного пациента; полученный результат классификации (правильное или неправильное отнесение пациента к своей или чужой группе по его данным с использованием построенного диагностического правила) запоминается. Далее «случай» «возвращается» в исходную выборку, а на его место уходит другой «случай»; снова повторяется вся процедура диагностики и так до тех пор, пока все «случаи» из выборки не побывают в роли контрольной выборки. Доказано, что суммарный результат такой диагностики приближается к результату проверки правила на контрольной выборке необходимого размера.
Результаты диагностики двух сравниваемых групп детей, умерших по разным причинам (гипоксия или травма), с использованием Байесовской процедуры на скользящем экзамене приведены в таблице 6.
В таблице 6 каждой ячейке приведены результаты диагностики с использованием правила, полученного на собранных данных с использованием Байесовской диагностической процедуры. Из приведенных в таблице результатов диагностики следует, что «случаи» из группы с гипоксией (2-я группа) были «узнаны» (правильно диагностированы) в 100%; умершие из контрольной группы (1-я группа) были «узнаны» (правильно диагностированы) в 94%, а 6% умерших из контрольной группы были диагностированы, как умершие из 2-й группы, то есть умершие в состоянии гипоксии.
Таким образом, пользуясь полученным правилом на списке использованных показателей, мы с погрешностью, составляющей 6% гипердиагностики (2 случая от 32 умерших в контрольной группе), можем отделить (дифференцировать) группу с гипоксией от других причин смерти.
Параллельно с Байесовской диагностической процедурой мы используем диагностические коэффициенты, которые формально получают как десятичный логарифм отношения частот встречаемости отдельных градаций признака в сравниваемых группах, умноженный на 10. Используя диагностические коэффициенты легко организовать табличную диагностику. Для этого создается таблица, в которую заносятся диагностические коэффициенты признаков, оказавшихся информативными для различения (диагностики) сравниваемых групп. Процедура диагностики по такой таблице исключительно проста: для каждого из имеющихся у «случая» признаков отмечается соответствующий диагностический коэффициент в одном из столбцов диагностической таблицы. Каждый столбец соответствует одному из дифференцируемых диагнозов и содержит диагностические коэффициенты. Подсчитывается сумма отмеченных диагностических коэффициентов в каждом из столбцов. Наиболее вероятным считается диагноз, набравший большую сумму баллов.
Полученная высокая точность диагностики позволяет построить решающее правило, точность которого проверена на скользящем экзамене.
В таблице 7 приведены диагностические коэффициенты для дифференциальной диагностики гипоксии, как причины смерти, и травмы («норма» - контрольная группа).
Таким образом, получено диагностическое правило, позволяющее диагностировать гипоксию с высокой точностью: 95% доверительный интервал для точности диагностики 93-100% [17].
